專利名稱：超高多路分析系統(tǒng)和方法
超高多路分析系統(tǒng)和方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求由2008年9月30日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?1/101，555和2009年7 月7日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/223，6 的優(yōu)先權(quán)，該兩份申請(qǐng)的全部內(nèi)容出于所有目的通過引用全文納入本文。關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明不適用。
背景技術(shù)：
在分析系統(tǒng)中，能增加給定系統(tǒng)在任何給定時(shí)間進(jìn)行的分析數(shù)對(duì)于增加此類系統(tǒng)的實(shí)用性和延長其使用期限至關(guān)重要。具體地說，通過增加給定系統(tǒng)的分析多路因子，能提高該系統(tǒng)的總通量，從而提高其可用性，同時(shí)降低使用相關(guān)的成本。在光學(xué)分析中，提高多路性常造成很多困難，因?yàn)榭赡苄枰獜?fù)雜的光學(xué)系統(tǒng)，增強(qiáng)照射或檢測(cè)性能和新型反應(yīng)限制策略。在一些情況下，系統(tǒng)需要將多路性提高數(shù)倍，甚至幾個(gè)數(shù)量級(jí)，如此進(jìn)一步牽涉這些顧慮。類似地，在某些情況中，應(yīng)用此類系統(tǒng)的分析環(huán)境高度敏感，可能不能容忍給定系統(tǒng)中不同分析之間的改變。這些目標(biāo)常與簡單地將系統(tǒng)做得大些和功率強(qiáng)一些的簡單粗暴方法相左，因?yàn)榇祟惒襟E常產(chǎn)生甚至更大的結(jié)果，例如反應(yīng)間串?dāng)_、信號(hào)降低和/或噪聲較高導(dǎo)致的信噪比降低，等等。因此，提供所需分析的多路性實(shí)質(zhì)性提高的分析系統(tǒng)，特別是用于高靈敏度反應(yīng)分析，在許多情況中，做到這點(diǎn)同時(shí)最大程度降低此類多路性增加的負(fù)面影響是理想的。本發(fā)明符合這些和各種其它需求。發(fā)明簡述本發(fā)明提供極高多路分析分析基片上的反應(yīng)區(qū)域的方法、基片和系統(tǒng)，特別是實(shí)施高靈敏度、產(chǎn)信號(hào)低的反應(yīng)，例如單分子熒光反應(yīng)，如用于單分子實(shí)施核酸測(cè)序技術(shù)中的多路系統(tǒng)。本發(fā)明一方面是產(chǎn)生包含微型鏡陣列的基片的方法，其中各微型鏡與零模式波導(dǎo)相連，所述方法包括a)提供具有頂表面的透明基片；b)使該透明基片形成圖案并作蝕刻以形成具有頂部和側(cè)部的突起陣列；c)沉積包覆金屬以使所述突起的頂部包含包覆層；d) 通過該包覆層形成孔隙陣列以使各突起的頂部包含孔隙；和e)沉積反射沉積材料以使各突起的側(cè)部包含反射層；藉此該突起陣列包含微型鏡陣列，而各突起頂部的孔隙包含零模式波導(dǎo)。在一些實(shí)施方式中，使透明基片形成圖案并作蝕刻的步驟b)在沉積包覆材料和形成孔隙陣列的步驟C)和d)之后進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，沉積包覆材料和形成孔隙陣列的步驟c)和d)在使透明基片形成圖案并作蝕刻的步驟b)之后進(jìn)行。在一些實(shí)施方式中，透明基片包括依據(jù)二氧化硅的材料。在一些實(shí)施方式中，透明基片包括熔凝二氧化硅。在一些實(shí)施方式中，包覆材料包括鋁。在一些實(shí)施方式中，反射沉積材料包括鋁。在一些實(shí)施方式中，蝕刻透明基片包括活性離子蝕刻處理過程。在一些實(shí)施方式中，突起包括圓錐形、角錐形或拋物面形。在一些實(shí)施方式中，突起包括截短的圓錐形。在一些實(shí)施方式中，截短圓錐頂部的直徑介于1微米和10微米之間。在一些實(shí)施方式中，基片上的突起數(shù)介于1，000和1，000，000之間。在一些實(shí)施方式中，基片上的突起數(shù)介于 10，000-500，000 之間。本發(fā)明一方面是包括以下步驟的方法a)提供具有頂表面的透明基片，在該頂表面上沉積了具有孔隙陣列的金屬包覆層；b)在該包覆層上沉積第一抗蝕層；c)使該抗蝕層形成圖案以產(chǎn)生剩余抗蝕層的區(qū)域陣列，剩余抗蝕層的各區(qū)域包含含有孔隙的金屬包覆層區(qū)域；d)蝕刻以除去包覆層和透明基片的諸區(qū)域，藉此形成突起陣列，藉此包含金屬包覆層諸區(qū)域的剩余抗蝕層諸區(qū)域位于突起的頂部；e)沉積金屬沉積層，藉此金屬沉積層與突起頂部的金屬包覆層諸區(qū)域接觸；f)沉積第二抗蝕層；g)使該第二抗蝕層形成圖案以露出突起頂部的金屬沉積層諸區(qū)域；和h)處理來自步驟(g)的結(jié)構(gòu)藉此以除去金屬沉積層的露出區(qū)域。本發(fā)明一方面是包括以下步驟的方法a)提供具有頂表面的透明基片，在該頂表面上沉積了具有孔隙陣列的金屬包覆層；b)在該金屬包覆層上沉積保護(hù)涂層；c)在該保護(hù)層上沉積第一抗蝕層；d)使第一抗蝕層形成圖案以產(chǎn)生剩余耐受層的區(qū)域陣列，剩余抗蝕層的各區(qū)域包含含有孔隙的金屬包覆層區(qū)域；e)蝕刻以除去保護(hù)層、包覆層和透明基片的諸區(qū)域，藉此形成突起陣列，藉此包含金屬包覆層諸區(qū)域的剩余抗蝕層諸區(qū)域位于突起的頂部；f)除去第一抗蝕層；g)沉積金屬沉積層，藉此金屬沉積層與突起頂部的金屬包覆層諸區(qū)域接觸；h)沉積第二抗蝕層；i)使該第二抗蝕層形成圖案以露出突起頂部的金屬沉積層諸區(qū)域；和j)處理來自步驟(i)的結(jié)構(gòu)藉此除去金屬沉積層的露出區(qū)域和除去保護(hù)涂層。本發(fā)明一方面是包括以下步驟的方法a)提供具有頂表面的透明基片，在該頂表面上沉積了具有孔隙陣列的金屬包覆層；b)在該金屬包覆層上沉積犧牲層；C)在該犧牲層上沉積第一抗蝕層；d)使第一抗蝕層形成圖案以產(chǎn)生剩余抗蝕層的區(qū)域陣列，剩余抗蝕層的各區(qū)域包含含有孔隙的金屬包覆層區(qū)域；e)蝕刻以除去犧牲層、包覆層和透明基片的諸區(qū)域，藉此形成突起陣列，藉此包含金屬包覆層諸區(qū)域的剩余抗蝕層諸區(qū)域位于突起的頂部；f)除去第一抗蝕層；g)處理該基片以向后拉犧牲層；h)沉積金屬沉積層，藉此金屬沉積層與突起頂部的金屬包覆層諸區(qū)域接觸；i)處理來自步驟(h)的結(jié)構(gòu)以釋放犧牲層，藉此除去犧牲層上金屬沉積層的諸部分并露出孔隙。在一些實(shí)施方式中，犧牲層包含鍺或硅。本發(fā)明一方面是包括以下步驟的方法a)提供具有頂表面的透明基片，在該頂表面上沉積了具有孔隙陣列的金屬包覆層；b)在該金屬包覆層上沉積保護(hù)層；C)在該保護(hù)層上沉積第一抗蝕層；d)使第一抗蝕層形成圖案以產(chǎn)生剩余抗蝕層的區(qū)域陣列，剩余抗蝕層的各區(qū)域包含含有孔隙的金屬包覆層區(qū)域；e)蝕刻以除去保護(hù)層、包覆層和透明基片的諸區(qū)域，藉此形成突起陣列，藉此包含金屬包覆層諸區(qū)域的剩余抗蝕層諸區(qū)域位于突起的頂部；f)除去第一抗蝕層和保護(hù)層；g)在突起的頂部產(chǎn)生支柱陣列，至少部分覆蓋金屬包覆層的諸區(qū)域；h)沉積金屬沉積層，藉此金屬沉積層與突起頂部的金屬包覆層諸區(qū)域接觸； 和i)處理來自步驟(h)的結(jié)構(gòu)以除去支柱陣列，藉此除去金屬沉積層的一部分。本發(fā)明一方面是包括以下步驟的方法a)提供具有頂表面的透明基片；b)在該透明基片上沉積第一抗蝕層；c)使第一抗蝕層形成圖案以產(chǎn)生剩余抗蝕層的區(qū)域陣列；d)蝕刻以除去透明基片的諸區(qū)域，藉此形成突起陣列，藉此剩余抗蝕層諸區(qū)域位于突起的頂部；
10e)除去第一抗蝕層；f)在該透明基片上沉積金屬沉積層；g)在該金屬沉積層上沉積硬涂層；h)打磨該硬涂層的表面以露出對(duì)應(yīng)于突起的頂部的透明基片諸部分；i)沉積金屬包覆層；j)在該金屬包覆層上沉積抗蝕層；和k)使該抗蝕層形成圖案并蝕刻該包覆層以在突起的頂部產(chǎn)生孔隙陣列。本發(fā)明一方面是包括以下步驟的方法a)在透明基片上沉積犧牲層；b)通過選擇性蝕刻該犧牲層產(chǎn)生納米支柱陣列；c)使該透明基片形成圖案并作蝕刻以形成具有頂部和側(cè)部的突起陣列，其中所述納米支柱沉積在突起頂部；d)在步驟c)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)上沉積金屬層；e)在該金屬層上沉積平整化層；f)使該平整化層平整化以露出突起頂部的金屬層并露出納米支柱；和g)處理該基片以除去所述納米支柱，藉此在突起頂部形成孔隙陣列。在一些實(shí)施方式中，所述犧牲層包含鍺或硅。在一些實(shí)施方式中，所述平整化層包含PECVD氧化物或旋涂玻璃。在一些實(shí)施方式中，平整化包括CMP。在一些實(shí)施方式中，金屬層包含鋁。本發(fā)明一方面是包含微型鏡陣列的基片，其中各微型鏡包含零模式波導(dǎo)。本發(fā)明一方面是沉積在具有頂表面和底表面的透明基片的頂表面的零模式波導(dǎo)陣列，其中該透明基片包含微型鏡陣列，其中各微型鏡使得從所述零模式波導(dǎo)射出的離開所述透明基片底表面的光線改變方向。本發(fā)明一方面是微型鏡陣列，其包含a)具有上表面的透明基片，該上表面包含元件陣列，其中所述元件的底部和側(cè)部包含反射涂層；和b)通過該反射涂層延伸的孔隙的陣列，其中各元件的頂部包含至少一個(gè)孔隙，其中陣列壁上的反射涂層使孔隙陣列射出的光線轉(zhuǎn)向。在一些實(shí)施方式中，所述元件包括拋物面形、圓錐形、角錐形、截短的圓錐形。在一些實(shí)施方式中，所述元件包含截短的圓錐。在一些實(shí)施方式中，所述元件包含具有頂部的截短圓錐，所述頂部的直徑介于約0. 5微米-約5微米之間。在一些實(shí)施方式中，所述元件包含具有頂部的截短圓錐，所述頂部的直徑介于約1.5微米-約4微米之間。在一些實(shí)施方式中，所述元件包含具有頂部的截短圓錐，所述頂部的直徑介于約2微米-約3微米之間。 在一些實(shí)施方式中，所述元件包含截短的圓錐，所述圓錐距離垂直的側(cè)壁角度介于5度-40 度之間。在一些實(shí)施方式中，所述元件包含截短的圓錐，所述圓錐距離垂直的側(cè)壁角度介于 10度-30度之間。本發(fā)明一方面是檢測(cè)零模式波導(dǎo)陣列中分子事件的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含a)布置在具有頂表面和底表面的透明基片頂表面上的零模式波導(dǎo)陣列，其中所述透明基片包含使得光線轉(zhuǎn)向所述零模式波導(dǎo)的微型鏡陣列；b)通過所述透明基片的底表面對(duì)所述零模式波導(dǎo)提供照射光束的照射系統(tǒng)；其中將所述系統(tǒng)設(shè)置成所述微型鏡與所述照射光束相互作用從而所述照射光束經(jīng)歷相長干涉，藉此所述零模式波導(dǎo)處的光強(qiáng)度相對(duì)于其它照射區(qū)域增加。本發(fā)明一方面是檢測(cè)零模式波導(dǎo)陣列中分子事件的方法，該方法包括a)提供布置在具有頂表面和底表面的透明基片頂表面上的零模式波導(dǎo)陣列，其中所述透明基片包含使得光線轉(zhuǎn)向所述零模式波導(dǎo)的微型鏡陣列；和b)利用照射光束陣列通過所述透明基片的底表面照射所述零模式波導(dǎo)；其中所述照射光束與所述微型鏡相互作用從而所述照射光束經(jīng)歷相長干涉，藉此所述零模式波導(dǎo)處的光強(qiáng)度相對(duì)于沒有相長干涉的其強(qiáng)度增加。
本發(fā)明一方面是分析單分子特性的方法，包括a)將具有光學(xué)特征的單分子置于零模式波導(dǎo)的孔隙內(nèi)，其中所述零模式波導(dǎo)與微型鏡光學(xué)偶聯(lián)；b)用照射光線照射所述零模式波導(dǎo)；C)用檢測(cè)器收集從所述零模式波導(dǎo)射出的光線，其中所述微型鏡使得射出光線中的至少一些轉(zhuǎn)向所述檢測(cè)器；和d)利用收集到的射出光線測(cè)定所述單分子的特性。在一些實(shí)施方式中，所述零模式波導(dǎo)與微型鏡各自集成入一塊基片。在一些實(shí)施方式中，所述基片包含各自與微型鏡光學(xué)偶聯(lián)的零模式波導(dǎo)的陣列。本發(fā)明一方面是測(cè)定關(guān)于模板核酸分子的序列信息的方法，包括a)將聚合酶、 模板核酸分子和引物置于零模式波導(dǎo)內(nèi)，其中所述零模式波導(dǎo)集成入還包含微型鏡的基片，b)提供用于聚合的核苷酸、試劑和輔因子，其中用于聚合的所述核苷酸、試劑和輔因子可接近聚合酶，其中聚合酶、模板核酸分子、引物或核苷酸中的至少一個(gè)包含光學(xué)標(biāo)記物； c)提供所述聚合酶通過摻入核苷酸來合成延伸核酸鏈的條件；d)用照射光線照射所述零模式波導(dǎo)從而與所述光學(xué)標(biāo)記物相互作用；e)用檢測(cè)器收集從所述零模式波導(dǎo)射出的光線，其中所述微型鏡使得射出光線中的至少一些轉(zhuǎn)向所述檢測(cè)器；和f)利用收集到的射出光線測(cè)定關(guān)于所述模板核苷酸的序列信息。本發(fā)明一方面是用于觀察從基片射出的光線的光學(xué)系統(tǒng)，包括a)其中嵌入了分色元件并具有至少第一面、第二面及第三面的成形光學(xué)模塊；b)布置成將照射光線通過第一面送入所述光學(xué)模塊的照射光學(xué)元件，其中此類照射光線通過第二面反射離開嵌入的分色元件，到達(dá)包含光發(fā)射元件的基片上；和c)布置成收集所述光發(fā)射元件射出的光線的收集光學(xué)元件，其中所述光發(fā)射元件射出的光線經(jīng)過第二面，經(jīng)過所述分色元件離開第三面并進(jìn)入所述收集光學(xué)元件。在一些實(shí)施方式中，照射光經(jīng)內(nèi)部反射離開成形光學(xué)模塊的面，到達(dá)所述分色元件上。在一些實(shí)施方式中，所述光線反射離開第二面。在一些實(shí)施方式中，第一、第二和第三面基本上是平面。在一些實(shí)施方式中，所述光發(fā)射元件包含熒光元件。在一些實(shí)施方式中，所述基片包含反應(yīng)區(qū)域陣列，其中至少一些包含光發(fā)射元件。在一些實(shí)施方式中，所述基片包含ZMW 陣列。在一些實(shí)施方式中，所述照射光學(xué)元件包含至少一個(gè)激光和照射光具組。在一些實(shí)施方式中，所述收集光學(xué)系統(tǒng)包含使得發(fā)射的光線到達(dá)檢測(cè)器的收集光具組。在一些實(shí)施方式中，所述光學(xué)模塊包含折射率介于1. 3和2. 5之間的材料。在一些實(shí)施方式中，光學(xué)模塊包含二氧化硅或氟化鈣。本發(fā)明一方面是光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，包括其上布置了多個(gè)空間上不同的反應(yīng)區(qū)域的基片；安置在反應(yīng)區(qū)域與光學(xué)系統(tǒng)之間的聚焦光學(xué)元件以便至少部分校準(zhǔn)各反應(yīng)區(qū)域的光學(xué)信號(hào)；和光學(xué)系統(tǒng)，其安置成將激發(fā)光線引向布置在所述基片上的多個(gè)不同反應(yīng)區(qū)域并接收這些區(qū)域發(fā)出的光學(xué)信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，聚焦光學(xué)元件集成入或連接于所述基片。在一些實(shí)施方式中，聚焦光學(xué)元件包含集成入基片的多個(gè)反射光學(xué)元件，各反射光學(xué)元件安置成至少部分校準(zhǔn)基片上各個(gè)不同反應(yīng)區(qū)域發(fā)出的光線。在一些實(shí)施方式中，反射光學(xué)元件選自拋物面鏡、圓錐鏡、分段圓錐鏡(staged conical mirror)、截短圓錐鏡、偏拋物面鏡(partial parabolic mirror)、梯形鏡(trapezoidal mirror)禾口角維鏡(pyramidal mirror)。在一些實(shí)施方式中，聚焦光學(xué)元件包含集成入或連接于所述基片的多個(gè)透鏡元件，所述多個(gè)透鏡元件各安置成至少部分校準(zhǔn)所述基片上的各個(gè)不同反應(yīng)區(qū)域的光線。在一些實(shí)施方式中，所述多個(gè)空間上不同的反應(yīng)區(qū)域以每cm2至少100，000個(gè)不同反應(yīng)區(qū)域的密度布置在所述基片的表面。在一些實(shí)施方式中，光學(xué)系統(tǒng)設(shè)置成將激發(fā)光線引向所述基片上至少10，000個(gè)不同反應(yīng)區(qū)域并分別接收這些區(qū)域的光學(xué)信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，所述光學(xué)系統(tǒng)設(shè)置成將激發(fā)光線引向所述基片上至少50，000個(gè)不同反應(yīng)區(qū)域并分別接收這些區(qū)域的光學(xué)信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，所述光學(xué)系統(tǒng)設(shè)置成將激發(fā)光線引向所述基片上至少100,000個(gè)不同反應(yīng)區(qū)域并分別接收這些區(qū)域的光學(xué)信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，所述光學(xué)系統(tǒng)包含安置成收集所述基片上不同反應(yīng)區(qū)域的光學(xué)信號(hào)的物鏡和安置在所述基片和物鏡之間的分色鏡，所述分色鏡能透射來自基片的光信號(hào)并反射激發(fā)光線，從而所述激發(fā)光線基本上不經(jīng)所述物鏡透射。本發(fā)明一方面是分析基片上多個(gè)不同反應(yīng)區(qū)域的方法，包括提供其上具有多個(gè)不同反應(yīng)區(qū)域的基片；提供集成入或連接于所述基片的聚焦光學(xué)元件，所述聚焦光學(xué)元件分別至少部分校準(zhǔn)來自各個(gè)不同反應(yīng)區(qū)域的光學(xué)信號(hào)；照射所述多個(gè)不同的反應(yīng)區(qū)域以產(chǎn)生所述反應(yīng)區(qū)域中的反應(yīng)相關(guān)的光學(xué)信號(hào)；和將所述聚焦光學(xué)元件校準(zhǔn)的光學(xué)信號(hào)透射至檢測(cè)器以檢測(cè)該信號(hào)。本發(fā)明一方面是分析系統(tǒng)，其包括其上布置有多個(gè)空間上分立的反應(yīng)區(qū)域的基片；激發(fā)照射源；光學(xué)檢測(cè)器陣列；光具組，其包括多路照射路徑，而所述路徑含有將激發(fā)照射源的光束轉(zhuǎn)變成多個(gè)照射點(diǎn)的多路光學(xué)元件和交替引導(dǎo)照射點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)多個(gè)信號(hào)源的第一部分和多個(gè)反應(yīng)區(qū)域的至少第二部分的切換光學(xué)元件；和收集從所述多個(gè)反應(yīng)區(qū)域發(fā)出的信號(hào)并將所述信號(hào)引導(dǎo)至所述光學(xué)檢測(cè)器陣列上空間分立位置的信號(hào)收集路徑。本發(fā)明一方面是分析系統(tǒng)，其包括其上布置有多個(gè)空間上分立的反應(yīng)區(qū)域的基片；激發(fā)照射源；光學(xué)檢測(cè)器陣列；光具組，其包括含有多路光學(xué)元件的多路照射路徑，所述多路光學(xué)元件將激發(fā)照射源的光束轉(zhuǎn)變成多個(gè)照射點(diǎn)并引導(dǎo)照射點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)所述多個(gè)反應(yīng)區(qū)域；和收集從所述多個(gè)反應(yīng)區(qū)域發(fā)出的信號(hào)的信號(hào)收集路徑，其中所述信號(hào)收集路徑包含將所述反應(yīng)區(qū)域的第一部分的信號(hào)引導(dǎo)至所述光學(xué)檢測(cè)器陣列上諸位置并將所述反應(yīng)區(qū)域的第二部分的信號(hào)引導(dǎo)至所述檢測(cè)器陣列上空間分立區(qū)域的第二部分的切換光學(xué)元件。本發(fā)明一方面是分析基片上高度多路反應(yīng)區(qū)域的系統(tǒng)，其包括其上布置有多個(gè)分立反應(yīng)區(qū)域的基片；檢測(cè)所述分立區(qū)域相關(guān)的光學(xué)信號(hào)的檢測(cè)系統(tǒng)，其包括至少第一和第二檢測(cè)器；和設(shè)置成將所述基片上第一組分立反應(yīng)區(qū)域相關(guān)的光學(xué)信號(hào)引導(dǎo)至第一檢測(cè)器和將所述基片上第二組分立反應(yīng)區(qū)域相關(guān)的光學(xué)信號(hào)引導(dǎo)至第二檢測(cè)器的光具組。本發(fā)明一方面是分析基片上多個(gè)分立反應(yīng)區(qū)域的感興趣反應(yīng)的方法，包括提供其上布置有第一組反應(yīng)區(qū)域的基片；識(shí)別表現(xiàn)出感興趣反應(yīng)的小于全部第一反應(yīng)區(qū)域的反應(yīng)區(qū)域子組；僅監(jiān)測(cè)該反應(yīng)區(qū)域子組中的該感興趣反應(yīng)。附圖簡述

