專利名稱：一種降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境污染生物修復(fù)領(lǐng)域，涉及一種降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氰氟草酯(cyhalofop-butyl)是一種芳氧苯氧羧酸酯類除草劑，由美國陶氏公司(Dow Elanw Co. Ltd) 1987年首先開發(fā),化學(xué)名稱為(R) _2_[4 (4-氰基-2-氟苯氧基)苯氧基]-丙酸丁酯，分子式為C2tlH2tlFNCV氰氟草酯在極低劑量即對雜草呈很高活性和選擇性，尤其對稗草、千金子、看麥娘、小康草等有卓越的效果，具有較好的發(fā)展前景，在我國的應(yīng)用日益廣泛。但是，隨著該類除草劑的長期大量使用，其在環(huán)境中的遷移、轉(zhuǎn)化和分解等環(huán)境行為正受到日益關(guān)注。 氰氟草酯在我國得到廣泛應(yīng)用的同時，其在土壤和水體中的殘留導(dǎo)致的環(huán)境污染問題也日趨嚴(yán)重，有以下幾方面的危害(I)氰氟草酯隨生產(chǎn)廢水、農(nóng)業(yè)灌溉水和雨水縱向和橫向擴(kuò)散，造成地表水和地下水污染；(2)氰氟草酯及其芳烴代謝產(chǎn)物對哺乳動物和人體健康具有較大的危害；(3) 土壤中氰氟草酯殘留對下茬作物產(chǎn)生藥害，使下茬作物死亡或減產(chǎn)，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失；(4)氰氟草酯對一些水生生物毒性較高，水體中的氰氟草酯殘留會導(dǎo)致土壤和水體生物多樣性降低，危及水生生物安全。微生物降解修復(fù)技術(shù)是近幾十年才興起的一種新型的環(huán)境污染修復(fù)技術(shù)。該技術(shù)和物理化學(xué)方法相比，具有很多無可比擬的優(yōu)點，如處理效果好，適合有毒有害有機(jī)污染物大面積面源污染的降解修復(fù)，修復(fù)費用較低(僅為傳統(tǒng)化學(xué)、物理修復(fù)經(jīng)費的10%左右)，不產(chǎn)生二次污染等。在國內(nèi)外，生物修復(fù)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于石油、化工和農(nóng)藥殘留有機(jī)污染的清除。但到目前為止還未見氰氟草酯殘留污染生物修復(fù)技術(shù)專利的研究和應(yīng)用報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一株降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌。本發(fā)明的另一目的是提供含有該細(xì)菌的菌劑。本發(fā)明的又一目的是提供該細(xì)菌的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)一種降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌Aquamicrobium lusatiense JW_1,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號為=CCTCC NO M 2012297，保藏日期為2012年7月20日。該菌的主要生物學(xué)特性為G_，菌體為短桿狀，大小為O. 5-1. 0X1. 0-1. 5 μ m ;菌落表面光滑，有光澤，邊緣整齊，隆起，呈淡黃色。氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原、檸檬酸利用反應(yīng)為陽性；甲基紅試驗、脂酶反應(yīng)、V. P.反應(yīng)、M. R反應(yīng)、吲哚反應(yīng)為陰性；不能水解淀粉。一種含有所述的菌種保藏號為CCTCC NO M 2012297的降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌JW-I的降解菌劑。該菌劑可通過試管斜面種一搖瓶種一種子罐一生產(chǎn)罐一產(chǎn)品(包裝劑型為液體菌劑或固體吸附菌劑)的生產(chǎn)工藝制備得到。所述的菌種保藏號為CCTCC NO M 2012297的降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌JW-I在降解水體和/或土壤中的除草劑氰氟草酯殘留的應(yīng)用。所述的含有菌種保藏號為CCTCC NO M 2012297的降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌JW-I的菌劑在降解水體和/或土壤中的除草劑氰氟草酯殘留的應(yīng)用。
有益效果本發(fā)明提供了一株降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌JW-I (CCTCC NO M 2012297)，由該細(xì)菌制備的菌劑對氰氟草酯降解效率高達(dá)到95%以上，降解速度快，消除農(nóng)產(chǎn)品中除草劑氰氟草酯殘留，可用于降解土壤和水體中除草劑氰氟草酯殘留，解決除草劑氰氟草酯對對土壤水體環(huán)境的危害問題。


圖I菌株JW-I在含氰氟草酯的LB平板上形態(tài)。圖2菌株JW-I的透射電鏡照片。圖3菌株JW-I以氰氟草酯為唯一碳源生長及對氰氟草酯的降解情況菌種保藏信息細(xì)菌JW-1,分類命名為Aquamicrobium lusatiense JW-1,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國，武漢，武漢大學(xué)，菌種保藏號為=CCTCC NO M 2012297,保藏日期為2012年7月20日。