圖1A-1B示意性顯示了可采用本發(fā)明諸方面實(shí)施的示范性核酸測(cè)序過程。圖2示意性顯示了監(jiān)測(cè)基片上分立的照射反應(yīng)區(qū)域的其它照射方案。圖2A示意性顯示了泛光照射模式。圖2B示意性顯示了照射的掃描方案。圖2C示意性顯示了線形照
13射模式。圖2D示意性顯示了靶向點(diǎn)陣列照射模式。圖3示意性顯示了對(duì)基片上分立的反應(yīng)區(qū)域進(jìn)行共焦多路照射和監(jiān)測(cè)的系統(tǒng)。圖4示意性顯示了與高多路系統(tǒng)相關(guān)的潛在的“串?dāng)_”問題。圖5A、5B和5C示意性顯示了利用成形鏡作為聚焦光學(xué)元件的基片，以便有效地收集來自基片上的反應(yīng)區(qū)域的光線并且有效地照射這些反應(yīng)區(qū)域。圖5C示意性顯示了反應(yīng)區(qū)域延伸到微型鏡中的結(jié)構(gòu)，還顯示了像濾光片這樣的光學(xué)組件被并入到微型鏡結(jié)構(gòu)中。圖6A、6B和6C示意性顯示了 3種備選的圓錐形微反射器(微型鏡)結(jié)構(gòu)。圖7示意性顯示了具有特定尺寸的截短圓錐形微型鏡結(jié)構(gòu)。圖8A-B示意性顯示了可采用平版印刷(lithography)和蝕刻等方法產(chǎn)生的微型鏡結(jié)構(gòu)。圖9示意性顯示了如何通過相長干涉增強(qiáng)照射光密度的微型鏡結(jié)構(gòu)。圖10-18示意性顯示了生產(chǎn)基片的制造過程，這種基片具有集成的聚焦鏡，這些集成的聚焦鏡具有相關(guān)的反應(yīng)區(qū)域。圖19示意性顯示了采用底切方法產(chǎn)生犧牲支柱來產(chǎn)生反應(yīng)區(qū)域的方法。圖20示意性顯示了采用多個(gè)平版印刷和蝕刻步驟在透明基片上形成成形微型鏡結(jié)構(gòu)的方法。圖21示意性顯示了具有反應(yīng)區(qū)域陣列和透鏡陣列的基片，其中所述透鏡使反應(yīng)區(qū)域發(fā)出的光線轉(zhuǎn)向。圖22示意性顯示了利用大視場(chǎng)(FOV)物鏡的照射和檢測(cè)系統(tǒng)，從而能使用多個(gè)中間光學(xué)組件。圖23示意性顯示了基片上的分立區(qū)域的時(shí)分多路照射的過程。圖M示意性顯示了對(duì)基片的分立區(qū)域中的反應(yīng)實(shí)施時(shí)分多路照射和檢測(cè)的系統(tǒng)。圖25示意性顯示了 “檢索活性”多路分析的過程。圖沈示意性顯示了多路照射光具組。圖27A-B示意性顯示了用于本發(fā)明的系統(tǒng)的額外的多路照射路徑。圖28示意性顯示了利用多路檢測(cè)陣列的系統(tǒng)以便用于本發(fā)明的高度多路分析系統(tǒng)。圖29A-B示意性顯示了利用多個(gè)檢測(cè)陣列的備選系統(tǒng)，其中各陣列接收來自各信號(hào)源的信號(hào)組分的子集。圖30示意性顯示了本發(fā)明的成形光學(xué)模塊。圖31顯示了拋物面微反射結(jié)構(gòu)(圖31A)和平面零模式波導(dǎo)(圖31B)的SEM圖像。圖32顯示了對(duì)圓錐形微反射器進(jìn)行建模所使用的尺寸分量。圖33顯示了用于對(duì)分段圓錐形微反射器進(jìn)行建模所使用的尺寸分量。圖34顯示了在熔凝二氧化硅基片中形成的微型鏡頂部的反應(yīng)區(qū)域陣列的SEM圖像。圖35顯示了在其頂部具有反應(yīng)區(qū)域的微型鏡結(jié)構(gòu)的SEM圖像。圖36顯示了在微型鏡結(jié)構(gòu)頂部的反應(yīng)區(qū)域的SEM圖像。
圖37顯示了在熔凝二氧化硅基片中形成的圓錐形微型鏡結(jié)構(gòu)的SEM圖像。圖38顯示了在熔凝二氧化硅基片中形成的圓錐形微型鏡結(jié)構(gòu)的SEM圖像。圖39顯示了在平整化層內(nèi)并在其頂部具有反應(yīng)區(qū)域的微型鏡結(jié)構(gòu)截面的SEM圖像。圖40顯示了在其頂部具有反應(yīng)區(qū)域的微型鏡結(jié)構(gòu)的SEM圖像。圖41示意性顯示了用于檢測(cè)來自微型鏡結(jié)構(gòu)的增益的實(shí)驗(yàn)裝置。圖42顯示了從微型鏡結(jié)構(gòu)上的零模式波導(dǎo)反應(yīng)區(qū)域中獲得的雙色DNA測(cè)序數(shù)據(jù)。發(fā)明詳述I.多路分析系統(tǒng)多路光學(xué)分析系統(tǒng)用于各種不同領(lǐng)域。此類領(lǐng)域可包括分析單分子，包括，例如在進(jìn)行反應(yīng)時(shí)實(shí)時(shí)觀察單個(gè)生物分子。為便于討論，本文根據(jù)優(yōu)選領(lǐng)域討論此類多路系統(tǒng)分析核酸序列信息，特別是單分子核酸序列分析。雖然根據(jù)特定領(lǐng)域作了描述，但應(yīng)理解本發(fā)明系統(tǒng)有更廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。就單分子核酸測(cè)序分析而言，觀察一種固定化核酸合成復(fù)合物以便在各核苷酸摻入延伸的引物序列時(shí)識(shí)別它們，所述復(fù)合物包含聚合酶、要闡明其序列的模板核酸、與模板序列的一部分互補(bǔ)的引物序列。一般在核苷酸摻入之前、期間或之后觀察其上光學(xué)上可檢測(cè)的標(biāo)記物來監(jiān)測(cè)摻入情況。在一些情況中，此類單分子分析采用“一次一堿基方法”，從而一次將一類標(biāo)記的核苷酸引入復(fù)合物并與該復(fù)合物接觸。摻入后，從復(fù)合物上洗去未摻入的核苷酸，檢測(cè)作為固定化復(fù)合物一部分的標(biāo)記摻入核苷酸。在一些情況中，僅僅加入單一類型的核苷酸以檢測(cè)摻入情況。然后這些方法需要通過各種不同類型核苷酸(例如，A、T、G和C)的循環(huán)，從而能測(cè)定模板的序列。由于在任何給定時(shí)間僅有一類核苷酸接觸復(fù)合物，任何摻入事件限定為所接觸核苷酸的摻入事件。 雖然這些方法有一定效果，但通常在模板序列包含多個(gè)重復(fù)的核苷酸時(shí)有問題，因?yàn)榭赡軗饺霟o法與單一摻入事件相區(qū)分的多個(gè)堿基。在一些情況中，對(duì)該問題所提出的解決方案包括調(diào)整核苷酸濃度以確保動(dòng)力學(xué)上有利于單一摻入事件。在其它情況中，同時(shí)加入多類核苷酸，但可通過各類核苷酸上存在的不同光學(xué)標(biāo)記物作出區(qū)分。因此，此類方法可采用單一步驟以識(shí)別序列中給定的堿基。具體地說，將各攜帶可區(qū)分標(biāo)記物的所有4種核苷酸加入固定的復(fù)合物。然后檢測(cè)該復(fù)合物以識(shí)別摻入何類堿基，以及由此的模板序列中下一堿基。在一些情況中，這些方法一次僅監(jiān)測(cè)一種堿基的加入，因此，它們(以及在一些情況中，單一核苷酸接觸方法)需要額外的對(duì)照以避免在任何給定步驟中加入多個(gè)堿基，從而被檢測(cè)系統(tǒng)所遺漏。此類方法通常利用核苷酸上的終止基團(tuán)以防一個(gè)核苷酸摻入后引物的進(jìn)一步延伸。這些終止基團(tuán)通常是可除去的，從而允許檢測(cè)摻入事件后受控的再延伸。類似地，為避免以前摻入的核苷酸的混淆標(biāo)記物，通常將這些核苷酸上的標(biāo)記基團(tuán)設(shè)計(jì)成可除去或可滅活的。在另一方法中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)單分子引物延伸反應(yīng)以識(shí)別延伸產(chǎn)物中核苷酸的持續(xù)摻入，從而闡明潛在的模板序列。在此類單分子實(shí)時(shí)(或SMRT )測(cè)序中，在聚合酶介導(dǎo)的模板依賴性引物延伸反應(yīng)發(fā)生時(shí)監(jiān)測(cè)其中的核苷酸摻入過程。在優(yōu)選的方面，在光學(xué)限定的區(qū)域，例如零模式波導(dǎo)內(nèi)或鄰近透明基片的表面、光學(xué)波導(dǎo)等處提供通常固定的模板/聚合酶引物復(fù)合物(參見，例如美國專利號(hào)6，917，726和7，170，050和公布的美國專利申請(qǐng)?zhí)?007-01341 ，其全部內(nèi)容出于所有目的通過引用納入本文)。用待使用的熒光標(biāo)記核苷酸的合適激發(fā)射線照射光學(xué)限定的區(qū)域。由于復(fù)合物在光學(xué)限定區(qū)域內(nèi)，或具有極小的照射體積，只有緊緊圍繞該復(fù)合物的反應(yīng)體積經(jīng)歷激發(fā)照射。因此，那些，例如在摻入事件期間與復(fù)合物相互作用的熒光標(biāo)記核苷酸在照射體積內(nèi)存在足夠的時(shí)間從而能將它們識(shí)別成摻入的。該測(cè)序方法的示意性描述見圖1。如圖IA所示，在，例如零模式波導(dǎo)106的光學(xué)限定觀察體積(如虛線104所示)內(nèi)提供聚合酶、模板核酸和引物序列的固定復(fù)合物 102。隨著合適的核苷酸類似物，例如核苷酸108摻入新生核酸鏈，對(duì)其照射對(duì)應(yīng)于摻入期間經(jīng)標(biāo)記核苷酸類似物在觀察體積內(nèi)的保留時(shí)間的延長時(shí)間，從而產(chǎn)生與該保留相關(guān)的信號(hào)，例如信號(hào)脈沖112，如圖IB的A曲線所示。一旦摻入，連接于經(jīng)標(biāo)記核苷酸類似物的聚磷酸組分的標(biāo)記物釋放。當(dāng)下一合適的核苷酸類似物，例如核苷酸110接觸復(fù)合物時(shí)，它也摻入，從而在圖IB的T曲線中產(chǎn)生相應(yīng)信號(hào)114。如模板序列的潛在互補(bǔ)性決定的，通過監(jiān)測(cè)堿基摻入新生鏈能獲得模板的序列信息的長延伸段。此外，為獲得廣泛應(yīng)用遺傳序列，例如研究和診斷中所需的序列信息容量，需要較高通量的系統(tǒng)。例如，為增強(qiáng)系統(tǒng)的序列通量，通常監(jiān)測(cè)多個(gè)復(fù)合物，其中各復(fù)合物測(cè)序單獨(dú)的模板序列。在測(cè)序或其它大型DNA組分的基因組測(cè)序的情況中，這些模板通常包含基因組DNA 的重疊片段。通過測(cè)序各片段，可組裝片段的重疊序列數(shù)據(jù)的毗連序列。在優(yōu)選的方面，各種不同復(fù)合物在基片上形成陣列。此類形成陣列的復(fù)合物可在光學(xué)或結(jié)構(gòu)限定的結(jié)構(gòu)，例如零模式波導(dǎo)內(nèi)提供，或者它們可在表面形成圖案?；蛘?，它們可隨機(jī)布置在表面上，但經(jīng)歷靶向陣列照射或檢測(cè)，從而僅監(jiān)測(cè)表面上陣列圖案內(nèi)的復(fù)合物。出于討論的目的，本文將兩種設(shè)置均稱為監(jiān)測(cè)形成陣列的復(fù)合物，或類似名稱。MM以前已采用許多不同的機(jī)制實(shí)現(xiàn)了分立反應(yīng)區(qū)域的多路分析，和甚至同時(shí)多路分析。許多此類方法示于圖2。例如，在簡單的實(shí)施方式中，用覆蓋大量此類分立區(qū)域的寬照射束同時(shí)照射分立反應(yīng)區(qū)域的陣列，其稱為“泛光”照射。其示于圖2A，其中實(shí)線圓圈204 表示布置在基片202上有待監(jiān)測(cè)的反應(yīng)區(qū)或者其它區(qū)域，虛線206顯示了照射區(qū)域的邊界。 如圖所示，單一照射區(qū)域應(yīng)用于大量或可能所有的分立區(qū)域而不作區(qū)分。通過用一種統(tǒng)一的束或斑點(diǎn)照射較大量的反應(yīng)區(qū)域，根據(jù)給定基片上反應(yīng)區(qū)域的密度，此類泛光照射可包括利用常規(guī)激光束或者在一些情況中，可利用束擴(kuò)張光學(xué)元件，以提供所需多路性。雖然能有效照射基片上布置了大量反應(yīng)區(qū)域的廣泛面積，但泛光照射的問題可能在于照射面積的照射強(qiáng)度不一致。具體地說，在給定光束的中心照射強(qiáng)度更大，在邊緣降低。因此，不同反應(yīng)區(qū)域通常根據(jù)它們?cè)谡丈浒唿c(diǎn)中所處位置而經(jīng)歷不同照射。此外，由于照射了對(duì)應(yīng)于斑點(diǎn)的完整基片面積，可能導(dǎo)致所施加射線的使用不充分，例如照射非反應(yīng)區(qū)域的無用光線，因此，要求施加的射線高于所需。此外，此類泛光照射可存在過分照射的不利作用，例如過度能力消耗、發(fā)射激發(fā)光線、基片以及該系統(tǒng)的其它光學(xué)組件的自身熒光、發(fā)熱，等等。在其它方法中，照射束在基片上掃描以便照射該基片上的多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)或區(qū)域， 如圖2B所示。具體地說，如箭頭所示，較小的照射斑點(diǎn)208在基片202的表面反復(fù)運(yùn)動(dòng)以單獨(dú)照射各反應(yīng)區(qū)域，例如區(qū)域204。此類掃描系統(tǒng)通常利用常規(guī)掃描系統(tǒng)，例如檢流計(jì)、旋
16鏡(rotating mirror)或旋棱鏡(rotating prism)以引導(dǎo)光束隨時(shí)間穿過基片表面。雖然此類掃描系統(tǒng)對(duì)于靜態(tài)系統(tǒng)特別有效，例如試圖分析反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)，但它們尤其不可用于隨時(shí)間監(jiān)測(cè)反應(yīng)近程，除非在極慢反應(yīng)的情況中。具體地說，由于照射束對(duì)各位置的檢測(cè)僅是隨機(jī)而短時(shí)的，不能實(shí)時(shí)照射和監(jiān)測(cè)發(fā)生相當(dāng)快速反應(yīng)的反應(yīng)區(qū)域。在其它方法中，采用靶向照射分布優(yōu)先同時(shí)照射多個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)。例如，在一個(gè)靶向照射方法中，線性化照射束以提供能同時(shí)照射基片上多個(gè)分立的共線區(qū)域的照射線 (參見，例如出于所有目的通過引用全文納入本文的國際專利申請(qǐng)?zhí)朥S2007/003570和 US2007/003804)，如圖2C所示。利用多個(gè)光束，或者在線性化之前或之后分裂單一光束，例如使光束通過衍射光柵，能產(chǎn)生多個(gè)平行照射線，例如照射線210，以照射基片上的多行共線反應(yīng)區(qū)域。此類靶向照射由于不照射基片上照射線之間的空間而減少無用照射，因此減少了前述此類過度照射相關(guān)的許多問題。然而，共線反應(yīng)區(qū)域之間的空間，例如給定行內(nèi)的空間仍得到照射，產(chǎn)生了相伴的無用照射和噪聲增加的問題。在進(jìn)一步的改進(jìn)中，靶向照射分布采用形成陣列的照射斑點(diǎn)，例如各照射子集或一個(gè)分立反應(yīng)區(qū)域的照射斑點(diǎn)212，如圖2D所示。如此通過僅照射需要照射的空間，例如反應(yīng)區(qū)域和/或其周圍而進(jìn)一步提高了信噪比，相比于線性照射分布增加了照射效率?？刹捎枚喾N光學(xué)配置產(chǎn)生這些類型的靶向照射分布，包括，例如利用將各照射束聚焦于多個(gè)形成陣列的照射斑點(diǎn)的透鏡陣列，正交定向的衍射光柵，其先將單一光束分成一行多個(gè)光束， 再將這些光束各自分成正交定向的額外光束行，將單一光束轉(zhuǎn)變成各種不同靶向照射分布的衍射光學(xué)元件，包括，例如基片上照射斑點(diǎn)的柵格陣列(參見，例如2008年5月9日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?2/151，979和PCT/US2008/05953，各自出于所有目的通過引用全文納入本文)。此類系統(tǒng)任何還包括光具組內(nèi)的共焦或立體濾光片以進(jìn)一步限制離開系統(tǒng)聚焦平面的反射光線或發(fā)出的熒光的影響，例如與反應(yīng)區(qū)域無關(guān)的。此類系統(tǒng)的一個(gè)例子示于圖3。如圖所示，系統(tǒng)300包括反應(yīng)陣列，例如零模式波導(dǎo)陣列302，其上多個(gè)分立的反應(yīng)區(qū)域形成陣列。在零模式波導(dǎo)陣列的情況中，大量零模式波導(dǎo)通常在基片上形成行列式陣列。給定分析的感興趣反應(yīng)物在各種ZMW內(nèi)提供。例如， 就通過合成測(cè)序核酸而言，給ZMW提供包含模板核酸序列、互補(bǔ)引物序列、核酸聚合酶和引物延伸所需核苷酸或核苷酸類似物的反應(yīng)混合物的測(cè)序復(fù)合物(參見，例如圖1)?？芍圃斐呙芏鹊腪MW陣列，從而提供1000ZMW/cm2到1，000，000ZMW/cm2或更高。因此，在任何給定的時(shí)間，優(yōu)選在單一分析系統(tǒng)或者甚至在單一基片上分析100、1000、3000、5000、10，000、 20，000,50, 000、100，000或1百萬、1千萬或更多個(gè)ZMW或其它反應(yīng)區(qū)域中發(fā)生的反應(yīng)。如圖所示，該系統(tǒng)包括激發(fā)反應(yīng)區(qū)域中的熒光反應(yīng)物的激發(fā)射線源，例如激光 304。光具組306將激光304的激發(fā)射線遞送至ZMW陣列或基片302。光具組還收集陣列上各種ZMW的熒光信號(hào)，將那些信號(hào)傳送至檢測(cè)器，例如EMCXD 330。光具組306包括多路傳輸組件，例如衍射光學(xué)元件(DOE) 308 (也稱為全息照相光學(xué)元件或Η0Ε)，其將單一激發(fā)光束轉(zhuǎn)變成靶向?qū)?yīng)于陣列302上ZMW位置的照射斑點(diǎn)陣列的大量分立的激發(fā)光束。多個(gè)光束是選擇使陣列302的激發(fā)光線通過而反射熒光的分色316。通過分色316之前，照射光束可通過與一對(duì)聚焦透鏡，例如透鏡310和314結(jié)合的共焦濾光片312，從而將這些光束通過一個(gè)或多個(gè)共焦針孔聚焦。通過分色316的激發(fā)光線隨后經(jīng)物鏡318聚焦于陣列302平面上的靶向圖案。然后物鏡318收集陣列302的熒光信號(hào)，使之通過分色316，其朝著檢測(cè)器330反射熒光信號(hào)。然后陣列上分立ZMW的信號(hào)通過立體濾光片，例如共焦掩模332以減少焦平面自身熒光或散射光的背景噪聲，例如光致發(fā)光，其通常仍與一對(duì)聚焦透鏡，例如透鏡320 和324結(jié)合。然后信號(hào)通過差別引導(dǎo)不同光譜特征的光線的分散性光學(xué)元件，例如楔形棱鏡326，從而依據(jù)它們所擊打的檢測(cè)器的位置區(qū)分不同熒光信號(hào)。然后引導(dǎo)差別引導(dǎo)的信號(hào)組分通過額外的聚焦光學(xué)元件，例如聚焦透鏡328，最終擊打到EMCXD檢測(cè)器330上。如上所述，給定信號(hào)入射的檢測(cè)器的位置表明(1)陣列中的起始ZMWdP ( 信號(hào)組分的光譜特征，其用于，例如識(shí)別在延伸反應(yīng)中摻入的熒光標(biāo)記核苷酸類似物的類型。采用前述系統(tǒng)，描述了同時(shí)靶向照射陣列中數(shù)千或數(shù)萬ZMW。然而，隨著多路性需求的增加，陣列上ZMW的密度以及能夠靶向照射此類陣列的難度增加，例如ZMW串?dāng)_(形成陣列的毗鄰ZMW的信號(hào)彼此混雜)、較高水平的密集照射導(dǎo)致信噪比降低等問題增加。II.多路方案雖然以上系統(tǒng)可用于提供足夠多路的光學(xué)系統(tǒng)，但通過對(duì)這些系統(tǒng)作出某些改進(jìn)而進(jìn)一步提高這些系統(tǒng)的多路性能仍是理想的。本發(fā)明提供監(jiān)測(cè)基片上大量形成陣列的復(fù)合物的方法、系統(tǒng)和組件。例如，2008年 5月9日提交的美國專利申請(qǐng)?zhí)?2/151，979和？07舊2008/05953(以前納入本文)描述了采用將靶向照射斑點(diǎn)引導(dǎo)至分立反應(yīng)區(qū)域并收集這些區(qū)域的光學(xué)信號(hào)的多個(gè)光學(xué)元件來分析大量形成陣列的反應(yīng)區(qū)域，例如核酸測(cè)序復(fù)合物的方法。如上所述，這些系統(tǒng)還任選包括共焦掩模，以便增強(qiáng)此類檢測(cè)的信噪比。本發(fā)明的系統(tǒng)通過各種途徑進(jìn)一步增強(qiáng)系統(tǒng)整體的多路性。因此，雖然本發(fā)明系統(tǒng)可用于對(duì)基片上10、100、1000、5000等個(gè)分立反應(yīng)區(qū)域作多路分析，但在特別優(yōu)選的方面，可采用本發(fā)明對(duì)超過5000個(gè)分立反應(yīng)區(qū)域、超過10，000 個(gè)分立反應(yīng)區(qū)域、超過20，000個(gè)分立反應(yīng)區(qū)域、超過50，000個(gè)分立反應(yīng)區(qū)域，甚至超過 100，000個(gè)分立反應(yīng)區(qū)域和最多1，000, 000個(gè)或更多個(gè)分立反應(yīng)區(qū)域作多路分析。除了本發(fā)明系統(tǒng)可分析的絕對(duì)數(shù)量(shear number)反應(yīng)區(qū)域以外，應(yīng)該知道在一些情況中，通過本發(fā)明提供的各種優(yōu)點(diǎn)，此類反應(yīng)區(qū)域的布置密度可以更高以前采用的。例如，可提供分立反應(yīng)區(qū)域并在高密度下觀察而沒有過多干擾或其它問題。此類密度可以是，例如1000、 10，000、100，000、1，000, 000、10，000, 000或更多反應(yīng)區(qū)域/cm2。觀察體積的密度最高可以增加至所用觀察光線的延伸極限，對(duì)于這些應(yīng)用中考慮的某些波長，最低可以到250nm。該間隔最高為16e9時(shí)，每平方厘米的觀察體積體現(xiàn)在正方形陣列中，六角形閉合陣列略多一些。利用近場(chǎng)光學(xué)元件可超出衍射極限，從而導(dǎo)致極限僅由界限的物理大小控制，尺寸最小可以是50nm。在正方形陣列中以IOOnm作分隔，得到每平方厘米IelO的密度。此外，對(duì)于所監(jiān)測(cè)的區(qū)域數(shù)量，此類多路分析基本上是同時(shí)的?！盎旧贤瑫r(shí)”表示在1_5(優(yōu)選1-2)攝像機(jī)幀的時(shí)幀內(nèi)，所需數(shù)量的區(qū)域得到分析。出于本發(fā)明的目的，攝像機(jī)幀通常每1毫秒到約每10毫秒記錄圖像(或者幀率約IOOHz 到約1000Hz)，從而為在基本上同時(shí)分析的范圍內(nèi)，此類多路區(qū)域的分析應(yīng)發(fā)生在約1毫秒到約10毫秒的時(shí)間間隔內(nèi)。因此，提供所需多路分析，例如在1毫秒到約10毫秒的窗口內(nèi)觀察多個(gè)位置至少一次的系統(tǒng)可稱基本上是同時(shí)的，即使該分析在該窗口內(nèi)的兩個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行。在一些情況中，可采用較慢的幀率，這將延長可發(fā)生兩個(gè)事件的時(shí)期，同時(shí)從攝像機(jī)的角度看來仍是基本上同時(shí)的。例如，可采用IOHz到100Hz、10Hz到50Hz、10Hz到20Hz， 例如約15Hz的幀率。應(yīng)該知道，在毫秒范圍發(fā)生的取樣速度可視作基本上同時(shí)的，例如1 毫秒到約500毫秒、10毫秒到約100毫秒等等。A.增強(qiáng)效率光學(xué)元件實(shí)質(zhì)性增加分立反應(yīng)區(qū)域分析中的多路性面臨許多約束條件。例如，在監(jiān)測(cè)單分子反應(yīng)的熒光信號(hào)的系統(tǒng)中，收集光學(xué)元件通常利用視場(chǎng)較小的高數(shù)值孔徑物鏡。因此，增加多路性通常需要更緊密地堆積反應(yīng)區(qū)域以便利用一個(gè)物鏡收集大量那些區(qū)域的信號(hào)。然而，在基片上更緊密地堆積反應(yīng)區(qū)域產(chǎn)生一系列分辨率問題，包括，例如區(qū)域間的串?dāng)_等。光學(xué)串?dāng)_示于圖4。如圖所示，在基片402，例如零模式波導(dǎo)404上提供反應(yīng)區(qū)域陣列(例如404、410和412)。照射那些區(qū)域中發(fā)生的熒光監(jiān)測(cè)反應(yīng)，發(fā)出反應(yīng)相關(guān)的熒光信號(hào)。分別如毗鄰反應(yīng)區(qū)域410和412的實(shí)線箭頭406和虛線箭頭408所示，信號(hào)的全方向發(fā)射分布導(dǎo)致毗鄰區(qū)域的信號(hào)可能彼此干擾，特別是這些區(qū)域在基片上堆積得更緊密時(shí)。這種“串?dāng)_”限制了緊密堆積反應(yīng)區(qū)域以供分析的能力。本發(fā)明的某些方面采用增強(qiáng)的光學(xué)方法來提高信號(hào)收集的效率。一個(gè)此類方法添加聚焦光學(xué)元件，所述元件用于最大程度降低反應(yīng)區(qū)域間的光學(xué)串?dāng)_，還能將具有較大視場(chǎng)的物鏡用于多種領(lǐng)域。降低串?dāng)_可能可改進(jìn)緊密堆積反應(yīng)區(qū)域的能力。同時(shí)，通過移動(dòng)到物鏡的較高視場(chǎng)，可擴(kuò)展布置此類區(qū)域的面積。除了降低串?dāng)_， 通過使光線轉(zhuǎn)向進(jìn)入檢測(cè)器(不轉(zhuǎn)向，檢測(cè)器檢測(cè)不到這些光線)，本發(fā)明的聚焦光學(xué)元件還能增加光線的檢測(cè)量。通過使光線轉(zhuǎn)向，可利用，例如收集與不轉(zhuǎn)向相同量的光線，但數(shù)值孔徑較低的檢測(cè)系統(tǒng)，從而具有較大視場(chǎng)。就本發(fā)明方法而言，具有大視場(chǎng)至關(guān)重要，例如能同時(shí)觀察上萬發(fā)光或發(fā)熒光區(qū)域?；蛘?，通過使光線轉(zhuǎn)向，可采用相同的數(shù)值孔徑，但收集的光線更多。如下文更詳細(xì)描述的，本發(fā)明的聚焦光學(xué)元件還可通過引導(dǎo)照射光線進(jìn)入陣列，例如零模式波導(dǎo)陣列上的反應(yīng)區(qū)域而提高照射水平。微型鏡陣列本發(fā)明一方面提供成形微型鏡陣列，其中每個(gè)微型鏡與光學(xué)約束相關(guān)聯(lián)，尤其是被并入到包含這些光學(xué)約束的同一基片中的成形微型鏡陣列。本發(fā)明的成形微型鏡陣列的例子示于圖5A。如圖所示，總基片502包含布置在其表面上的反應(yīng)區(qū)域陣列，例如零模式波導(dǎo)504-514。將圓錐形或拋物面鏡516-5 集成入底層透明基片528，將它們?cè)O(shè)置成使得到達(dá)和離開陣列中ZMW的進(jìn)入和離去光線轉(zhuǎn)向或聚焦。 具體地說，圓錐形或拋物面鏡通常由反射性材料，例如金屬層，如鋁、銀、金、鉻等構(gòu)成，將其制造成底層基片以提供鏡表面。如圖5B所示，鏡，例如拋物面會(huì)圓錐形鏡使ZMW內(nèi)反應(yīng)的熒光信號(hào)530轉(zhuǎn)向或聚焦，從而提高收集此類信號(hào)的效率。如本文所示，例如，進(jìn)入基片上反應(yīng)區(qū)域的全向發(fā)射光轉(zhuǎn)向，從而更便于檢測(cè)。在一些情況中，如本文所示，光線可以至少部分校準(zhǔn)。此外，對(duì)于各反應(yīng)區(qū)域或ZMW，鏡結(jié)構(gòu)降低或消除基片本身的ZMW間串?dāng)_。除了降低串?dāng)_，還應(yīng)知道使發(fā)射光線轉(zhuǎn)向或聚焦導(dǎo)致收集效率提高之余還提高了系統(tǒng)的靈敏度。類似地，成形光學(xué)元件還用于使進(jìn)入射線，例如光線532聚焦到反應(yīng)區(qū)域，例如ZMW 504-514上。
其它設(shè)置也適用于并入這些圓錐鏡的裝置。例如，可將零模式波導(dǎo)核心區(qū)域延伸入底層基片。該例子示于圖5C，其中反應(yīng)區(qū)域550延伸到包覆層552外并進(jìn)入底層基片 554，從而在一些情況中更有效地轉(zhuǎn)移到達(dá)和來自反應(yīng)區(qū)域550的信號(hào)，這些信號(hào)反射離開鏡556。光學(xué)組件，例如光阻斷區(qū)域或?yàn)V光片組件還可包含在總體結(jié)構(gòu)中，包括，例如掩模 558以進(jìn)一步增強(qiáng)鏡系統(tǒng)的光學(xué)特性。雖然本文所述的鏡稱為“圓錐”或“拋物面”鏡，應(yīng)該知道此類集成的反射聚焦光學(xué)組件的特征在于它們能在基片內(nèi)提供反射組件，以便使反應(yīng)區(qū)域通過基片發(fā)出的光線轉(zhuǎn)向而增強(qiáng)對(duì)光線的檢測(cè)，無論其精確形狀為何。在一些情況中，從反應(yīng)區(qū)域發(fā)出的光線至少部分校準(zhǔn)。因此，本發(fā)明的成形鏡會(huì)使基片上光學(xué)約束部件的光線轉(zhuǎn)向至檢測(cè)器，或至作為光具組一部分的光學(xué)元件，從而將光線從基片引入檢測(cè)器。聚焦鏡可包括除拋物面結(jié)構(gòu)以外的形狀，例如圓錐鏡設(shè)置、分段圓錐鏡設(shè)置、截短圓錐鏡設(shè)置、偏拋物面鏡設(shè)置、梯形鏡設(shè)置和角錐鏡設(shè)置等等，只要此類結(jié)構(gòu)使光線轉(zhuǎn)向，例如以增強(qiáng)檢測(cè)來自或通過反應(yīng)區(qū)域發(fā)出并進(jìn)入基片的光線，例如通過部分校準(zhǔn)。在許多情況中，鏡具有圓筒狀對(duì)稱性。鏡的形狀可以是擬柱體，例如錐體、楔形、棱柱、反棱柱(antiprism)、穹頂形或其平截頭形狀。鏡具有多個(gè)邊，例如其包括錐體或錐體的平截頭形狀時(shí)，鏡可具有任何合適數(shù)量的邊。例如，當(dāng)鏡包含錐體時(shí)，錐體可具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個(gè)或更多個(gè)邊。本發(fā)明的成形鏡通常是微型鏡，S卩，該鏡小，通常具有數(shù)微米到數(shù)十微米數(shù)量級(jí)的尺寸。在一些情況中，術(shù)語微型反射器也用于指微型鏡。鏡的截面尺寸可以是約0.1微米到約100微米、約1微米到約50微米或約2微米到約20微米。雖然本發(fā)明的鏡具有數(shù)微米到數(shù)十微米數(shù)量級(jí)的尺寸，但在一些情況中，本發(fā)明的成形鏡可以更大，例如約100微米到約1毫米或更大。此外，雖然描述的是在基片本身的內(nèi)部提供反射材料，例如金屬層，但應(yīng)該知道可類似地采用其它反射設(shè)置而不用金屬層。例如，結(jié)構(gòu)可由折射率不同的材料構(gòu)成以提供執(zhí)行與本文它處所述金屬層相同功能的反射界面。例如，如果光線的入射角度大于給定值 (臨界角度)，從一種折射率的區(qū)域穿過界面進(jìn)入折射率較低區(qū)域的光線通常完全內(nèi)反射。 采用該方式，可通過調(diào)節(jié)形狀各側(cè)材料的折射率而不用反射層來產(chǎn)生本發(fā)明的反射結(jié)構(gòu)。在一些情況中，本發(fā)明的成形反射結(jié)構(gòu)包含圓錐形反射器。圓錐形反射器方案的效率在理論模型和實(shí)驗(yàn)上相比于非反射器基片表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)性改進(jìn)。在一些情況中，圓錐形結(jié)構(gòu)有用，因?yàn)楸阌谕ㄟ^各種方法形成。例如，可通過控制抗蝕層的幾何結(jié)構(gòu)和平版印刷條件控制各壁的錐度?？赏ㄟ^，例如控制抗蝕層的聚焦/曝光條件來控制抗蝕層的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)或通過灰度平版印刷控制抗蝕層的幾何結(jié)構(gòu)。還可通過控制蝕刻條件，例如控制表面鈍化量或通過灰度蝕刻來控制形狀。本發(fā)明的圓錐形鏡基片通常包含截短的圓錐結(jié)構(gòu)。圓錐形鏡基片的截短圓錐部分的壁可以是直的，或者可包括一定曲率。圖6顯示了三種圓錐形結(jié)構(gòu)的例子。圖6A顯示了圓錐形鏡結(jié)構(gòu)，其中所述鏡的結(jié)構(gòu)是直側(cè)圓錐結(jié)構(gòu)600構(gòu)成的截短圓錐，其布置在反應(yīng)區(qū)域或反應(yīng)區(qū)以下的基片層，例如零模式波導(dǎo)630以使進(jìn)入或離開反應(yīng)區(qū)域的光線轉(zhuǎn)向。圖6B顯示具有下部圓錐部分604和上部圓錐部分606的分段圓錐結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)上布置有反應(yīng)區(qū)域640。在該實(shí)施方式中，下部圓錐部分604具有相對(duì)于基片的垂線呈第一角度的側(cè)壁，上部圓錐部分606具有相對(duì)于基片的垂線呈第二角度的側(cè)壁，其中所述第二角度大于所述第一角度。在一些情況中，上部部分的壁與垂線呈一定角度，所述垂線低于下部部分的垂線。如圖6C所示，圓錐結(jié)構(gòu)可具有下部截短圓錐部分608和上部圓筒部分610，其中壁垂直于基片。該結(jié)構(gòu)上布置有反應(yīng)區(qū)域650。具有圖6C所示概況的結(jié)構(gòu)可用于產(chǎn)生高密度的陣列。例如，具有圓筒形頂部和圓錐形下部的結(jié)構(gòu)的底層尺寸通常小于具有相同側(cè)壁角度的簡單截短圓錐結(jié)構(gòu)。在一些情況中，如果結(jié)構(gòu)具有較小的底層尺寸，可將更多結(jié)構(gòu)堆積入給定區(qū)域。圖6所示反射結(jié)構(gòu)顯示從底層透明層伸出。該底層透明層可以是平面基片，例如其表面布置有突起的熔凝二氧化硅晶片。圖6所示結(jié)構(gòu)通常在毗鄰該結(jié)構(gòu)的壁處具有反射涂層或反射區(qū)域以增強(qiáng)光的內(nèi)部反射?？赏ㄟ^，例如給突起涂布反射層，用反射材料填充突起之間的區(qū)域或在突起外利用較低折射率的介質(zhì)而為成形基片提供反射表面以促進(jìn)內(nèi)部反射。雖然圖6顯示反應(yīng)區(qū)域在圓錐形結(jié)構(gòu)頂部的中心，在一些情況中，反應(yīng)區(qū)域可以不直接位于中心。制造耐受(層)可導(dǎo)致反應(yīng)區(qū)域離開中心位置。此外，在一些情況中，可將反應(yīng)區(qū)域制造成離開中心以便，例如經(jīng)歷較高水平的照射，或者，例如照射或檢測(cè)光學(xué)元件布置成與特定反應(yīng)區(qū)域的垂線有一定角度?？扇缟鲜鯶MW陣列所述，制造高密度的微型鏡陣列。反應(yīng)區(qū)域相關(guān)的微型鏡密度可以是，例如1000ZMW/cm2到1，000, 000ZMW/cm2或更高。在任何給定時(shí)間，利用本文所述微型鏡陣列分析一個(gè)分析系統(tǒng)內(nèi)或者甚至在一個(gè)基片上的100、1000、3000、5000、10，000、 20，000,50, 000、100，000或1百萬、1千萬或更多ZMW或其它反應(yīng)區(qū)域中發(fā)生的反應(yīng)是理想的。圖7顯示本發(fā)明微型鏡的圓錐結(jié)構(gòu)。圖7所示截短的圓錐結(jié)構(gòu)由透明基片上延伸的突起構(gòu)成。截短的圓錐可以是圓筒形對(duì)稱的，具有基本上環(huán)形的頂表面，直徑為A，基本上環(huán)形的底層，直徑為C，半高徑為D。截短圓錐具有高度B。截短圓錐的壁基本上是直的，相對(duì)于表面的垂線呈角度Θ。本文所示截短圓錐結(jié)構(gòu)的側(cè)壁基本上是直的，但諸壁可以不是很直，而仍能如本文所述起到使光線強(qiáng)度轉(zhuǎn)向的作用。在一些情況中，產(chǎn)生圓錐結(jié)構(gòu)的方法會(huì)導(dǎo)致不是很直的壁，例如具有彎曲形狀。在其它情況中，包括不是很直的壁可提高收集效率。在許多情況中，產(chǎn)生突起的方法會(huì)產(chǎn)生帶有隆起、嵴的表面或在不太直的側(cè)壁產(chǎn)生其它瑕疵。在一些情況中，直的形狀對(duì)于增加基片上反應(yīng)區(qū)域的密度是理想的。例如，彎曲的壁， 例如拋物面的底層直徑可大于直側(cè)壁的圓錐。在一些情況下，利用底層直徑較小的結(jié)構(gòu)，可獲得較高的堆積密度。具有圖7所示形狀的本發(fā)明示范性圓錐結(jié)構(gòu)的頂直徑介于約0. 1微米到100微米之間，例如介于1微米到20微米之間或介于2微米到10微米之間。在一些情況中，截短圓錐頂部的直徑A介于約1微米到約5微米之間。在一些情況中，所述直徑介于2微米到4微米之間。本發(fā)明的示范性圓錐結(jié)構(gòu)的側(cè)壁角度(Θ)介于約2°到45°、約5°到35°、約 10°到30°或約14°到約之間。制造圓錐結(jié)構(gòu)以使，例如圓錐結(jié)構(gòu)頂部中心的反應(yīng)區(qū)域發(fā)出的光線轉(zhuǎn)向。示范性結(jié)構(gòu)至少使反應(yīng)區(qū)域發(fā)出的光線轉(zhuǎn)向進(jìn)入與垂線呈約22. 5°角度的圓錐結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的示范性實(shí)施方式中，圓錐結(jié)構(gòu)B的高度介于約0.2微米到約100 微米、約1微米到約10微米、約2微米到約8微米或約3微米到約6微米之間。在一些情況中，優(yōu)選控制截短圓錐的高度與底層直徑之比(B/C)。在示范性實(shí)施方式中，B C的比例介于約1 3到3 1、約1 2到約2 1、約1.5 1到約1 1. 5或約1. 2 1到約1 1.2。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解Α、θ和B的選擇會(huì)決定底層的寬度C。如上所述，為
21提高本發(fā)明光學(xué)結(jié)構(gòu)的密度，優(yōu)選控制參數(shù)以使底層的寬度C足夠小從而能提高密度。底層C的直徑可以介于約0. 2微米到約100微米、約1微米到約10微米、約2微米到約8微米或約3微米到約6微米。本發(fā)明的示范性圓錐結(jié)構(gòu)的頂直徑A介于約1微米到約5微米之間，高度B介于約2微米到約8微米之間，側(cè)壁角度介于約10°到約30°之間。本發(fā)明的示范性圓錐結(jié)構(gòu)在該圓錐頂部布置有反應(yīng)區(qū)域，通常大致在該頂部的中心。反應(yīng)區(qū)域可以是，例如零模式波導(dǎo)，其包含通過圓錐結(jié)構(gòu)頂表面上的反射包覆層布置的孔隙。此類孔徑直徑為約30nm到約 300nmo圖8㈧和8(B)顯示本發(fā)明成形鏡的兩個(gè)示范性結(jié)構(gòu)。例如，可通過為微型制造 (包括半導(dǎo)體加工)和為產(chǎn)生MEMS裝置開發(fā)的方法，例如照相平板印刷術(shù)和蝕刻的那些方法產(chǎn)生這些結(jié)構(gòu)。圖8(A)顯示具有頂表面的透明基片800，在該表面上布置有其側(cè)壁上具有反射涂層830的突起850陣列。突起850是成形微型鏡，其使照射光線轉(zhuǎn)向進(jìn)入反應(yīng)區(qū)域840和/或使反應(yīng)的發(fā)出光線轉(zhuǎn)向進(jìn)入布置在透明基片800的底表面880以下的檢測(cè)光學(xué)裝置。反應(yīng)區(qū)域840是，例如零模式波導(dǎo)，其由通過布置在微型鏡結(jié)構(gòu)頂部的包覆層820 延伸的納米級(jí)孔徑構(gòu)成。在一些情況中，反應(yīng)區(qū)域840延伸入該透明基片。反射層830布置在微型鏡的外壁以增強(qiáng)該壁的反射率。在一些情況中，包覆層820和反射層830可以是相同的材料，例如鋁。透明表面以上的區(qū)域810可包含含有樣品和/或反應(yīng)物的液體介質(zhì)， 而這些樣品和/或反應(yīng)物可擴(kuò)散進(jìn)或出反應(yīng)區(qū)域。在一些情況中，陣列中的所有反應(yīng)區(qū)域與區(qū)域810中的同一溶液接觸。在一些情況中，反應(yīng)區(qū)域之間包含屏障以減少或阻止反應(yīng)區(qū)域之間的擴(kuò)散。圖8 (B)顯示本發(fā)明成形鏡的備選結(jié)構(gòu)。圖8 (B)顯示透明基片802包含突起852， 但平整化層862致使總的基片基本上是平的。反應(yīng)區(qū)域842布置在突起852的頂部，例如作為通過包覆層822的孔徑?？蓪⒎瓷鋵?32布置在突起852上以改進(jìn)反射率。在一些情況中，不用反射層832，例如平整化層862包含反射材料時(shí)。平整化層可包含硬質(zhì)材料，例如無機(jī)材料，如旋涂玻璃或氮化硅。平整化層可包含金屬材料，例如鋁。平整化層可以是軟質(zhì)材料，例如聚合材料，如有機(jī)聚合物，如聚酰亞胺或硅氧烷聚合物?？蓪悠泛驮噭┮敕磻?yīng)區(qū)域842，例如經(jīng)由基片812之上的液體介質(zhì)。透明基片可包含無機(jī)材料、有機(jī)材料或同時(shí)含有機(jī)和無機(jī)材料的復(fù)合材料。透明材料通常是可在觀察期間將反應(yīng)區(qū)域維持于固定位置的剛性材料?；诙趸璧牟牧希?例如熔凝二氧化硅是優(yōu)選材料，例如采用半導(dǎo)體或MEMS加工方法產(chǎn)生微型鏡陣列時(shí)。透明基片還可包含無機(jī)氧化物材料和玻璃。透明基片材料可以是非均相材料，例如具有多層的材料。例如，在一些情況中，透明基片可包含介電棧。還可利用透明聚合材料。透明材料通常優(yōu)選表現(xiàn)出低水平的自身熒光。合適的透明聚合物包括，例如甲基丙烯酸酯聚合物，如 PMMA,聚碳酸酯，環(huán)狀烯烴聚合物，苯乙烯聚合物，含氟聚合物，聚酯，聚醚酮，聚醚砜、聚酰亞胺或它們的混合物。透明層中突起外側(cè)的反射層可包含金屬材料，例如鋁、銅、金、銀、鉻或它們的混合物。反射層還可包含反射有機(jī)聚合物，例如在聚合材料中包含反射顆粒的復(fù)合材料。包覆層是不透明或反射材料。包覆層可以是金屬，例如鋁、銅、金、銀、鉻、鈦或它們的混合物。在一些實(shí)施方式中，反射層和包覆層包含相同的材料。
相比于不用鏡結(jié)構(gòu)獲得的收集效率，本發(fā)明的微型鏡可提高從基片反應(yīng)區(qū)域收集光線的效率。光學(xué)系統(tǒng)的收集效率通常受收集系統(tǒng)的數(shù)值孔徑的影響。相比于不用微型鏡收集的光量，本發(fā)明的微型鏡可將具有給定數(shù)值孔徑，例如數(shù)值孔徑為0. 5的檢測(cè)系統(tǒng)收集的光量提高大于約10%、20%、30%、40%、50%、75%、90%、2倍、3倍、5倍、10倍或更高。 檢測(cè)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑可以是，例如0. 1-0. 9。在一些情況中，數(shù)值孔徑介于約0. 2-0. 5之間。微型鏡結(jié)構(gòu)還可提高照射源對(duì)反應(yīng)區(qū)域的照射水平。例如，相比于不用微型鏡的照射水平，照射水平可提高大于約20 %、30 %、40 %、50 %、75 %、90 %、2倍、3倍、5倍、10倍或更高。在本發(fā)明的一方面，將鏡結(jié)構(gòu)制造成照射光線經(jīng)歷相長干涉，從而增強(qiáng)反應(yīng)區(qū)域的光強(qiáng)度。光線可經(jīng)歷干涉，所述干涉是加入或疊加兩個(gè)或更多個(gè)光波，從而產(chǎn)生新的波型。例如，彼此相關(guān)或相干的波可發(fā)生干涉，例如由于它們來自同一來源或由于它們具有相同或幾乎相同的頻率。例如，對(duì)于本發(fā)明的鏡結(jié)構(gòu)，可使入射光線從該結(jié)構(gòu)的側(cè)壁轉(zhuǎn)向，從而自側(cè)壁的不同部分轉(zhuǎn)向的光線在鏡空間內(nèi)相互作用以結(jié)構(gòu)性或破壞性干涉。由于轉(zhuǎn)向的光線來自同一來源，光線的各轉(zhuǎn)向部分易具有基本上相同的頻率。給定區(qū)域的光線是否經(jīng)歷結(jié)構(gòu)或破壞性干涉取決于該光線是同相(結(jié)構(gòu)性)還是異相(破壞性)。通過控制微型鏡結(jié)構(gòu)的幾何特征和照射光線的特性，可控制結(jié)構(gòu)或破壞性干涉的區(qū)域?？衫秒姶沤９ぞ撸缬邢薏町悤r(shí)域(FDTD)或有限元方法(FEM)，通過輸入鏡結(jié)構(gòu)和照射光線參數(shù)測(cè)定相長干涉的區(qū)域。我們測(cè)定到，對(duì)于頂直徑與束流直徑相似的圓錐結(jié)構(gòu)，局部化區(qū)域，例如反應(yīng)區(qū)域的領(lǐng)域相比于沒有相長干涉可增加10倍數(shù)量級(jí)強(qiáng)度。在一些情況中，高強(qiáng)度的局部化區(qū)域的尺寸可以是約0.25到約1波長。為增強(qiáng)照射， 束流直徑優(yōu)選具有與微型鏡相同的尺寸。在一些情況中，鏡結(jié)構(gòu)具有頂部表面，例如是具有平的頂表面的截短圓錐，頂表面具有一定直徑。在此類情況中，頂表面與這些系統(tǒng)的入射光線的束流直徑之比是約1 5到約5 1、約1 3到約1 3、約1 2到約2 1或約 1 1. 5 到約 1. 5 1。圖9顯示用校準(zhǔn)光線照射的微型鏡結(jié)構(gòu)。圖中微型鏡結(jié)構(gòu)內(nèi)的不同陰影代表了不同光強(qiáng)度。該圖顯示了接近微型鏡頂部的數(shù)個(gè)高強(qiáng)度區(qū)域，其中一個(gè)高強(qiáng)度區(qū)域發(fā)生在位于鏡結(jié)構(gòu)頂部中心的反應(yīng)區(qū)域。通過甲肝鈉微型鏡結(jié)構(gòu)構(gòu)建成相長干涉發(fā)生在反應(yīng)區(qū)域，相比于沒有微型鏡存在時(shí)，可增強(qiáng)反應(yīng)區(qū)域的光強(qiáng)度。與沒有微型鏡結(jié)構(gòu)的相同照射光線的強(qiáng)度相比，可采用相長干涉將反應(yīng)區(qū)域的光強(qiáng)度增強(qiáng)大于約30%、40%、50(%、75(%、2 倍、3倍、5倍、10倍、15倍、20倍、30倍或超過30倍。制造微型鏡陣列可通過各種方法制造本發(fā)明的微型鏡陣列。制造陣列的一方面是在透明基片上制造結(jié)構(gòu)，例如突起的陣列。可通過模塑、沖壓、壓花、機(jī)械加工、蝕刻或其它合適的方法制造結(jié)構(gòu)陣列。制造本發(fā)明微鏡陣列的一種優(yōu)選方法涉及采用微型制造方法，例如半導(dǎo)體或MEMS 加工方法，該方法已高度開發(fā)用于制造，例如集成電路。已采用類似方法制造用于各種領(lǐng)域的MEMS (微型機(jī)電系統(tǒng))，包括噴墨打印機(jī)、加速計(jì)、壓強(qiáng)傳感器和顯示器(例如，數(shù)字微型鏡顯示器(DMD))。可將微型制造方法應(yīng)用于大基片，例如晶片，隨后在許多裝置中切成小片，從而一次制造許多裝置。本發(fā)明一方面是采用這些方法在透明晶片，例如玻璃，如熔凝二氧化硅中制造微型鏡陣列。本發(fā)明的方法適用于抗蝕加工，例如光致抗蝕劑以限定透明基片或其它層上的結(jié)構(gòu)元件。采用蝕刻加工制造包含反應(yīng)區(qū)域和微型鏡結(jié)構(gòu)的三維結(jié)構(gòu)。 采用沉積方法將各層加到基片上。還采用其它半導(dǎo)體加工，例如灰化、打磨、釋放和升離制造本發(fā)明的微型鏡結(jié)構(gòu)，如下文詳述的。透明基片可以是任何合適的剛性透明材料。透明材料可包含，例如無機(jī)氧化物材料，例如二氧化硅。優(yōu)選的材料是熔凝二氧化硅。本發(fā)明一方面是制造包含反應(yīng)區(qū)域陣列的基片的方法，該反應(yīng)區(qū)域與并入的微型鏡結(jié)構(gòu)相關(guān)，該方法包括以下步驟a)提供具有頂表面的透明基片；b)使該透明基片形成圖案并作蝕刻以形成具有頂部和側(cè)部的突起陣列；c)沉積包覆材料以使所述突起的頂部包含包覆層；d)通過該包覆層形成孔隙陣列以使各突起的頂部包含孔隙；和e)沉積反射沉積材料以使各突起的側(cè)部包含反射層；藉此該突起陣列包含微型鏡的陣列，而各突起頂部的孔隙包含零模式波導(dǎo)。該方法涉及反應(yīng)區(qū)域和微型鏡結(jié)構(gòu)的制造。本文詳細(xì)描述的一組方法涉及首先將反應(yīng)區(qū)域制造成，例如孔隙陣列，隨后制造微型鏡結(jié)構(gòu)。另一組方法涉及首先在透明基片上制造微型鏡結(jié)構(gòu)，隨后制造反應(yīng)區(qū)域。為制造本發(fā)明的陣列，將具有不同尺寸需求的不同特征的不同處理過程組合起來可能是有用的。例如，本發(fā)明方法可利用193nm平版印刷方法制造反應(yīng)區(qū)域和I-線平版印刷方法(I-line lithography)制造微型鏡陣列。這不是典型的制造方法，因?yàn)樵诠に囍行枰獙⒒瑥囊粋€(gè)制造設(shè)備運(yùn)送到另一制造設(shè)備。圖10到圖18顯示制造反應(yīng)區(qū)域陣列的本發(fā)明示范性方法，其中各反應(yīng)區(qū)域與透明基片內(nèi)的微型鏡光學(xué)元件相關(guān)。這些示范性方法并未窮盡列出構(gòu)成本發(fā)明的方法。各方法涉及不同組的步驟。在一些情況中，一種方法的多組步驟可與另一方法的多組步驟組合來制造本發(fā)明的基片。例如，在一個(gè)方法中制造微型鏡結(jié)構(gòu)的步驟可與制造孔隙的步驟組合。此外，提供的說明書可不示出包括的所有步驟。例如，在許多情況中，本文未描述的灰化、清潔、抗蝕層去除。清洗和干燥步驟將包括在本發(fā)明方法中。雖然所述方法中的步驟顯示某些層直接位于其它層的頂部，但適當(dāng)時(shí)本發(fā)明方法可包括在所述層之間納入中介層，但本文未明確示出。例如，對(duì)于許多抗蝕處理，可包含保護(hù)層或抗反射涂層，如BARC，例如在抗蝕層和該抗蝕層以下的層之間。應(yīng)該知道此類層可包括在所述處理中。除非明確描述，可視需要改變本文所述方法的步驟的次序。在一些情況中，這些方法提供蝕刻數(shù)層的蝕刻步驟，例如通過金屬包覆層和透明基片，或通過保護(hù)層、金屬包覆層和透明基片中全部三個(gè)。雖然這些方法總體上顯示同時(shí)蝕刻諸層，在一些情況中，對(duì)各層實(shí)施不同的平版印刷和蝕刻步驟。例如，如果在一些情況中通過金屬層和透明基片進(jìn)行蝕刻，優(yōu)選首先沉積抗蝕層，使該第一抗蝕層形成圖案以蝕刻金屬層，沉積第二抗蝕層，使該第二抗蝕層形成圖案以蝕刻透明基片。在一些情況中，可采用提供，例如分段圓錐結(jié)構(gòu)的方式進(jìn)行多個(gè)蝕刻步驟。例如，第一平版印刷和蝕刻方法可蝕刻金屬層，筆直向下垂直于表面延伸入透明基片以形成圓筒狀結(jié)構(gòu)；和第二平版印刷和蝕刻方法制造較低的圓錐結(jié)構(gòu)，該方法造成與表面的垂線呈一定角度的側(cè)壁。以此方式，可采用多個(gè)蝕刻步驟制造鏡結(jié)構(gòu)，例如圖6C所示。一種半導(dǎo)體制造方法示于圖10，其顯示了此類微型鏡光學(xué)元件和零模式波導(dǎo)陣列的制造過程，其中首先制造所述微型鏡元件，在后續(xù)步驟中制造ZMW。如步驟I所示，首先用
24抗蝕層1002涂布透明基片層1000。然后在步驟II中露出抗蝕層并顯影以提供鏡陣列的所需圖案1004。在步驟III中將其轉(zhuǎn)移到下層基片，例如干燥蝕刻轉(zhuǎn)移過程以產(chǎn)生鏡陣列的負(fù)浮雕1006。本文所述的方法制造具有拋物面結(jié)構(gòu)的鏡的陣列。在一些情況中，優(yōu)選在轉(zhuǎn)移步驟后提供光滑處理步驟以減少粗糙蝕刻表面可能的光學(xué)偏差。此類光滑處理步驟可包括，例如溫和蝕刻步驟以提供光滑的表面，例如低壓等離子體蝕刻和/或在轉(zhuǎn)移的表面上沉積光滑層材料。此類光滑層的例子包括，例如采用傳統(tǒng)共形沉積方法，如低壓化學(xué)蒸氣沉積(LPCVD)方法、等離子體增強(qiáng)CVD方法(PECVD)等沉積在表面上的折射率匹配材料，如 SiOx 或 SiO2 層。轉(zhuǎn)移步驟III后，在步驟IV中將反射材料層1008沉積在形成圖案的基片上。在特別優(yōu)選的方面，反射材料是通過金屬化方法，例如蒸發(fā)或?yàn)R射沉積在形成圖案的表面上的金屬涂層，例如鋁或鉻，從而限定鏡陣列的反射表面。在一些情況中，采用共形沉積方法， 例如蒸發(fā)進(jìn)行沉積或金屬化。金屬化步驟后，在步驟V中將填充層或平整化層1010沉積在反射層1008上。該步驟可利用各種填充材料，包括其它金屬層(或連續(xù)金屬層)、無機(jī)材料，如硅、二氧化硅、 聚合材料、半導(dǎo)體材料等。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，將基于二氧化硅的層沉積成填充層， 該層最好包含二氧化硅或其它玻璃樣材料?？赏ㄟ^數(shù)種傳統(tǒng)方法制造玻璃填充層，包括利用旋涂玻璃材料，或通過基片上的蒸氣沉積和隨后的硅填充層氧化。然后在步驟VI中除去上表面以露出拋物面鏡頂部的開口 1012，例如，通過表面研磨、打磨或蝕刻或這些方法的組合。然后在步驟VII中將金屬包覆層1014沉積在上表面， 在其中布置有孔隙，例如ZMW孔1016，并與各拋物面鏡結(jié)構(gòu)的開口光通信以限定集成了拋物面鏡的ZMW陣列。圖11顯示制造本發(fā)明集成反應(yīng)區(qū)域和微型鏡與透明基片的另一示范性方法。在步驟(I)中，將抗蝕層1120，例如光致抗蝕劑沉積在其頂表面布置有包覆層1110的透明基片1100上。使該抗蝕層形成圖案并顯影產(chǎn)生特征陣列1125。在步驟(II)中，蝕刻包覆層 1110以產(chǎn)生反應(yīng)區(qū)域陣列1140，例如通過包覆層的孔隙。還通過其它方法，例如本文所述那些，如利用犧牲支柱，或通過包覆層的電子束蝕刻產(chǎn)生反應(yīng)區(qū)域陣列1140。在步驟(III) 中，將保護(hù)層1150沉積在基片上。在步驟(IV)中，沉積限定鏡結(jié)構(gòu)特征的抗蝕層1160，并形成圖案。在步驟(V)中，采用一個(gè)或多個(gè)蝕刻步驟產(chǎn)生微型鏡結(jié)構(gòu)，本文顯示為圓錐形。然后除去抗蝕層以露出保護(hù)層。在步驟(VI)中，沉積反射層，例如通過濺射或蒸發(fā)金屬1170。 在步驟(VII)中，沉積限定鏡結(jié)構(gòu)1180頂部的抗蝕層，并形成圖案。在步驟(VIII)中，蝕刻抗蝕層未覆蓋的金屬部分以露出其下的保護(hù)層。然后除去保護(hù)層以打開孔隙。得到的陣列具有通過包覆層的孔隙構(gòu)成的反應(yīng)區(qū)域，所述孔隙各自布置在鏡結(jié)構(gòu)的頂部。本發(fā)明的備選示范性方法示于圖12。步驟(I)和(II)利用抗蝕層1220在透明基片1200頂部的包覆層1210中產(chǎn)生孔隙陣列1240。還可通過其它方法，例如本文所述那些，如利用犧牲支柱或通過包覆層的電子束蝕刻產(chǎn)生反應(yīng)區(qū)域陣列1M0。在步驟(III)中， 沉積限定微型鏡結(jié)構(gòu)的抗蝕層1沈0，并形成圖案。在步驟(IV)中，對(duì)于微型鏡結(jié)構(gòu)，控制抗蝕層幾何特征和蝕刻條件以產(chǎn)生具有逐漸變細(xì)側(cè)壁的特征，本文顯示為具有基本上直側(cè)壁的圓錐結(jié)構(gòu)。在步驟(V)中，沉積反射層，例如金屬層1270。在步驟(VI)中，沉積抗蝕層 1280并形成圖案以露出微型鏡結(jié)構(gòu)頂部抗蝕區(qū)域之上的區(qū)域。在步驟(VII)中，蝕刻露出的金屬，然后除去抗蝕層以露出孔隙，因此產(chǎn)生各自與微型鏡相關(guān)的反應(yīng)區(qū)域的陣列。圖13顯示本發(fā)明的另一示范性方法。首先，步驟⑴和(II)利用抗蝕層1320在透明基片1300頂部的包覆層1310中產(chǎn)生孔隙陣列1340。還可通過其它方法，例如本文所述那些，如利用犧牲支柱或通過包覆層的電子束蝕刻產(chǎn)生反應(yīng)區(qū)域陣列1340。然后，在步驟(III)中，沉積保護(hù)層1350。在步驟(IV)中，沉積限定微型鏡結(jié)構(gòu)的抗蝕層1360，并形成圖案。在步驟(V)中，采用蝕刻方法產(chǎn)生具有逐漸變細(xì)側(cè)壁的微型鏡結(jié)構(gòu)，除去抗蝕和保護(hù)層。通過抗蝕層沉積、形成圖案和在步驟(VI)中去除而在微型鏡結(jié)構(gòu)頂部形成抗蝕支柱 1380，在步驟(VII)中，沉積金屬1370以在微型鏡上形成反射層。在步驟(VII)中，除去抗蝕層，除去抗蝕支柱和沉積在其頂部的金屬，因而產(chǎn)生各自與微型鏡相關(guān)的反應(yīng)區(qū)域的陣列。圖14顯示另一示范性方法，其中，步驟⑴和(II)利用抗蝕層1420在透明基片 1400頂部的包覆層1410中產(chǎn)生孔隙陣列1440。然后，在步驟(III)中，沉積犧牲層1450。 優(yōu)選的犧牲層包含鍺或硅。在步驟(IV)中，沉積限定微型鏡結(jié)構(gòu)的抗蝕層1460，并形成圖案。在步驟(V)中，采用蝕刻方法產(chǎn)生具有逐漸變細(xì)側(cè)壁的微型鏡結(jié)構(gòu)，采用后拉方法將犧牲層的邊緣向后拉過微型鏡頂部。在步驟(VI)中，沉積金屬1470作為微型鏡的反射層。濺射可以是該金屬沉積步驟的有用方法，因?yàn)槟苡行У馗采w側(cè)壁而不覆蓋犧牲層的側(cè)壁。在步驟(VII)中，釋放犧牲層，還除去犧牲層頂部的抗蝕和金屬層。由于釋放材料能通過通孔擴(kuò)散，在一些情況中產(chǎn)生有助于有效除去稀釋層頂部的抗蝕和金屬層的氣泡，優(yōu)選采用濕性釋放方法釋放稀釋層。在一些情況中，聯(lián)用超聲處理與濕性釋放方法。圖15顯示本發(fā)明的備選方法。在步驟(I)中，在透明基片1500上沉積限定微型鏡的抗蝕層1510并形成圖案。然后采用，例如反應(yīng)離子蝕刻方法在透明基片1500中產(chǎn)生微型鏡結(jié)構(gòu)。在步驟(III)中，該微型鏡結(jié)構(gòu)上沉積金屬反射層1520。在步驟(IV)中，沉積平整化層1530，例如旋涂玻璃或PECVD氧化物。平整化層的厚度可以是，例如8微米到10 微米。平整化層可以是硬質(zhì)材料，例如旋涂玻璃，或者可以是軟質(zhì)平整化層。軟質(zhì)平整化層可以是，例如旋涂紫外可固化有機(jī)聚合物，如Summers J91或SK9。如果平整化層包含硬質(zhì)材料，該平整化(層)通常經(jīng)打磨，例如采用步驟(V)所示的化學(xué)機(jī)械打磨(CMP)。如果平整化層包含軟質(zhì)材料，例如紫外可固化聚合物，則在紫外固化后采用氧蝕刻刻去旋涂聚合物的頂部區(qū)域直至微型鏡的頂部，類似于打磨。打磨或氧蝕刻步驟露出微型鏡結(jié)構(gòu)的頂部。 在步驟(VI)中，將金屬包覆層1540沉積在表面上。在步驟(VII)，沉積限定孔隙的抗蝕層 1550并形成圖案。在步驟VIII中，蝕刻包覆層以形成反應(yīng)區(qū)域1560，除去抗蝕層以產(chǎn)生各自與透明基片上的微型鏡相關(guān)的反應(yīng)區(qū)域的陣列。圖16顯示本發(fā)明的還有另一備選方法。在步驟(I)中，在透明基片1600上沉積限定微型鏡的抗蝕層1610并形成圖案。然后采用，例如反應(yīng)離子蝕刻方法在透明基片1600 中產(chǎn)生微型鏡結(jié)構(gòu)。在步驟(III)中，將金屬反射層1620沉積在微型鏡結(jié)構(gòu)上。在步驟 (IV)中沉積軟質(zhì)平整化層1630，例如聚合物層。軟質(zhì)平整化層可以是，例如旋涂紫外可固化有機(jī)聚合物，如Summers J91或SK9。在步驟(V)中，沉積限定反應(yīng)區(qū)域的抗蝕層1640并形成圖案。在步驟(VI)中，進(jìn)行通過軟質(zhì)平整化層1630和金屬層1620作蝕刻的深層蝕刻以形成反應(yīng)區(qū)域1660。在步驟(VII)中，除去抗蝕層和軟質(zhì)平整化層，因而產(chǎn)生各自與透明基片上的微型鏡相關(guān)的反應(yīng)區(qū)域1660的陣列。
圖17和圖18顯示利用小支柱(納米支柱)的本發(fā)明備選方法，該支柱從沉積在透明基片上的層，例如熔凝二氧化硅(層)形成。在表面上形成納米支柱，隨后除去以產(chǎn)生本發(fā)明的反應(yīng)區(qū)域?？梢詮娜魏魏线m材料層形成納米支柱。形成納米支柱的優(yōu)選材料是多晶硅(多晶-Si)或多晶鍺(多晶-Ge)。可通過，例如低壓化學(xué)蒸氣沉積(LPCVD)、等離子體增強(qiáng)的化學(xué)蒸氣沉積(PECVD)或無定形硅的固相結(jié)晶(SPC)將多晶-Si沉積在透明基片上。利用納米支柱，例如多晶-Si納米支柱產(chǎn)生反應(yīng)區(qū)域可納入本文所述的其它方法，例如上述那些。雖然描述了從多晶-Si制造納米支柱的一些方法，但應(yīng)該知道這些方法可利用其它合適材料制成的納米支柱。對(duì)于圖17所示的方法，在步驟⑴中，在透明基片頂部產(chǎn)生多晶硅納米支柱的陣列，例如通過將多晶硅沉積在該透明基片上，沉積抗蝕層并形成圖案以限定納米支柱，蝕刻除去不想要的多晶硅區(qū)域以產(chǎn)生納米支柱。在步驟(II)中，沉積形成微型鏡結(jié)構(gòu)的抗蝕層并形成圖案。在步驟(III)中，蝕刻透明基片以產(chǎn)生具有逐漸變細(xì)側(cè)壁的微型鏡結(jié)構(gòu)。在步驟(IV)中，沉積厚金屬(層)以掩蔽納米支柱并填充微型鏡結(jié)構(gòu)之間的區(qū)域。在步驟(V) 中，平整化金屬層，例如通過CMP，從而露出納米支柱頂部。然后在步驟(VI)中除去露出的納米支柱以產(chǎn)生反應(yīng)區(qū)域陣列。在該實(shí)施方式中，金屬(層)用作微型鏡結(jié)構(gòu)各壁的包覆層和反射表面。在一些情況中，可利用厚金屬層進(jìn)行熱量控制，因?yàn)楫a(chǎn)生的金屬層具有較高傳熱系數(shù)。圖18顯示利用納米支柱產(chǎn)生反應(yīng)區(qū)域陣列的備選方法。在步驟(I)中，在透明基片頂部產(chǎn)生多晶硅支柱的陣列，例如通過將多晶硅沉積在該透明基片上，沉積抗蝕層并形成圖案以限定納米支柱，蝕刻除去不想要的多晶硅區(qū)域以產(chǎn)生納米支柱。在步驟(II)中， 沉積形成微型鏡結(jié)構(gòu)的抗蝕層并形成圖案。在步驟(III)中，進(jìn)行透明基片蝕刻，例如反應(yīng)離子蝕刻以產(chǎn)生微型鏡結(jié)構(gòu)。在步驟(IV)中，沉積金屬層以在微型鏡結(jié)構(gòu)頂部形成金屬包覆層，在微型鏡結(jié)構(gòu)側(cè)部形成反射層。在步驟(V)中，沉積平整化層，例如旋涂玻璃以填充微型鏡結(jié)構(gòu)之間的區(qū)域。在步驟(VI)中，進(jìn)行平整化或打磨步驟以平整化微型鏡結(jié)構(gòu)頂部的平整化層和金屬層及露出納米支柱結(jié)構(gòu)。在步驟(VII)中，除去納米支柱結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生各自與微型鏡結(jié)構(gòu)相關(guān)的孔隙或反應(yīng)區(qū)域的陣列。圖19顯示采用犧牲層形成本發(fā)明的反應(yīng)區(qū)域，例如納米級(jí)孔隙的方法。圖19所示方法可納入本文所述的任何合適方法或與之組合以形成本發(fā)明微型鏡相關(guān)的反應(yīng)區(qū)域的陣列，包括以上圖10-18所述那些。在步驟(I)中，將犧牲材料1910涂布到透明基片 1900上，將硬質(zhì)遮蔽層1920涂布到犧牲材料1910上。犧牲材料可以是，例如多晶-Si或多晶-Ge。硬質(zhì)涂布材料可以是，例如氧化物或氮化物，例如氧化硅或氮化硅。在后續(xù)蝕刻步驟中，硬質(zhì)涂布材料對(duì)于犧牲材料應(yīng)具有可接受的選擇性。在步驟(II)中，采用平版印刷蝕刻硬質(zhì)掩蔽層。在步驟(III)和步驟(IV)中，蝕刻犧牲層。如步驟(IV)所示，采用受控過蝕刻進(jìn)行蝕刻，從而產(chǎn)生特定切口并形成犧牲支柱。可將切口制成硬質(zhì)涂布掩蔽層的直徑或其它表面尺寸(W1)是犧牲層直徑(Wp)的1. 1到3倍。在一些情況中,W1ZiWp介于約 1. 5到約2. 5之間。在一些情況中，ff/ffp介于約1. 6到約2. 2之間。切口尺寸可以是，例如介于約IOnm到約300nm之間，介于約50nm到約200nm之間，或介于約70nm到約150nm 之間。然后在表面上沉積金屬包覆層1930。采用，例如濺射等方式進(jìn)行包覆層沉積，從而金屬沉積在硬質(zhì)掩蔽層在犧牲層上延伸的透明區(qū)域上。在步驟(VI)中，除去犧牲支柱，例如利用優(yōu)先溶解犧牲材料的試劑以露出反應(yīng)區(qū)域1940。犧牲材料是鍺，包覆金屬是鋁，可利用水性氧化劑溶解鍺而基本上不除去鋁。可在一步或多步中蝕刻透明基片以形成微型鏡結(jié)構(gòu)。在一些情況中，可采用一系列照相平板印刷術(shù)和蝕刻步驟形成鏡結(jié)構(gòu)。雖然采用多個(gè)蝕刻步驟為該方法增加了更多的步驟，但在一些情況中，采用一系列步驟可更好地控制微型鏡結(jié)構(gòu)。在一些情況中，可采用 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、或更多的步驟。圖20顯示采用多個(gè)照相平板印刷術(shù)和蝕刻步驟的示范性方法。對(duì)于圖20所述的方法，用光致抗蝕劑涂布基片2000， 形成圖案并蝕刻9次。例如，蝕刻第一層以產(chǎn)生圓筒狀結(jié)構(gòu)，其直徑為最下層的。然后使后續(xù)各光致抗蝕層形成圓形圖案，其直徑略小于之前的層。多步方法產(chǎn)生具有抗蝕層限定的結(jié)構(gòu)特征的結(jié)構(gòu)陣列2010。在一些情況中，該方法產(chǎn)生具有各層限定的一系列梯臺(tái)2020的結(jié)構(gòu)2010。如果需要，可打磨結(jié)構(gòu)的壁，例如通過濕法或干法蝕刻以部分或完全除去梯臺(tái)結(jié)構(gòu)。通過多個(gè)蝕刻步驟形成微型鏡結(jié)構(gòu)之前或之后，可如本文所述反射性涂布各結(jié)構(gòu)，并產(chǎn)生相關(guān)反應(yīng)區(qū)域。圖20所述結(jié)構(gòu)2010顯示具有相對(duì)較直的側(cè)壁(具有梯臺(tái))，但可采用多蝕刻步驟方法產(chǎn)生具有任何隨意形狀的結(jié)構(gòu)，包括彎曲壁、分段圓錐結(jié)構(gòu)、拋物面結(jié)構(gòu)等。多個(gè)蝕刻步驟可納入各向同性、各向異性或灰度蝕刻步驟的任何組合。雖然所述方法產(chǎn)生圓筒狀對(duì)稱結(jié)構(gòu)，但應(yīng)該知道還可采用多步驟方法產(chǎn)生具有除圓筒狀對(duì)稱性以外的其它對(duì)稱性的結(jié)構(gòu)。在一些情況中，本發(fā)明方法利用抗蝕劑，通過平版印刷限定和產(chǎn)生結(jié)構(gòu)。這些抗蝕劑可以是，例如光致抗蝕劑或電子束抗蝕劑?？刹捎米贤?、深紫外、G-系、H-系、I-系或其它合適波長或波長組顯影光致抗蝕劑。所用光致抗蝕劑的類型以及由此用于處理的儀器類型取決于產(chǎn)生的特征的尺寸。在本文所述許多方法中，利用較高分辨率的抗蝕劑和設(shè)備產(chǎn)生對(duì)應(yīng)于反應(yīng)體積的孔隙，其中孔隙的大小可以是IOnm到500nm的數(shù)量級(jí)，采用較低分辨率抗蝕劑和相關(guān)設(shè)備產(chǎn)生微型鏡，其具有的特征尺寸可以是1微米到20微米。本領(lǐng)域已知許多抗蝕劑，許多可從公司，例如羅門哈斯公司(Rohm and Haas)和希普雷公司(Siipley) 商品化購得。本發(fā)明方法所用的抗蝕劑可以是負(fù)性或正性光致抗蝕劑。如果本文所述的方法利用負(fù)性光致抗蝕劑，應(yīng)該知道實(shí)際上也可利用合適的正性光致抗蝕劑，反之亦然。適當(dāng)時(shí)，還可采用化學(xué)擴(kuò)增以增加抗蝕劑的靈敏度。適當(dāng)時(shí)，可除去抗蝕劑，并清潔、清洗、灰化和干燥基片，這些操作是本領(lǐng)域已知的。在一些情況中，用于反應(yīng)區(qū)域(例如，ZMW)的照相平板印刷術(shù)的工具利用能產(chǎn)生特征大小約IOnm到約IOOnm的結(jié)構(gòu)的光刻曝光工具。此類系統(tǒng)包括，例如AMSL XT1250曝
光工具。在本發(fā)明的一些方面，采用蝕刻方法在透明基片中或在其它層中產(chǎn)生三維特征， 以便形成，例如光學(xué)元件，例如微型鏡或透鏡，或反應(yīng)體積，例如納米級(jí)孔隙。所用的蝕刻方法取決于所用材料的類型、特征的尺寸和抗蝕劑系統(tǒng)。在一些情況中，采用濕法蝕刻或濕法化學(xué)蝕刻。還可采用電化學(xué)蝕刻。在一些實(shí)施方式中，等離子體蝕刻或反應(yīng)離子蝕刻(RIE) 用作蝕刻方法。還可采用深層反應(yīng)離子蝕刻(DRIE)，例如，需要具有高長寬比的結(jié)構(gòu)之時(shí)。 還可采用干蒸氣相蝕刻，例如利用二氟化氙。適當(dāng)時(shí)，可采用批量顯微機(jī)械加工或表面顯微機(jī)械加工產(chǎn)生本發(fā)明的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明方法所用的蝕刻可以是灰度蝕刻?？刂瓶刮g層形成和蝕刻的條件以產(chǎn)生具有所需幾何性質(zhì)的側(cè)壁以便用作微型鏡，例如具有所需側(cè)壁角度。
本發(fā)明的一些方法涉及沉積反射層或包覆層?？赏ㄟ^濕法，包括從溶液旋涂各層， 或通過氣相方法沉積這些反射層。合適的方法包括電鍍、濺射沉積、物理蒸氣沉積、蒸發(fā)、分子束外延、原子層沉積和化學(xué)蒸氣沉積。金屬可用作反射層和包覆層。合適的金屬包括金、 鎳、鋁、鉻、鈦、鉬和銀。反射和/或包覆層可包含鋁，其可通過濺射沉積，例如利用可從CVC、 諾氏公司(Novellus)或MRC商品化購得的濺射工具。在本發(fā)明方法中沉積各層時(shí)，在一些情況中，在進(jìn)行到該方法的下一步驟之前處理各層。例如，沉積層可經(jīng)退火、平整化、清潔、鈍化或輕度蝕刻以提高其特性。在本發(fā)明的一些方法中，沉積保護(hù)層或犧牲層。保護(hù)層可以是聚合層，或可以是無機(jī)層。合適的保護(hù)或犧牲層包括鍺(Ge)和無定形硅(a-Si)?？衫帽Ｗo(hù)層產(chǎn)生本文所述的元件?？蛇x擇保護(hù)或犧牲層材料的類型的選擇性反應(yīng)性，例如對(duì)于濕性化學(xué)蝕刻劑的反應(yīng)性。例如，在一些情況中，有二氧化硅和鋁存在下，加熱的過氧化氫能選擇性蝕刻鍺，其用于產(chǎn)生與納米級(jí)孔隙組合的光學(xué)微型鏡結(jié)構(gòu)。在一些方法中，采用拉后方法。拉后方法通常包括從元件的邊緣蝕刻到某層內(nèi)，以減小該元件的尺寸?？衫门c具有露出邊緣的某層選擇性反應(yīng)的濕性化學(xué)試劑實(shí)施拉后。 在一些情況中，利用過氧化氫對(duì)鍺層實(shí)施拉后。一些方法采用打磨步驟以除去基片的表面區(qū)域。合適的方法包括化學(xué)-機(jī)械打磨或化學(xué)-機(jī)械平整化(CMP)。本發(fā)明的一些方法納入平整化層。沉積平整化層的方法取決于所用材料的類型。 平整化層可以是硬質(zhì)材料，例如無機(jī)材料，例如氮化硅；其可以是金屬材料，例如鋁；或者其可以是軟質(zhì)材料，例如聚合材料，如有機(jī)或基于硅的聚合物。平整化層可以是玻璃，例如二氧化硅材料。在一些情況中，平整化層包含旋涂玻璃，例如硅酸鹽、磷硅酸鹽或硅氧烷材料。可利用，例如霍尼韋爾公司(Honeyewell)的合適旋涂材料。平整化層可包含，例如摻雜了其它試劑的玻璃以控制其熔化特性，例如硼-磷-硅酸鹽玻璃(BPSG)。合適的聚合平整化材料包括，例如聚酰亞胺?？蓪⒈景l(fā)明的陣列納入分析系統(tǒng)以便分析該陣列反應(yīng)區(qū)域中發(fā)生的多個(gè)反應(yīng)。本文所述的陣列通常具有液體可從頂部接近，可從底部作光學(xué)分析的反應(yīng)區(qū)域。因此，常將陣列包含在其中引入感興趣反應(yīng)混合物的容器中。在一些情況中，各反應(yīng)區(qū)域均與一定體積的液體接觸，所述液體可具有，例如可分析的多種核酸模板分子，還可具有核苷酸、輔因子和其它調(diào)節(jié)劑以便實(shí)施待分析的反應(yīng)。可將包含陣列的容器置于具有合適光學(xué)組件、計(jì)算機(jī)控制器和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)的儀器內(nèi)?？蓪嚵械娜萜骶S持在儀器內(nèi)，從而能控制反應(yīng)條件，例如容器溫度和容器大氣條件。容器大氣條件可包括樣品上氣體的組成，例如濕度，和其它氣態(tài)物質(zhì)，例如氧的水平。集成的透鏡陣列與集成的拋物面鏡一樣，可采用各種傳統(tǒng)技術(shù)制造透鏡陣列，包括例如半導(dǎo)體制造方法、聚合材料的微型模塑等。例如，與上述集成鏡制造方法的部分一樣，可采用蝕刻方法，例如反應(yīng)離子蝕刻產(chǎn)生此類透鏡陣列。或者，如上所述，可采用可變離子植入方法改變基片組件的折射率來限定已有基片的透鏡。還應(yīng)知道，還可在基片內(nèi)制造額外的光學(xué)元件以改善從反應(yīng)區(qū)域收集光線。例如，可采用上述離子植入方法在基片中直接限定不同反應(yīng)區(qū)域各自的衍射光柵。
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在其它方面，利用至少部分校準(zhǔn)或聚焦到達(dá)和/或離開基片的熒光信號(hào)的透鏡陣列替代(或在一些情況中用之增強(qiáng))圓錐或拋物面鏡。此類透鏡陣列示于圖21。所示的整體裝置2100還包括布置在透明基片2116的第一表面2114上，在其中進(jìn)行感興趣反應(yīng)的零模式波導(dǎo)陣列，例如ZMW 2102-2112。微型或納米透鏡，例如透鏡2118-2128的陣列布置在透明基片2116的相反(或背面)表面2134上。如圖所示，這些透鏡具有一定大小，以匹配ZMW陣列的間距布置，從而各ZMW具有其本身相關(guān)的透鏡。與圖5B所示鏡陣列一樣， ZMW相關(guān)的透鏡使ZMW發(fā)出的光線轉(zhuǎn)向，例如部分校準(zhǔn)，并收集和分析該光線以監(jiān)測(cè)感興趣的反應(yīng)。雖然此類透鏡在消除基片內(nèi)串?dāng)_方面不如拋物面鏡基片有效，但它們提供成本和易于制造等額外益處，在一些情況中，還可用于代替此類集成鏡。如圖所示，可將透鏡陣列集成入下方的透明基片?；蛘?，可分別制造透鏡陣列，將其結(jié)合于下方的基片以提供相同或相似的結(jié)果。雖然顯示的是布置在陣列背面的單層透鏡，應(yīng)該知道透鏡陣列可由多個(gè)透鏡層組成，這些透鏡層各自尋址基片上的不同區(qū)域，或者可組合以在基片的給定區(qū)域提供所需光學(xué)功能。此外，雖然顯示的是從透明基片的背面伸出的透鏡，但在一些情況中，透鏡可以集成在該透明基片內(nèi)。例如，可在下方基片中制造透鏡，從而改變透鏡在這些位置的折射率。與常規(guī)透鏡制造一樣，可采用微型機(jī)械加工技術(shù)將分立的透鏡包埋在基片中以提供二元折射率。此外，通過在基片的所選位置產(chǎn)生折射率梯度，基片的這些部分可起到透鏡的作用?？赏ㄟ^許多方式，包括離子植入方法改變基片，例如玻璃基片的折射率。除了透鏡或透鏡陣列外，可將衍射光柵或其它光學(xué)功能元件類似地制造在下方基片中。由于聚焦光學(xué)元件至少部分校準(zhǔn)基片的信號(hào)，降低了對(duì)窄視場(chǎng)、高數(shù)值孔徑物鏡的需要，可以利用大視場(chǎng)、NA較低的物鏡，如此通常賦予整個(gè)系統(tǒng)成本和可用性方面的優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榭梢岳弥圃觳荒敲磭?yán)格的物鏡。此外，用于制造高倍物鏡的外來材料在露出于激發(fā)射線時(shí)可增加物鏡本身的光致發(fā)光。此外，由于利用低倍物鏡，物鏡與基片之間的間隔可大于利用高數(shù)值孔徑物鏡時(shí)通常提供的。這種額外的間隔能將額外的光學(xué)組件，例如一個(gè)或多個(gè)合適的分色鏡插入基片和收集物鏡之間。在至少一個(gè)示范性實(shí)施方式中，在基片和物鏡之間提供分色鏡能分開照射光線與收集物鏡(以及其它收集光線組件)。通過進(jìn)一步分開激發(fā)路徑與檢測(cè)路徑， 特別是提供不發(fā)現(xiàn)激發(fā)光線的收集物鏡，能完全消除激發(fā)射線通過物鏡時(shí)在收集路徑中產(chǎn)生的自身熒光或光致發(fā)光。圖22A顯示了該光學(xué)裝置。如圖所示，總系統(tǒng)2200包括基片 2202，其上布置有許多反應(yīng)區(qū)域2204。還包括集成在基片內(nèi)(如圖所示)或作為分立組件的聚焦光學(xué)元件(例如，上述的集成微型鏡或透鏡)，例如以便校準(zhǔn)反應(yīng)區(qū)域的光學(xué)信號(hào)和 /或?qū)⒄丈涔饩€聚焦到反應(yīng)區(qū)域。該系統(tǒng)還包括激發(fā)光源2206，或多個(gè)激發(fā)光源，以便為基片2202提供激發(fā)光線。激發(fā)光線經(jīng)設(shè)置在收集物鏡2210和基片2202之間的分色鏡2208 對(duì)準(zhǔn)基片。通過分開激發(fā)光線與收集物鏡2210，可避免收集物鏡2210自身熒光相關(guān)的問題，而這是此類噪聲的主要原因。在被分色鏡2208反射到基片2202之前，通常還對(duì)激發(fā)光線進(jìn)行額外操作，例如分束、波束成形、過濾等。例如，激發(fā)光線可通過多路光學(xué)元件以提供大量小波束，例如DOE 2212，還可通過聚焦光學(xué)元件，例如物鏡2214，以便將波束聚焦到基片的焦平面。由于光譜特征與激發(fā)光線不同，發(fā)出的信號(hào)通過分色鏡2208，有收集物鏡2210收集。如前所示，如果基片的信號(hào)早已為聚焦光學(xué)元件部分校準(zhǔn)，收集物鏡可以是低倍的，例如從沒有聚焦光學(xué)元件的系統(tǒng)的FOV為3mm或更小的60X (n. a. 0. 9)或更高的物鏡到FOV為 45mm或更大的4X(n. a. 0.28)或更低的物鏡，而仍能為單分子分析提供足夠的靈敏度。與圖2顯示的系統(tǒng)一樣，收集的信號(hào)隨后經(jīng)光譜分離，例如通過光柵2216，并經(jīng)進(jìn)一步聚焦， 例如通過透鏡2218，或其它操作，然后在檢測(cè)器2220處檢測(cè)。圖22B顯示了基片的分色鏡和照射路徑的其它或備選說明。如圖所示，分色鏡 2208夾在兩個(gè)光柵2250和2252之間的界面處。照射源的激發(fā)射線，例如激光2206對(duì)準(zhǔn)分色鏡2208。如圖所示，激發(fā)射線首先反射離開基片2202的背面，如實(shí)線箭頭所示。然后分色鏡2208將激發(fā)光線反射到基片和其上的反應(yīng)區(qū)域，例如圖22A中的反應(yīng)區(qū)域2204。然后反應(yīng)區(qū)域發(fā)出的熒光信號(hào)通過分色鏡2208進(jìn)入物鏡2210，進(jìn)入光具組和檢測(cè)系統(tǒng)的其余元件，例如圖22A所示。與其在例如圖22A所示傾斜于此類方向相反，通過在垂直于光學(xué)路徑的方向提供總分色元件，如圖22B所示，引入物鏡空間的光學(xué)偏差量降低，而這種偏差可進(jìn)而降低檢測(cè)面或共焦面的圖像質(zhì)量，可能是這種情況。B.時(shí)分多路性一方面，除了本文所述的其它增強(qiáng)多路性方案外，可通過給定系統(tǒng)的時(shí)分多路化實(shí)現(xiàn)多路性增加，例如在不同時(shí)間露出不同區(qū)域。此類系統(tǒng)可包括以較低速度在不同組區(qū)域之間切換，這類似于掃描方法，例如在不同時(shí)間照射和/或檢測(cè)不同區(qū)域，其中對(duì)于不同區(qū)域，不同定時(shí)不大重要?；蛘撸瑢?duì)于本發(fā)明的各方面，在足夠的頻率下進(jìn)行分析的時(shí)分多路化，對(duì)于給定分析，基本上同時(shí)進(jìn)行照射和/或檢測(cè)，例如從照相機(jī)幀捕捉速度來看，不同區(qū)域中的檢測(cè)看來是同時(shí)的，如前所示。本發(fā)明的該方面示意性地示于圖23。如圖所示，在基片2300上提供第一照射模式，其在第一時(shí)間點(diǎn)，例如時(shí)間t = 0時(shí)照射反應(yīng)區(qū)域2310的第一子集2302。然后在時(shí)間 t = 1時(shí)將靶向照射模式轉(zhuǎn)換成照射區(qū)域2310的不同子集2304。出于本發(fā)明的目的，t = 0和t = 1在時(shí)間上足夠接近，例如轉(zhuǎn)換頻率足夠，從而兩種照射模式基本上是同時(shí)的，該措詞與本文它處描述的一樣。按照本發(fā)明，雖然顯示的是在t = 0和t = 1之間切換的兩種子集模式，但應(yīng)該知道可采用各種不同照射模式并在所需時(shí)間幀內(nèi)切換以便基本上同時(shí)照射不同區(qū)域。例如，可采用基本上同時(shí)的方式分別照射區(qū)塊、列、截面或隨機(jī)或任意選擇的區(qū)域子集。在至少一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的時(shí)分多路化系統(tǒng)利用可在兩個(gè)或更多個(gè)光學(xué)路徑之間選擇性和快速轉(zhuǎn)換的光學(xué)轉(zhuǎn)換組件，從而照射基片上的不同區(qū)域。例如，在第一方面，分析系統(tǒng)的照射路徑包括光學(xué)路徑中的可轉(zhuǎn)換定向鏡以便將激發(fā)射線的方向轉(zhuǎn)向基片上的不同位置。在更復(fù)雜的系統(tǒng)中，可利用可編程鏡陣列，例如數(shù)字光處理器(DLP)，其能將靶向照射快速定向于基片的不同部分。其它動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)換組件，例如能選擇性切斷子集或甚至單個(gè)波束的光學(xué)路徑的組件包括，例如MEMS快門陣列，空間光調(diào)節(jié)器，例如LCD SLM。此類照射路徑的例子示于圖對(duì)。如圖所示，照射路徑MOO包括激發(fā)射線源，例如激光M02。通過合適的多路光學(xué)元件，例如一個(gè)或多個(gè)衍射光學(xué)元件、光柵等，例如DOE 2404引導(dǎo)激光， 產(chǎn)生所需多路性的靶向照射模式。將靶向照射模式對(duì)準(zhǔn)鏡M06，其選擇性引導(dǎo)照射模式的諸部分通過光具組的其余元件，例如分色鏡MlO和物鏡2408，入射到基片M14的部分區(qū)域上?？焖偾袚Q鏡導(dǎo)致在不同時(shí)間高頻率地照射基片M14上的不同區(qū)域，但優(yōu)選在檢測(cè)系統(tǒng)的幀捕捉期內(nèi)。在特別優(yōu)選的方面，切換系統(tǒng)以超過系統(tǒng)中檢測(cè)器獲取速度，例如照相機(jī)的幀捕捉速度的頻率操作。具體地說，在照相機(jī)獲取單幀所需時(shí)間中，通過將單幀捕捉事件中切換至少IX，優(yōu)選至少2X，在一些情況中更常見的是，例如至少3X、4X、5X或更高，切換過程對(duì)于檢測(cè)系統(tǒng)在很大程度上檢測(cè)不到或觀察不到。例如，對(duì)于幀頻為，例如ΙΟΟ-ΙΟΟΟΗζ的高速照相機(jī)，檢測(cè)系統(tǒng)的切換頻率應(yīng)是至少100Hz、200Hz、1000Hz、2000Hz或甚至更高。應(yīng)該知道，在一些情況中，可采用動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)各波束來調(diào)整各波束或波束子集的相對(duì)強(qiáng)度從而調(diào)節(jié)光學(xué)系統(tǒng)中其它偏差，例如漸暈等導(dǎo)致的基片改變。應(yīng)該知道，雖然描述的是將多路光學(xué)元件M04的多路束的不同部分間歇透射到基片M14，但在一些情況中，切換元件可簡單地使多路束轉(zhuǎn)向至基片M14的不同部分以進(jìn)一步增強(qiáng)多路性。例如，在一些情況中，多路光學(xué)元件對(duì)04可產(chǎn)生照射第一子集區(qū)域，例如圖23中的子集2302的照射模式。然后切換功能將同一靶向照射模式引導(dǎo)至其它子集區(qū)域， 例如圖23至的區(qū)域2304。因此，可選擇性設(shè)計(jì)多路光學(xué)元件以提供，例如照射反應(yīng)區(qū)域中每隔一列或一行。然后將切換光學(xué)元件，例如鏡M06設(shè)置成使光束轉(zhuǎn)向半個(gè)周期來照射反應(yīng)區(qū)域的間插列或行。C.檢索活性雖然本發(fā)明的許多方面涉及增加經(jīng)照射和/或檢測(cè)的反應(yīng)區(qū)域總數(shù)以供反應(yīng)分析，但在一些情況中，通過首先查詢大量反應(yīng)區(qū)域，然后僅照射和/或檢測(cè)有活性的，例如顯示感興趣反應(yīng)跡象的此類區(qū)域的子集來實(shí)現(xiàn)有效的多路性。因此，在另一方面，增加的多路性僅應(yīng)用于基片上的活性區(qū)域。實(shí)際上，該方法查詢大量反應(yīng)區(qū)域，但僅維持分析小的子集。因此，雖然最初作了高度多路性的有效查詢，但對(duì)可能甚至無需超高多路因子的反應(yīng)區(qū)域的實(shí)質(zhì)性更小的子集進(jìn)行最終分析。得到的系統(tǒng)有效增加多路性，即，更高水平通量地分析相關(guān)區(qū)域，而不在整個(gè)分析期間維持高多路分析。因此。所需能量輸入可低于直接的高多路方法，同時(shí)信噪比有增益，等等。上述方法的概述示意性地示于圖25。如圖所示，首先廣泛查詢具有大量潛在反應(yīng)區(qū)域2502的基片2500以識(shí)別活性反應(yīng)區(qū)域(如填充圓圈2504 所示)。此類廣泛照射可采取統(tǒng)一泛光照射整個(gè)基片獲取實(shí)質(zhì)性部分的形式，或可采取掃描分析不同區(qū)域的形式以識(shí)別表現(xiàn)出活性的那些?；蛘撸深愃频夭捎冒邢蛘丈浞椒ㄒ宰R(shí)別活性區(qū)域2504。一旦識(shí)別到，隨后將光學(xué)系統(tǒng)設(shè)置成僅照射表現(xiàn)出活性的那些區(qū)域，從而僅照射并由此監(jiān)測(cè)那些區(qū)域的信號(hào)(如虛線圓圈2506所示)。此類選擇性照射可利用各種不同光學(xué)系統(tǒng)或組件。例如，與以上時(shí)分多路照射方法一樣，可將可編程鏡陣列快速設(shè)置成僅照射給定基片上的所選精確區(qū)域。同樣，可利用具有可尋址像素的LCD掩模，例如傳統(tǒng)平板LCD顯示器所用的來選擇性照射基片上的所需區(qū)域?？扇鐖DM中鏡M06所述安置此類組件以便選擇性阻斷去往基片的無活性區(qū)域的波束。 特別是，通過提供LCD掩模，能選擇性尋址單個(gè)像素以打開或關(guān)閉它們對(duì)激發(fā)光線，例如波束的透射，從而控制最終射到基片上的波束的數(shù)量和模式。除了為基片上的不同區(qū)域提供可控掩模照射，以上方法還適用于調(diào)節(jié)基片上不同區(qū)域的照射強(qiáng)度。特別是，通過調(diào)節(jié)光通過不同掩蔽元件，能調(diào)節(jié)基片接受到的光強(qiáng)度。以上調(diào)節(jié)對(duì)于解決靶向照射中其它光學(xué)組件導(dǎo)致的非均勻性，例如多路光學(xué)元件，如DOE等的差異導(dǎo)致的非均勻性特別有用。具體地說，可制造灰度掩模，或者在可編程空間光調(diào)節(jié)器的情況中，編程以調(diào)節(jié)靶向照射中不同照射區(qū)域之間任何預(yù)定的非均勻性。特別是可取樣給定光學(xué)路徑的照射特征，包括多路光學(xué)元件，并依據(jù)該模式設(shè)置空間光調(diào)節(jié)器或掩模，適當(dāng)?shù)丶m正偏差，例如降低較亮照射斑點(diǎn)的強(qiáng)度。D.增強(qiáng)多路照射在其它方面，本發(fā)明利用多個(gè)照射源與一個(gè)或多個(gè)衍射元件的組合提供增強(qiáng)的多路照射以照射大量分立的反應(yīng)區(qū)域。在此類情況中，可引導(dǎo)2、3、4、5、10或更多激光束通過一個(gè)或多個(gè)衍射光學(xué)元件以在基片上產(chǎn)生大量照射斑點(diǎn)。照射基片上大量分立區(qū)域時(shí)，例如利用衍射光學(xué)元件以提供分立波束時(shí)，確保足夠的能量遞送給大量照射區(qū)域通常需要增加提供給系統(tǒng)的能量。對(duì)于超高多路系統(tǒng)，用于此的各照射源由于成本和可用性的原因而無法購得。例如，在某些示范性實(shí)施方式中，單一照射源束分成提供約5 μ W/μ Hl2的波束。實(shí)現(xiàn)80，000個(gè)分立斑點(diǎn)的相同照射能量提示單一照射束為約500mW。除激光照射外，衍射光學(xué)元件通常產(chǎn)生相對(duì)于小視場(chǎng)具有合理束均勻性的束模式。然而，如果需要擴(kuò)展視場(chǎng)，某些應(yīng)用的照射模式可變得過分非均勻。因此，擴(kuò)展多路照射，例如一個(gè)數(shù)量級(jí)或更高時(shí)，預(yù)計(jì)照射斑點(diǎn)的照射強(qiáng)度有實(shí)質(zhì)性改變。因此，在一方面，本發(fā)明提供被引導(dǎo)通過一個(gè)或多個(gè)衍射元件的多個(gè)照射源和/ 或源束，以便利用易得、低功率的照射源提供超高多路照射和照射視場(chǎng)的較高均勻性。在第一方面，多個(gè)照射束被引導(dǎo)以不同角度通過單一衍射元件，以便提供反射多個(gè)光束的輸出照射模式和起始光束中的角度變化。其示意性地示于圖沈。如圖所示，多個(gè)照射束(例如實(shí)線2602和虛線沈04所示)以不同角度(如角度沈08所示)對(duì)準(zhǔn)衍射光學(xué)元件沈06。將各起始波束的DOE發(fā)出的照射“波束”沈10的所得模式以其本身的模式引導(dǎo)到基片沈12上(例如，在基片沈12上示意性顯示為填充和未填充斑點(diǎn))，其中各模式被兩個(gè)起始波束之間角度差異的功能所抵消。除利用多個(gè)照射源束外，本發(fā)明還設(shè)想了利用多個(gè)衍射元件，其中個(gè)衍射元件接收起始照射束的子集以產(chǎn)生相關(guān)模式。具體地說，由于單一衍射元件發(fā)出的較高多路模式在整個(gè)較大視場(chǎng)上可提供過分偏差，可利用各自在特定基片的區(qū)域子集提供照射模式的多個(gè)衍射元件，從而照射差異局限于存在于較小視場(chǎng)的那個(gè)，因此不會(huì)超出所需應(yīng)用的范圍。此類系統(tǒng)的一個(gè)例子示于圖27A。具體地說，如圖所示，提供的多路衍射光學(xué)元件 2706可不可單一集成組件或多個(gè)相連的衍射光學(xué)元件2704。多個(gè)起始照射束(顯示為從多個(gè)照射源，例如激光2700發(fā)出的實(shí)線、短虛線和常虛線)對(duì)準(zhǔn)多路DOE 2706，其中各束與其它束呈輕偏斜角度而對(duì)準(zhǔn)DOE。如圖所示，可包括刻面光柵、波導(dǎo)陣列、光纖束或其它光學(xué)組件以使各束轉(zhuǎn)向至其合適的DOE組件。此外，可角度偏置陣列中的各DOE組件以最佳引導(dǎo)發(fā)出波束通過光具組的其余元件。然后集成DOE 2706內(nèi)的各DOE元件2704的所得束模式通過將各束聚焦在基片 2714上的光具組(如透鏡2708、2710和物鏡2712所示)透射。如圖所示，聚焦不同束以將它們的照射模式提供給基片的不同子集。例如，如各束的示意性展開圖所示，可采用交織各組件2704的照射模式以提供多重補(bǔ)充，但基片2714上的交織照射模式，例如圖沈所示的模式?；蛘撸蓪⒉煌牟ㄊＪ揭龑?dǎo)到基片上完全不同的區(qū)域，例如各象限等，以照射不同基片區(qū)域。圖27B顯示實(shí)現(xiàn)高多路性的許多DOE組件設(shè)置，包括5個(gè)DOE陣列組件(a)和(d)，
337個(gè)DOE陣列組件(b)和(e)，和9個(gè)DOE陣列組件(c)和(f)。根據(jù)多路性水平和所需照射模式，還可采用其它設(shè)置。在優(yōu)選的方面，除了以角間距均勻地將各入射束在照射模式中分成大量波束外，將陣列中各DOE組件設(shè)置成具有不同的偏置角展寬。例如，對(duì)于圖27B所示的9個(gè)刻面DOE組件，陣列中的各DOE組件或刻面可從單一入射束提供100X 100個(gè)波束。 這些波束在ΘΧ和θ y角間距上可均勻地間隔，例如0. lmrad。第一 D0E(1號(hào))的偏置角展度在θχ方向是，例如5mrad，第二 0(^0號(hào))在θχ和θ y角間距上偏5mrad，第三DOE (3 號(hào))在θ y角間距上偏5mrad，如此類推。應(yīng)該知道以及上文暗示的，各DOE可用于將一個(gè)或多個(gè)照射束轉(zhuǎn)化成引向基片的波束模式。E.多路檢測(cè)類似于應(yīng)用于本文所述分析系統(tǒng)的照射側(cè)的多路方法，除此類方法之外或作為備選方法，本發(fā)明還對(duì)增強(qiáng)該系統(tǒng)的收集側(cè)的多路性，例如收集和檢測(cè)從基片上反應(yīng)區(qū)域發(fā)出的信號(hào)的光學(xué)路徑。具體地說，對(duì)于超高多路性系統(tǒng)能力的至少一個(gè)局限之處在于檢測(cè)大量分立區(qū)域，例如基片上發(fā)出的信號(hào)的能力。應(yīng)該知道，在任何給定時(shí)間檢測(cè)基片上不同區(qū)域的信號(hào)的預(yù)期實(shí)際局限性將受限于給定檢測(cè)系統(tǒng)中的像素或檢測(cè)元件數(shù)。具體地說，給定檢測(cè)器像素僅能檢測(cè)入射于其上的信號(hào)，不作其它考慮的話，不能區(qū)分一個(gè)來源的信號(hào)于另一來源或組合來源的信號(hào)。然而，應(yīng)該知道，每個(gè)像素一個(gè)信號(hào)的實(shí)際局限性本身并非完全實(shí)際，因?yàn)闄z測(cè)多個(gè)像素的信號(hào)提供大量不同的信息，例如光譜信息、陣列位置等(參見，例如公布的美國專利申請(qǐng)?zhí)?007-0206187、公布的國際專利申請(qǐng)?zhí)朤O 2007/095119和美國專利申請(qǐng)?zhí)?2/134，186，2008年5月5日提交，各自的全部內(nèi)容出于所有目的通過引用納入本文)。類似地，分開陣列上的信號(hào)組分有助于防止信號(hào)交叉污染。作為這些和其它考慮的結(jié)果，在多路方法中，最好優(yōu)化檢測(cè)器陣列區(qū)域的有效應(yīng)用。在第一個(gè)實(shí)例中，可將基片上反應(yīng)區(qū)域陣列發(fā)出的信號(hào)引導(dǎo)至檢測(cè)器陣列的不同區(qū)域或甚至完全不同的檢測(cè)器陣列以最佳檢測(cè)高度多路基片的信號(hào)。在相關(guān)的實(shí)例中，可將各信號(hào)源的不同信號(hào)組分引導(dǎo)至不同檢測(cè)器。或者，與照射的時(shí)間切換一樣，可在時(shí)間上分離基片的不同區(qū)域發(fā)出的信號(hào)，但在不同時(shí)間引導(dǎo)至基片的相同、重疊、啦鄰或分立的位置。同樣，以超過，優(yōu)選實(shí)質(zhì)性超過最慢信號(hào)持續(xù)時(shí)間的頻率應(yīng)用此類切換，此類時(shí)間分離可以無縫檢測(cè)所需信號(hào)事件。此外，通過同步進(jìn)行信號(hào)分析過程與切換，不難給信號(hào)事件指定基片上的給定位置，即使在此類信號(hào)入射到檢測(cè)器陣列的相同位置上。應(yīng)該知道，如同上文討論的切換靶向照射模式一樣，相同或相似組件可用于信號(hào)方向的光學(xué)切換。此外，應(yīng)該知道，LCD掩模(例如上述的)也可用于收集途徑以選擇性打開和關(guān)閉分立反應(yīng)區(qū)域或反應(yīng)區(qū)域子集的收集途徑。通過在不同信號(hào)源之間“分享”檢測(cè)器的檢測(cè)區(qū)域，雖然時(shí)間點(diǎn)不同，但與不采用時(shí)間倍增的方法相比，可倍增采用單一檢測(cè)器或檢測(cè)器組可檢測(cè)的信號(hào)源的數(shù)量。在相關(guān)方面及上文暗示的，可將包含大量分立反應(yīng)區(qū)域的單個(gè)基片分成多個(gè)不同的子視場(chǎng)(子-F0V)，各自可引向不同檢測(cè)器以便提供高度多路性基片。為有效而同時(shí)監(jiān)測(cè)這些子-F0V，優(yōu)選維持實(shí)現(xiàn)該監(jiān)測(cè)方法的單一光具組。因此，在一方面，本發(fā)明提供照射基片上多個(gè)反應(yīng)區(qū)域的光學(xué)系統(tǒng)，但其將多個(gè)反應(yīng)區(qū)域子集各自的信號(hào)引導(dǎo)至不同檢測(cè)器。收集基片的不同區(qū)域的熒光信號(hào)并將它們透射至不同檢測(cè)器的光學(xué)系統(tǒng)的實(shí)例示意性地示于圖觀。如圖所示，系統(tǒng)觀00包括基片觀02，其上或其內(nèi)布置有多個(gè)分立的反應(yīng)區(qū)域或感興趣區(qū)域。將基片觀02，特別是分析的區(qū)域布置在物鏡觀04的前焦平面。如圖所示，物鏡觀04和鏡筒透鏡觀06將感興趣區(qū)域在透鏡觀06背焦平面，接近反射掩模觀08 的中間圖像平面上成像。反射掩模觀08分開圖像，將子集反射到檢測(cè)器觀10，一部分反射到檢測(cè)器觀12。反射掩模的頂點(diǎn)通常設(shè)置在焦平面，從而沒有保真度損失。還顯示這些檢測(cè)途徑各自包括光譜分離光學(xué)元件，例如分別是聚焦透鏡觀14和觀16，2818和觀20以及顏色分離的分散光學(xué)元件，例如分別是光柵觀22和觀24。雖然顯示的是將圖像分成兩個(gè)獨(dú)立檢測(cè)的圖像，但應(yīng)該知道，反射掩?；蚱渌謭D像光學(xué)元件可設(shè)置成將圖像分成大量圖像組分，例如2、3、4、8、16或更多分立的圖像組分，各自可引向不同檢測(cè)器。如前文所暗示的，可通過許多方式分離圖像。例如，在簡單的方面，反射掩模觀08 可包含，例如具有不同偏置區(qū)段的針-輪鏡(pin-wheel mirror)，其中各刻面將一部分圖像反射到不同檢測(cè)途徑?；蛘?，采用微型棱鏡或微型鏡陣列，例如作為反射掩模觀08以將子-FOV各自的圖像引導(dǎo)至不同檢測(cè)途徑，其具有刻面表面陣列起到將入射光線引入所需方向的作用。應(yīng)該知道，按照本發(fā)明，可將此類陣列設(shè)置成將圖像分成許多分立的組成型圖像。在相關(guān)系統(tǒng)中，可將基片上各種信號(hào)源的不同信號(hào)組分差異性引導(dǎo)到不同檢測(cè)器。具體地說，在一個(gè)檢測(cè)器系統(tǒng)中，例如圖22所示，在空間上分開多個(gè)信號(hào)組分，例如通過分散性光學(xué)元件2216，并在檢測(cè)器2220上成像。對(duì)于將各種信號(hào)源緊密堆積在陣列上的超高多路陣列基片，在空間上分離各種信號(hào)組分的圖像的能力變得更為困難，因?yàn)闄z測(cè)器區(qū)域不足以容納隔開的組件，它們開始對(duì)檢測(cè)器陣列的實(shí)質(zhì)性重疊的部分作圖。通過將不同信號(hào)組分引向不同檢測(cè)器，可以對(duì)基片上更緊密堆積的信號(hào)源成像。這示意性示于圖^^。具體地說，如示意性圖像四02所示，4個(gè)信號(hào)組分，例如空間上不同且分開的熒光信號(hào)圖像(四04-2910)在檢測(cè)器陣列的一部分上成像。通過將信號(hào)組分的子集，例如信號(hào) 2904/2906和四08/2910差異性引導(dǎo)至不同檢測(cè)器，信號(hào)源，例如ZMW的有效成像數(shù)量幾乎翻倍，而沒有信號(hào)重疊的顧慮?？沙上裥盘?hào)源規(guī)模的數(shù)量以及檢測(cè)器的數(shù)量，例如2個(gè)檢測(cè)器能對(duì)最多2X信號(hào)源成像。然而，在優(yōu)選的情況中，對(duì)于在毗鄰信號(hào)源之間作區(qū)分的額外間隔要求可能需要不同來源的信號(hào)組分之間有更大的間隔。因此，可成像信號(hào)源的數(shù)量可以不精確地遵循檢測(cè)器數(shù)量。圖29B示意性顯示了實(shí)現(xiàn)上述檢測(cè)多路性的光學(xué)系統(tǒng)。在所示系統(tǒng)中，系統(tǒng)的激發(fā)光學(xué)元件類似于圖22所示系統(tǒng)的裝置，例如在物鏡和基片之間有分色濾光片。具體地說，如圖所示，總系統(tǒng)四50包括一個(gè)或多個(gè)激發(fā)光源，例如激光四52和四討。與所有此類系統(tǒng)一樣，可根據(jù)具體應(yīng)用的需要，例如系統(tǒng)中所用各種熒光團(tuán)的激發(fā)波長和所用激光的波長而改變激發(fā)源的數(shù)量。在所示的示意性系統(tǒng)中，通過在分色鏡四56處引導(dǎo)兩個(gè)激發(fā)光源(照射光源)而將二者組合在同一光學(xué)途徑中，該分色鏡透射激光四討的光而反射激光 2952的光束，從而兩個(gè)光束變?yōu)楣簿€。在所示系統(tǒng)中，激發(fā)束仍對(duì)準(zhǔn)額外的分色鏡四58，其用于對(duì)著基片四60反射激發(fā)光，而將不同波長的熒光信號(hào)透射到收集物鏡四62。如圖所示，信號(hào)首先反射離開光具組中另一組件，例如不同鏡的表面，或基片的背面，例如上文關(guān)于圖22所述。然后來自基片四60的光譜上不同的信號(hào)組分(例如不同熒光標(biāo)記試劑發(fā)出的)通過分色鏡四58和物鏡四62。然后使信號(hào)組分通過分散性光學(xué)元件，例如楔形棱鏡四64而將它們分成光譜上不同的信號(hào)組分(從棱鏡四64發(fā)出的實(shí)線和虛線箭頭所示)。然后使信號(hào)組分對(duì)準(zhǔn)分散鏡四66，其反射信號(hào)組分的一個(gè)子集而透射信號(hào)組分的另一子集。 然后信號(hào)組分的不同子集各自在檢測(cè)器四68或四70上成像。如上所示，雖然顯示的具有兩個(gè)檢測(cè)器，但應(yīng)該知道可利用其它檢測(cè)器對(duì)信號(hào)組分的進(jìn)一步子集成像，例如可具有4個(gè)信號(hào)組分，各自利用其它分色鏡引向不同檢測(cè)器。F.玻璃填充的物體空間本發(fā)明一方面提供具有玻璃填充光學(xué)空間的改善光學(xué)系統(tǒng)。如本文所述，用于分析反應(yīng)區(qū)域陣列的光學(xué)系統(tǒng)通常具有照射光學(xué)元件和收集光學(xué)元件，所述反應(yīng)區(qū)域具有， 例如熒光試劑以便分析化學(xué)反應(yīng)，所述照射光學(xué)元件打在反應(yīng)區(qū)域上而所述收集光學(xué)元件檢測(cè)反應(yīng)區(qū)域所發(fā)生反應(yīng)發(fā)出的光線。在一些情況中，可利用分色元件控制照射和收集系統(tǒng)的光學(xué)途徑，例如對(duì)于照射波長的光作為鏡子，但透射發(fā)射波長的光。在一些情況中，利用自立分色鏡可導(dǎo)致光學(xué)偏差和損失。在本發(fā)明中，嵌有分色元件的成形光學(xué)模塊納入照射光學(xué)元件和樣品之間以及收集光學(xué)元件和樣品之間的光學(xué)空間。光學(xué)模塊的折射率通常高于空氣的。折射率較高，給定入射光瞳直徑的檢測(cè)光學(xué)元件收集的發(fā)射光線的比例較高。 此外，分色鏡嵌在光學(xué)模塊內(nèi)，射入該模塊的射線偏離垂直的角度和錐角降低，從而在一些情況中導(dǎo)致更好的分色光譜性能并增加系統(tǒng)靈敏度。包含成形光學(xué)模塊的系統(tǒng)的示意性實(shí)施方式示于圖30。照射(激發(fā))光學(xué)元件 3030引導(dǎo)照射光線3035通過面3001進(jìn)入光學(xué)模塊3000。在所示實(shí)施方式中，照射光線反射離開面3002，該面的區(qū)域3070中用反射材料涂布以增強(qiáng)內(nèi)部反射。然后照射光線反射離開嵌入的分色元件3010，通過面3002進(jìn)入包含多個(gè)反應(yīng)區(qū)域的基片3020，而所述反應(yīng)區(qū)域具有可通過檢測(cè)熒光事件測(cè)量的反應(yīng)。反應(yīng)區(qū)域發(fā)出的光線3045，例如熒光射線通過面 3002進(jìn)入模塊，經(jīng)分色元件3010透射。在所示實(shí)施方式中，基片3020與光學(xué)模塊3000光學(xué)偶聯(lián)以最大程度減少反射損失和偏差。然后發(fā)出的光線通過面3003離開成形光學(xué)模塊， 進(jìn)入收集光學(xué)元件3040。雖然圖30顯示照射光線反射，發(fā)射光線透射，但在一些實(shí)施方式中，嵌入的分色鏡透射照射光線而反射發(fā)射光線。透射照射光線和收集光線的成形光學(xué)模塊各面可以是平面，可以布置成一定角度從而最大程度提高光學(xué)性能。例如，可將各面制成與相關(guān)光具組的主要射線垂直。以此模式，成形模塊可為偏差修正的目的而用作厚的不傾斜平板。在一些實(shí)施方式中，成形光學(xué)模塊的一個(gè)或多個(gè)面可彎曲以使通過該面的光線轉(zhuǎn)向，從而提供透鏡功能?？梢曅枰獙⒏髅鎻澇砂嫉幕蛲沟囊允拐丈涔饩€或發(fā)射光線轉(zhuǎn)向。通常預(yù)計(jì)光學(xué)模塊包含系統(tǒng)的主要光程長度。即，通過該光學(xué)模塊的光程長度是照射光學(xué)元件和基片之間，或收集光學(xué)元件和基片之間總光程長度的至少50%、至少 60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或更多。在一些情況中，至少光學(xué)元件、基片、收集光學(xué)元件或以上的任何組合與折射率高于空氣的材料的成形光學(xué)模塊光學(xué)偶聯(lián)。例如，可利用折射率與成形光學(xué)模塊或另一組件近似匹配的液體、油或聚合物光學(xué)偶聯(lián)各元件。分色元件嵌在成形光學(xué)模塊中，表明分色元件與該模塊光學(xué)接觸，分色元件與光學(xué)模塊之間的空氣空間通常很小或沒有。在一些情況中，分色元件可以是模塑或形成成形光學(xué)模塊。在其它情況中，分色元件可與光學(xué)模塊的各部分偶聯(lián)，例如用液體、油或聚合材料。成形光學(xué)模塊由在感興趣波長下透明的材料制成。該模塊可由，例如玻璃狀氧化物材料制成。該模塊可包含，例如二氧化硅或氟化鈣?？蓳饺胩砑觿┮哉{(diào)節(jié)該模塊的折射率和其它特性。在一些情況中，模塊在感興趣波長下具有約1. 1到約5. 0的折射率是理想的。折射率可以是，例如介于約1. 3到約2. 5或約1. 4到2. 0。雖然在一些情況中，折射率高是理想的，但在一些情況中，材料具有較高折射率易具有較高水平的自身熒光。因此，我們發(fā)現(xiàn)折射率在這些范圍內(nèi)的材料特別有用。模塊優(yōu)選在用于分析的波長范圍具有低水平的自身熒光。分析系統(tǒng)通常利用可見光，例如約400nm到約700nm。還可利用紅外和紫外光。照射光的波長通常與發(fā)射光的波長不同。III.實(shí)施例實(shí)施例1 拋物面鏡基片將基片制造成具有通過金屬層布置的零模式波導(dǎo)，所述金屬層沉積在玻璃基片限定的拋物面元件上。按照?qǐng)D10所示方法和相伴的描述制造裝置，除了未進(jìn)行基片的后續(xù)平整化(步驟V-VII)。利用聚焦離子束(FIB蝕刻方法)通過金屬層制造限定零模式波導(dǎo)核心的孔隙，從而將核心直徑限定為約120nm。掃描電子顯微術(shù)(SEM)下的所得結(jié)構(gòu)示于圖 31A，從該結(jié)構(gòu)的金屬層側(cè)成像。零模式波導(dǎo)的核心顯示為該結(jié)構(gòu)中心頂部的開口。還提供具有零模式波導(dǎo)的比較基片，其截面尺寸大致相同，布置在平面玻璃基片上的平面金屬層中，例如不具有任何拋物面或其它反射結(jié)構(gòu)，如圖31B所示。測(cè)試反射結(jié)構(gòu)對(duì)于傳送到達(dá)或來自零模式波導(dǎo)核心的光線的操作。將熒光染料沉積在兩個(gè)不同波長結(jié)構(gòu)的開放側(cè)，用相同激發(fā)射線照射二者并檢測(cè)發(fā)出的熒光。根據(jù)兩個(gè)比較基片各自的一組零模式波導(dǎo)的平均熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)布置在反射結(jié)構(gòu)上的波導(dǎo)提供的熒光信號(hào)比傳統(tǒng)ZMW的強(qiáng) 6倍，表明整個(gè)系統(tǒng)的收集效率增強(qiáng)。實(shí)施例2 圓錐鏡基片的理論建模分別利用圖32和33所示的各種組件對(duì)結(jié)構(gòu)建模。例如，對(duì)于圖32所示的直圓錐結(jié)構(gòu)，如下所示設(shè)置尺寸dl = 1.25μπι;(12 = 5μπι和h = 4. 69 μ m0該模型假定用于收集基片/反射組件發(fā)出的光線的物鏡具有0. 5的數(shù)值孔徑，相對(duì)于光軸的最高收集角度為 +/-20度，從而相對(duì)于基片底表面提供的收集角度為70-100度。根據(jù)圖32顯示的圓錐模型，反射離開圓錐的射線角度是43. 58(6tr)到105. 52(θ J度。對(duì)于圖33所示的兩個(gè)分段圓錐反射器，直徑設(shè)置為dl = 1.25ym;d2 = 3μπι; d3 = 5ym;hl = Ιμπι;和h2 = 3. 69 μ m。在該情況中，反射并離開反射器的射線角度為 82. 37 ( θ tr)到 116. 06( θ J 度。對(duì)于兩種前述結(jié)構(gòu)方案，物鏡的光子收集效率預(yù)計(jì)為約70 %，相比之下，不包含反射組件，例如布置在透明基片層上的零模式波導(dǎo)的基片的收集效率為約42%，如圖31Β所示，采用數(shù)值孔徑為0. 95的收集物鏡。該分析預(yù)計(jì)因納入微型鏡而改善了光學(xué)性能，但該分析基本上是射線追蹤分析，不包括衍射或波效應(yīng)，因此不提供預(yù)計(jì)性能的完整圖像。還進(jìn)行了利用基于載體的工具進(jìn)行的分析，證實(shí)本發(fā)明微鏡結(jié)構(gòu)的光學(xué)改進(jìn)。實(shí)施例3 利用稀釋支柱在微型鏡結(jié)構(gòu)上產(chǎn)生納米級(jí)反應(yīng)區(qū)域的陣列350°C下，通過LPCVD在熔凝二氧化硅上沉積500nm的多晶鍺層。利用M8nm步進(jìn)器，Lam蝕刻器，寬度從300歷到120-150nm可調(diào)，在多晶鍺中蝕刻出支柱。利用M8nm步進(jìn)器和Centura-MXP蝕刻器蝕刻鏡子。然后在600°C使陣列退火以減少自身熒光并除去有機(jī)污染物的氣體，然后蒸發(fā)鋁和并在濕溶液(30%H202，5(TC)中脫蓋(除去多晶鍺)，而不侵蝕鏡刻面的鋁。圖34顯示SEM顯微照片，其顯示與微型鏡相關(guān)的反應(yīng)區(qū)域陣列一部分。 圖35顯示在頂部具有反應(yīng)區(qū)域的單一微型鏡結(jié)構(gòu)。圖36顯示微型鏡結(jié)構(gòu)頂部的納米級(jí)反應(yīng)區(qū)域。實(shí)施例4 采用犧牲鍺層和硬質(zhì)涂布掩模產(chǎn)生納米級(jí)反應(yīng)區(qū)域依次用多晶鍺層和硬質(zhì)掩模層，例如二氧化硅或氮化硅涂布熔凝二氧化硅基片。 采用照相平板印刷術(shù)限定直徑約380nm的圓形陣列，蝕刻硬質(zhì)掩模以產(chǎn)生具有大致這些尺寸的硬質(zhì)掩模圓盤。然后利用30%過氧化氫水溶液，采用受控過蝕刻蝕刻鍺層以在硬質(zhì)掩模圓盤下產(chǎn)生直徑約200nm的鍺支柱。可通過調(diào)節(jié)條件和材料來控制蝕刻速度。例如，利用未摻雜的多晶-Ge，50°C下30%過氧化氫水溶液的蝕刻速度是約460納米/分鐘，利用摻雜的多晶-Ge，室溫下30%過氧化氫水溶液的蝕刻速度是約200納米/分鐘。將鋁在表面上濺射約IOOnm的厚度。利用過氧化氫水溶液，加熱至約50°C以上除去多晶鍺支柱。SEM 顯微照片證實(shí)在熔凝二氧化硅上的鋁膜中產(chǎn)生200nm-250nm直徑的孔。實(shí)施例5 在熔凝二氧化硅基片上產(chǎn)生圓錐微型鏡結(jié)構(gòu)圖37顯示在熔凝二氧化硅基片上形成的示范性圓錐微型鏡結(jié)構(gòu)的掃描電子顯微照片。圖37 (A)所示圓錐結(jié)構(gòu)頂部的直徑檢測(cè)為約2. 40微米，底層的直徑為約4. 90微米。 圖37(B)所示圓錐結(jié)構(gòu)頂部的直徑檢測(cè)為約1. 68微米，底層的直徑為約4. 18微米。經(jīng)測(cè)定，熔凝二氧化硅基片制成的其它微型鏡結(jié)構(gòu)(未顯示)的頂部直徑/底部直徑/高度約為1. 30/3. 96/3. 45 微米、1. 49/4. 17/3. 18微米、1. 68/4. 34/3. 30微米、2. 79/5. 27/3. 36微米、2. 55/5. 60/3. 23 微米、2. 66/5. 38/3. 72 微米。圖37(C)顯示涂布有鋁的圓錐微型鏡結(jié)構(gòu)，通過該微型鏡結(jié)構(gòu)上的鋁層具有零模式波導(dǎo)孔隙。圖38㈧-(E)顯示在熔凝二氧化硅基片中產(chǎn)生的圓錐結(jié)構(gòu)的SEM顯微照片。圖38 所示結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于，例如圖15所述方法的步驟(II)后的結(jié)構(gòu)。圖39顯示在底部具有孔隙的微型鏡的截面的SEM顯微照片。圖39所示結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于圖15所述方法的步驟(VIII)后形成的結(jié)構(gòu)。在該結(jié)構(gòu)中，平整化層，例如旋涂玻璃圍繞微型鏡結(jié)構(gòu)。圖40顯示在熔凝二氧化硅基片上產(chǎn)生的微型鏡結(jié)構(gòu)的陣列，各結(jié)構(gòu)在頂部具有孔隙。實(shí)施例6 圓錐微型鏡結(jié)構(gòu)的增益檢測(cè)進(jìn)行檢測(cè)以測(cè)定利用與零模式波導(dǎo)偶聯(lián)的微型鏡結(jié)構(gòu)獲得的增益量。利用FuSi 制備基片，其在微型鏡的頂部具有ZMW結(jié)構(gòu)并在基片的平面部分具有相當(dāng)?shù)腪MW結(jié)構(gòu)。圖 41示意性顯示了實(shí)驗(yàn)性裝置，其中光線經(jīng)基片上的ZMW結(jié)構(gòu)透射。用光具組收集經(jīng)ZMW結(jié)構(gòu)透射的光線并用CCD照相機(jī)檢測(cè)。光線檢測(cè)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑是0.5。表1列出了基片平坦區(qū)域上的ZMW結(jié)構(gòu)和微型鏡結(jié)構(gòu)頂部的ZMW結(jié)構(gòu)的代表性檢測(cè)值。從這些檢測(cè)值計(jì)算的增益為約5. 9。應(yīng)該知道檢測(cè)的增益取決于收集光學(xué)元件的數(shù)值孔徑。表1 微型鏡結(jié)構(gòu)增益的檢測(cè)值
權(quán)利要求
1.一種包含微型鏡陣列的基片，其中每個(gè)微型鏡包含零模式波導(dǎo)。
2.一種微型鏡陣列，其包含a)具有上表面的透明基片，該上表面包含多個(gè)特征的陣列，其中所述特征的頂部和側(cè)部包含反射涂層；和b)通過該反射涂層延伸的孔隙的陣列，其中每個(gè)特征的頂部包含至少一個(gè)孔隙，其中特征陣列的壁上的反射涂層使從孔隙陣列中射出的光線轉(zhuǎn)向。
3.如權(quán)利要求2所述的微型鏡陣列，其特征在于，所述特征包括拋物面形、圓錐形或角錐形。
4.如權(quán)利要求2所述的微型鏡陣列，其特征在于，所述特征包括截短的圓錐形。
5.如權(quán)利要求2所述的微型鏡陣列，其特征在于，所述特征包含具有頂部的截短圓錐， 所述頂部的直徑介于約0. 5微米-約5微米之間。
6.如權(quán)利要求2所述的微型鏡陣列，其特征在于，所述特征包含具有頂部的截短圓錐， 所述頂部的直徑介于約1. 5微米-約4微米之間。
7.如權(quán)利要求2所述的微型鏡陣列，其特征在于，所述特征包含具有頂部的截短圓錐， 所述頂部的直徑介于約2微米-約3微米之間。
8.如權(quán)利要求2所述的微型鏡陣列，其特征在于，所述特征包含截短的圓錐，所述圓錐距離垂直的側(cè)壁角度介于5度-40度之間。
9.如權(quán)利要求2所述的微型鏡陣列，其特征在于，所述特征包含截短的圓錐，所述圓錐距離垂直的側(cè)壁角度介于10度-30度之間。
10.一種位于具有頂表面和底表面的透明基片的頂表面上的零模式波導(dǎo)陣列，其中該透明基片包含微型鏡陣列，其中每個(gè)微型鏡使得從所述零模式波導(dǎo)射出的離開所述透明基片底表面的光線轉(zhuǎn)向。
11.一種檢測(cè)零模式波導(dǎo)陣列中的分子事件的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含a)布置在具有頂表面和底表面的透明基片的頂表面上的零模式波導(dǎo)陣列，其中所述透明基片包含用于使光線轉(zhuǎn)向所述零模式波導(dǎo)的微型鏡陣列；和b)通過所述透明基片的底表面對(duì)所述零模式波導(dǎo)提供照射光束的照射系統(tǒng)；其中將所述系統(tǒng)設(shè)置成所述微型鏡與所述照射光束相互作用從而所述照射光束經(jīng)歷相長干涉，藉此所述零模式波導(dǎo)處的光的強(qiáng)度相對(duì)于其它照射區(qū)域增加了。
12.—種產(chǎn)生包含微型鏡陣列的基片的方法，其中每個(gè)微型鏡與零模式波導(dǎo)相關(guān)聯(lián)，所述方法包括a)提供具有頂表面的透明基片；b)使該透明基片形成圖案并作蝕刻以形成具有頂部和側(cè)部的突起陣列；c)沉積包覆材料以使所述突起的頂部包含包覆層；d)通過該包覆層形成孔隙陣列以使每個(gè)突起的頂部包含孔隙；和e)沉積反射沉積材料以使每個(gè)突起的側(cè)部包含反射層；藉此該突起陣列包含微型鏡陣列，而每個(gè)突起的頂部的孔隙包含零模式波導(dǎo)。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，使透明基片形成圖案并作蝕刻的步驟b) 是在沉積包覆材料和形成孔隙陣列的步驟c)和d)之后進(jìn)行的。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，沉積包覆材料和形成孔隙陣列的步驟c)和d)是在使透明基片形成圖案并作蝕刻的步驟b)之后進(jìn)行的。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述透明基片包含二氧化硅基材料。
16.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述透明基片包含熔凝二氧化硅。
17.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述包覆材料包含鋁。
18.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述反射沉積材料包含鋁。
19.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，蝕刻透明基片包括活性離子蝕刻方法。
20.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述突起包括圓錐形、角錐形或拋物面形。
21.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述突起包括截短的圓錐形。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，截短圓錐頂部的直徑介于1微米和10微米之間。
23.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述基片上的突起數(shù)介于1，000和 1,000，000 之間。
24.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述基片上的突起數(shù)介于 10，000-500，000 之間。
25.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，包括以下步驟a)提供具有頂表面的透明基片，在該頂表面上布置了具有孔隙陣列的金屬包覆層；b)在該包覆層上沉積第一抗蝕層；c)使該第一抗蝕層形成圖案以產(chǎn)生剩余抗蝕層的區(qū)域陣列，剩余抗蝕層的各區(qū)域包含含有孔隙的金屬包覆層區(qū)域；d)蝕刻以除去包覆層和透明基片的區(qū)域，藉此形成突起陣列，藉此包含金屬包覆層的區(qū)域的剩余抗蝕層的區(qū)域位于突起的頂部；e)沉積金屬沉積層，藉此金屬沉積層與突起頂部的金屬包覆層的區(qū)域接觸；f)沉積第二抗蝕層；g)使該第二抗蝕層形成圖案以露出突起頂部的金屬沉積層的區(qū)域；和h)處理來自步驟(g)的結(jié)構(gòu)藉此以除去金屬沉積層的露出區(qū)域。
26.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，包括以下步驟a)提供具有頂表面的透明基片，在該頂表面上布置了具有孔隙陣列的金屬包覆層；b)在該金屬包覆層上沉積保護(hù)涂層；c)在該保護(hù)層上沉積第一抗蝕層；d)使第一抗蝕層形成圖案以產(chǎn)生剩余抗蝕層的區(qū)域陣列，剩余抗蝕層的各區(qū)域包含含有孔隙的金屬包覆層區(qū)域；e)蝕刻以除去保護(hù)層、包覆層和透明基片的區(qū)域，藉此形成突起陣列，藉此包含金屬包覆層的區(qū)域的剩余抗蝕層的區(qū)域位于突起的頂部；f)除去第一抗蝕層；g)沉積金屬沉積層，藉此金屬沉積層與突起頂部的金屬包覆層的區(qū)域接觸；h)沉積第二抗蝕層；i)使該第二抗蝕層形成圖案以露出突起頂部的金屬沉積層的區(qū)域；和j)處理來自步驟(i)的結(jié)構(gòu)藉此除去金屬沉積層的露出區(qū)域并除去保護(hù)涂層。
27.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，包括以下步驟a)提供具有頂表面的透明基片，在該頂表面上布置了具有孔隙陣列的金屬包覆層；b)在該金屬包覆層上沉積犧牲層；c)在該犧牲層上沉積第一抗蝕層；d)使第一抗蝕層形成圖案以產(chǎn)生剩余抗蝕層的區(qū)域陣列，剩余抗蝕層的各區(qū)域包含含有孔隙的金屬包覆層的區(qū)域；e)蝕刻以除去犧牲層、包覆層和透明基片的區(qū)域，藉此形成突起陣列，藉此包含金屬包覆層的區(qū)域的剩余抗蝕層的區(qū)域位于突起的頂部；f)除去第一抗蝕層；g)處理該基片以向后拉犧牲層；h)沉積金屬沉積層，藉此金屬沉積層與突起頂部的金屬包覆層的區(qū)域接觸；i)處理來自步驟(h)的結(jié)構(gòu)以釋放犧牲層，藉此除去犧牲層上的金屬沉積層的多個(gè)部分并露出孔隙。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于，所述犧牲層包含鍺或硅。
29.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，包括以下步驟a)提供具有頂表面的透明基片，在該頂表面上布置了具有孔隙陣列的金屬包覆層；b)在該金屬包覆層上沉積保護(hù)層；c)在該保護(hù)層上沉積第一抗蝕層；d)使第一抗蝕層形成圖案以產(chǎn)生剩余抗蝕層的區(qū)域陣列，剩余抗蝕層的各區(qū)域包含含有孔隙的金屬包覆層的區(qū)域；e)蝕刻以除去保護(hù)層、包覆層和透明基片的區(qū)域，藉此形成突起陣列，藉此包含金屬包覆層的區(qū)域的剩余抗蝕層的區(qū)域位于突起的頂部；f)除去第一抗蝕層和保護(hù)層；g)在突起的頂部產(chǎn)生支柱陣列，至少部分地覆蓋金屬包覆層的區(qū)域；h)沉積金屬沉積層，藉此金屬沉積層與突起頂部的金屬包覆層的區(qū)域接觸；和i)處理來自步驟(h)的結(jié)構(gòu)以除去支柱陣列，藉此除去金屬沉積層的一部分。
30.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，包括以下步驟a)提供具有頂表面的透明基片；b)在該透明基片上沉積第一抗蝕層；c)使第一抗蝕層形成圖案以產(chǎn)生剩余抗蝕層的區(qū)域陣列；d)蝕刻以除去透明基片的區(qū)域，藉此形成突起陣列，藉此剩余抗蝕層的區(qū)域位于突起的頂部；e)除去第一抗蝕層；f)在該透明基片上沉積金屬沉積層；g)在該金屬沉積層上沉積硬涂層；h)打磨該硬涂層的表面以露出與突起的頂部相對(duì)應(yīng)的透明基片的多個(gè)部分；i)沉積金屬包覆層；j)在該金屬包覆層上沉積抗蝕層；和k)使該抗蝕層形成圖案并蝕刻該包覆層以在突起的頂部產(chǎn)生孔隙陣列。
31.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，權(quán)利要求1的步驟c)和e)被組合起來， 包括a)在透明基片上沉積犧牲層；b)通過選擇性地蝕刻該犧牲層產(chǎn)生納米支柱陣列；c)使該透明基片形成圖案并作蝕刻以形成具有頂部和側(cè)部的突起陣列，其中所述納米支柱位于突起頂部；d)在步驟c)產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)上沉積金屬層；e)在該金屬層上沉積平整化層；f)使該平整化層平整化以露出突起頂部的金屬層并露出納米支柱；和g)處理該基片以除去所述納米支柱，藉此在突起頂部形成孔隙陣列。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述犧牲層包含鍺或硅。
33.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述平整化層包含PECVD氧化物或旋涂玻^^ ο
34.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，平整化包括CMP。
35.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，金屬層包含鋁。
36.一種測(cè)量零模式波導(dǎo)陣列中的分子事件的方法，該方法包括a)提供布置在具有頂表面和底表面的透明基片的頂表面上的零模式波導(dǎo)陣列，其中所述透明基片包含用于使光線轉(zhuǎn)向零模式波導(dǎo)的微型鏡陣列；和b)利用照射光束的陣列通過所述透明基片的底表面來照射零模式波導(dǎo)；其中所述照射光束與所述微型鏡相互作用從而所述照射光束經(jīng)歷相長干涉，藉此所述零模式波導(dǎo)處的光的強(qiáng)度相對(duì)于沒有相長干涉的光的強(qiáng)度增大了。
37.一種分析單分子特性的方法，包括a)將具有光學(xué)特征的單分子置于零模式波導(dǎo)的孔隙內(nèi)，其中所述零模式波導(dǎo)光學(xué)地耦合到微型鏡；b)用照射光線來照射所述零模式波導(dǎo)；c)用檢測(cè)器收集從所述零模式波導(dǎo)中射出的光線，其中所述微型鏡使得射出的光線中的至少一些轉(zhuǎn)向所述檢測(cè)器；和d)利用收集到的射出光線來確定所述單分子的特性。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述零模式波導(dǎo)與微型鏡均被包括到單個(gè)基片中。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述基片包含零模式波導(dǎo)的陣列，每個(gè)零模式波導(dǎo)光學(xué)地耦合到微型鏡。
40.一種確定關(guān)于模板核酸分子的序列信息的方法，包括a)將聚合酶、模板核酸分子和引物置于零模式波導(dǎo)內(nèi)，其中所述零模式波導(dǎo)被包括到基片中，所述基片還包含微型鏡，b)提供用于聚合的核苷酸、試劑和輔因子，其中用于聚合的核苷酸、試劑和輔因子可接近聚合酶，其中聚合酶、模板核酸分子、引物或核苷酸中的至少一個(gè)包含光學(xué)標(biāo)記物；c)提供使所述聚合酶通過摻入核苷酸來合成延伸核酸鏈的條件；d)用照射光線照射所述零模式波導(dǎo)從而與所述光學(xué)標(biāo)記物相互作用；e)用檢測(cè)器收集從所述零模式波導(dǎo)中射出的光線，其中所述微型鏡使得射出的光線中的至少一些轉(zhuǎn)向所述檢測(cè)器；和f)利用收集到的射出光線來確定關(guān)于所述模板核苷酸的序列信息。
41. 一種用于觀察從基片中射出的光線的光學(xué)系統(tǒng)，包括a)成形光學(xué)模塊，該成形光學(xué)模塊中嵌入了分色元件并具有至少第一面、第二面及第b)照射光學(xué)元件，被布置成將照射光線通過第一面送入光學(xué)模塊，其中此類照射光線通過第二面反射離開所嵌入的分色元件并到達(dá)包含光發(fā)射元件的基片上；和c)收集光學(xué)元件，被布置成收集從所述光發(fā)射元件中射出的光線，其中所述光發(fā)射元件中射出的光線經(jīng)過第二面，經(jīng)過所述分色元件，離開第三面，并進(jìn)入所述收集光學(xué)元件。
42.如權(quán)利要求41所述的光學(xué)系統(tǒng)，其特征在于，照射光經(jīng)內(nèi)部反射離開成形光學(xué)模塊的面，到達(dá)所述分色元件上。
43.如權(quán)利要求42所述的光學(xué)系統(tǒng)，其特征在于，光線反射離開所述第二面。
44.如權(quán)利要求41所述的光學(xué)系統(tǒng)，其特征在于，第一、第二和第三面基本上是平面。
45.如權(quán)利要求41所述的光學(xué)系統(tǒng)，其特征在于，所述光發(fā)射元件包括熒光元件。
46.如權(quán)利要求41所述的光學(xué)系統(tǒng)，其特征在于，所述基片包含反應(yīng)區(qū)域陣列，其中至少一些包含光發(fā)射元件。
47.如權(quán)利要求46所述的光學(xué)系統(tǒng)，其特征在于，所述基片包含ZMW陣列。
48.如權(quán)利要求41所述的光學(xué)系統(tǒng)，其特征在于，所述照射光學(xué)元件包含至少一個(gè)激光和照射光具組。
49.如權(quán)利要求41所述的光學(xué)系統(tǒng)，其特征在于，收集光學(xué)系統(tǒng)包含收集光具組，用于將發(fā)射的光線傳送到檢測(cè)器。
50.如權(quán)利要求41所述的光學(xué)系統(tǒng)，其特征在于，光學(xué)模塊包含折射率介于1.3和2. 5 之間的材料。
51.如權(quán)利要求41所述的光學(xué)系統(tǒng)，其特征在于，光學(xué)模塊包含二氧化硅或氟化鈣。
52.一種光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，包括基片，在所述基片上布置了多個(gè)空間上不同的反應(yīng)區(qū)域；聚焦光學(xué)元件，被安置在反應(yīng)區(qū)域與光學(xué)系統(tǒng)之間以便至少部分地校準(zhǔn)來自每個(gè)不同的反應(yīng)區(qū)域的光學(xué)信號(hào)；和光學(xué)系統(tǒng)，被安置成將激發(fā)光線引向布置在所述基片上的多個(gè)不同的反應(yīng)區(qū)域并接收從這些區(qū)域發(fā)出的光學(xué)信號(hào)。
53.如權(quán)利要求52所述的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述聚焦光學(xué)元件被集成到所述基片中或連接于所述基片。
54.如權(quán)利要求52所述的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述聚焦光學(xué)元件包含被集成到所述基片中的多個(gè)反射光學(xué)元件，各反射光學(xué)元件被安置成至少部分地校準(zhǔn)來自基片上分離的不同的反應(yīng)區(qū)域的光線。
55.如權(quán)利要求M所述的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述反射光學(xué)元件選自拋物面鏡、圓錐鏡、分段圓錐鏡、截短圓錐鏡、偏拋物面鏡、梯形鏡和角錐鏡。
56.如權(quán)利要求52所述的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，所述聚焦光學(xué)元件包含被集成到所述基片中或連接于所述基片的多個(gè)透鏡元件，所述多個(gè)透鏡元件中的每一個(gè)被安置成至少部分地校準(zhǔn)來自所述基片上的分離的不同的反應(yīng)區(qū)域的光線。
57.如權(quán)利要求52所述的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，多個(gè)空間上不同的反應(yīng)區(qū)域按每平方厘米至少100，000個(gè)不同的反應(yīng)區(qū)域的密度被布置在所述基片的表面上。
58.如權(quán)利要求52所述的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，光學(xué)系統(tǒng)被設(shè)置成將激發(fā)光線引向所述基片上的至少10，000個(gè)不同的反應(yīng)區(qū)域并分別接收來自這些區(qū)域的光學(xué)信號(hào)。
59.如權(quán)利要求52所述的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，光學(xué)系統(tǒng)被設(shè)置成將激發(fā)光線引向所述基片上的至少50，000個(gè)不同的反應(yīng)區(qū)域并分別接收來自這些區(qū)域的光學(xué)信號(hào)。
60.如權(quán)利要求52所述的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，光學(xué)系統(tǒng)被設(shè)置成將激發(fā)光線引向所述基片上的至少100，000個(gè)不同的反應(yīng)區(qū)域并分別接收來自這些區(qū)域的光學(xué)信號(hào)。
61.如權(quán)利要求52所述的光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，其特征在于，光學(xué)系統(tǒng)包含物鏡和分色鏡，所述物鏡被安置成收集來自所述基片上的不同的反應(yīng)區(qū)域的光學(xué)信號(hào)，所述分色鏡被安置在所述基片和物鏡之間，所述分色鏡能透射來自所述基片的光學(xué)信號(hào)并反射激發(fā)光線，從而使得所述激發(fā)光線基本上不經(jīng)所述物鏡而透射。
62.一種分析基片上的多個(gè)不同的反應(yīng)區(qū)域的方法，包括 提供其上具有多個(gè)不同的反應(yīng)區(qū)域的基片；提供被集成到所述基片中或連接于所述基片的聚焦光學(xué)元件，所述聚焦光學(xué)元件分別至少部分地校準(zhǔn)來自每個(gè)不同的反應(yīng)區(qū)域的光學(xué)信號(hào)；照射多個(gè)不同的反應(yīng)區(qū)域以產(chǎn)生與所述反應(yīng)區(qū)域中的反應(yīng)相關(guān)的光學(xué)信號(hào)；和將所述聚焦光學(xué)元件校準(zhǔn)過的光學(xué)信號(hào)傳輸至檢測(cè)器以檢測(cè)這些信號(hào)。
63.一種分析系統(tǒng)，其包括基片，在所述基片上布置有多個(gè)空間上分立的反應(yīng)區(qū)域； 激發(fā)照射源； 光學(xué)檢測(cè)器陣列； 光具組，其包括多路照射路徑，該路徑含有多路光學(xué)元件和切換光學(xué)元件，所述多路光學(xué)元件將來自激發(fā)照射源的光束轉(zhuǎn)變成多個(gè)照射點(diǎn)，所述切換光學(xué)元件交替引導(dǎo)這些照射點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)多個(gè)信號(hào)源的第一部分和多個(gè)反應(yīng)區(qū)域的至少第二部分；和信號(hào)收集路徑，用于收集從多個(gè)反應(yīng)區(qū)域中發(fā)出的信號(hào)并將這些信號(hào)引導(dǎo)至光學(xué)檢測(cè)器陣列上的空間分立的位置。
64.一種分析系統(tǒng)，其包括其上布置有多個(gè)空間上分立的反應(yīng)區(qū)域的基片； 激發(fā)照射源； 光學(xué)檢測(cè)器陣列；和光具組，其包括含有多路光學(xué)元件的多路照射路徑，所述多路光學(xué)元件將來自激發(fā)照射源的光束轉(zhuǎn)變成多個(gè)照射點(diǎn)并引導(dǎo)這些照射點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)多個(gè)反應(yīng)區(qū)域；和用于收集從多個(gè)反應(yīng)區(qū)域中發(fā)出的信號(hào)的信號(hào)收集路徑，其中所述信號(hào)收集路徑包含切換光學(xué)元件，所述切換光學(xué)元件將來自所述反應(yīng)區(qū)域的第一部分的信號(hào)引導(dǎo)至光學(xué)檢測(cè)器陣列上的空間上分立的位置的第一部分，并將來自反應(yīng)區(qū)域的第二部分的信號(hào)引導(dǎo)至檢測(cè)器陣列上的空間上分立的區(qū)域的第二部分。
65.一種分析基片上的高度多路反應(yīng)區(qū)域的系統(tǒng)，其包括 其上布置有多個(gè)分立的反應(yīng)區(qū)域的基片；檢測(cè)系統(tǒng)，用于檢測(cè)與分立的反應(yīng)區(qū)域相關(guān)的光學(xué)信號(hào)，其包括 至少第一和第二檢測(cè)器；和光具組，所述光具組被設(shè)置成將與基片上的第一組分立的反應(yīng)區(qū)域相關(guān)的光學(xué)信號(hào)引導(dǎo)至第一檢測(cè)器并且將與基片上的第二組分立的反應(yīng)區(qū)域相關(guān)的光學(xué)信號(hào)引導(dǎo)至第二檢測(cè)器。
66.一種分析基片上的多個(gè)分立的反應(yīng)區(qū)域中的感興趣的反應(yīng)的方法，包括 提供其上布置有第一組反應(yīng)區(qū)域的基片；識(shí)別出比所有第一組的反應(yīng)區(qū)域少且表現(xiàn)出感興趣的反應(yīng)的反應(yīng)區(qū)域子組；和僅在該反應(yīng)區(qū)域子組中監(jiān)測(cè)感興趣的反應(yīng)。
全文摘要
揭示了用于超高多路分析分立的反應(yīng)的設(shè)備、系統(tǒng)和方法，同時(shí)降低了光學(xué)噪聲并增加了系統(tǒng)靈活性。這種設(shè)備包括具有集成光學(xué)元件的基片，通過增加反應(yīng)區(qū)域密度、改善光線到分立的反應(yīng)區(qū)域的透射或改善來自分立的反應(yīng)區(qū)域的光線的收集中的一種或多種來增加多路分析能力。集成光學(xué)元件包括反射光學(xué)元件，用于使照射光線和從分立的區(qū)域發(fā)出的光線轉(zhuǎn)向從而更有效地收集所發(fā)出的光線。尤其優(yōu)選的應(yīng)用包括單分子反應(yīng)分析，例如聚合酶介導(dǎo)的模板依賴性核酸合成和序列測(cè)定。
文檔編號(hào)G02B6/12GK102227659SQ200980148101
公開日2011年10月26日 申請(qǐng)日期2009年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月30日
發(fā)明者A·格羅特, A·魯利森, D·扎卡里, P·倫奎斯特, P·莫納德杰米, P·趙, R·薩克希納, S·特納, 鐘誠, 黃雁樵 申請(qǐng)人:加利福尼亞太平洋生物科學(xué)股份有限公司