具體實施例方式實施例I菌種分離純化和鑒定取3g生產(chǎn)氰氟草酯的農(nóng)藥廠生化污泥于IOOmL含50mg/L氰氟草酯基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，震蕩搖勻，30°C、180rpm搖床培養(yǎng)，每隔7d以5%接種量轉(zhuǎn)接至新的含氰氟草酯的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，按同樣的培養(yǎng)富集方式轉(zhuǎn)接5代，氰氟草酯的濃度每次轉(zhuǎn)接提高10mg/L，逐漸提高到100mg/L。富集培養(yǎng)液經(jīng)紫外檢測有降解效果后，對富集液進(jìn)行稀釋，并分別在含100mg/L的氰氟草酯基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基平板上接入0. IOmL稀釋富集液涂布，30°C烘箱培養(yǎng).待平板上出現(xiàn)菌落后，挑取有透明圈的菌落劃線3次進(jìn)行純化，純化后取單菌于LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接至含氰氟草酯100mg/L的基礎(chǔ)鹽液體中，30°C、180rpm搖床培養(yǎng)，驗證純菌的降解效果。經(jīng)過富集分離純化，從生產(chǎn)氰氟草酯的農(nóng)藥廠生化污泥中分離獲得I株氰氟草酯降解菌，命名為JW-I，該菌能在含氰氟草酯100mg/L的基礎(chǔ)鹽液體培養(yǎng)基中降解氰氟草酯，降解率約為99. 5%。同時，菌株JW-I可在含氰氟草酯的LB平板上因?qū)⑺苄缘偷那璺蒗ソ到鉃樗苄愿叩慕到猱a(chǎn)物而形成透明圈(圖I)。以菌株JW-I的基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rRNA通用引物(27f和1452r)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度約為1400bp的16S rRNA基因序列。在RDP數(shù)據(jù)庫(https://rdp.cme. msu. edu/)中進(jìn)行 Blast,結(jié)果表明菌株 JW-I 與 Aquamicrobium lusatiense 屬菌株的同源性最近，同源性大于99%。菌株JW-I在LB固體培養(yǎng)基上生長Id后，菌落表面光滑，有光澤，邊緣整齊，隆起，呈淡黃色，經(jīng)過負(fù)染，在透射電子顯微鏡下該菌呈桿狀，單極生鞭毛，無莢膜，不形成芽孢(圖2)。G_，菌體為短桿狀，大小為O. 5-1. OX I. 0-1. 5 μ m。氧化酶、接觸酶、硝酸鹽還原、檸檬酸利用反應(yīng)為陽性；甲基紅試驗、脂酶反應(yīng)、V. P.反應(yīng)、M. R反應(yīng)、吲哚反應(yīng)為陰性；不能水解淀粉、尿素和TW80。菌株JW-I的形態(tài)和生理生化特征和Bergey’ smanual of systematic bacteriology 上對 Aquamicrobium lusatiense 的描述是一致的。結(jié)合形態(tài)、生理生化特征和16S rRNA同源性分析,將菌株JW-I鑒定為Aquamicrobiumlusatiense。本實施例中所涉及的培養(yǎng)基配方如下LB培養(yǎng)基蛋白胨10.0g/L，酵母膏5.0g/L，NaCl 10. Og/L，去離子水加至lOOOmL。固體LB培養(yǎng)基加入I. 5%的瓊脂粉?；A(chǔ)鹽培養(yǎng)基(MM)=NH4NO3 I. Og/L, K2HPO4 I. 5g/L, KH2PO4 O. 5g/L, NaCl O. 5g/L,MgSO4O. 2g/L，去離子水加至 lOOOmL，pH=7. 0。
·
固體基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基加入I. 5%的瓊脂粉。富集選擇培養(yǎng)基在IOOmL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入一定量的氰氟草酯原藥作為唯一碳源進(jìn)行選擇培養(yǎng)。富集基質(zhì)采用江蘇揚州某生產(chǎn)氰氟草酯的農(nóng)藥廠生化污泥。氰氟草酯原藥購自江蘇揚州某農(nóng)藥廠(純度為99%)，按所需濃度添加到培養(yǎng)基中。甲醇(色譜純)購自西格瑪奧德里奇公司。其它化學(xué)試劑為分析純，購自上海化學(xué)試劑有限公司。實施例2氰氟草酯降解菌劑的制備I.將菌株JW-I (CCTCC NO M 2012297)試管種接種于肉湯蛋白胨培養(yǎng)基搖瓶中，200rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期；2.將上述培養(yǎng)好的菌種按種子罐培養(yǎng)基的10%接種量(v/v)接入500升種子罐，種子罐裝液量為400升，培養(yǎng)至對數(shù)生長期，種子罐所用的培養(yǎng)基配方(質(zhì)量百分比)葡萄糖 I. 0%, NH4NO3 0. 8%, K2HPO4 0. 3%, MgSO4 0. 05%, FeSO4 0. 01%, NaCl 0. 5%, CaCO3 0. 3%, W-母膏 0. 5%, pH 值 7. 2-7. 5 ；3.將種子液按生產(chǎn)罐培養(yǎng)基的10wt%接種量接入5噸的生產(chǎn)罐培養(yǎng)，裝液量為4噸，生產(chǎn)罐所用培養(yǎng)基與種子罐培養(yǎng)基相同；在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣比為I :0. 5，攪拌速度為180-240轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)溫度為30°C，整個工藝流程培養(yǎng)時間為36小時。發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到10億個/ml以上，發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐直接用塑料包裝桶或包裝瓶分裝成液體劑，或采用泥炭吸附用包裝袋分裝成固體菌劑劑型。實施例3氰氟草酯降解菌劑對氰氟草酯殘留的降解效果在基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中加入終濃度為100mg/L的氰氟草酯，1%的接種量接入實施例2制備的菌株JW-I (CCTCC NO M 2012297)菌液，設(shè)接種滅活的菌株JW-1 (CCTCC NO M2012297)為對照。每隔Id定時取樣檢測菌株的生長情況和氰氟草酯的降解情況，結(jié)果見圖
3。菌株JW-I (CCTCC NO M 2012297)在5d內(nèi)對氰氟草酯的降解率達(dá)到99. 2%。同時，在氰氟草酯的降解過程中，培養(yǎng)液的菌體量也隨著氰氟草酯的降解而增加，5d內(nèi)菌株量從接種時 I. 5X IO6Cfumr1 增加到約 I. IXlO7Cfu mL_1 ;表明菌株 Jff-I (CCTCC NO M 2012297)在基本完全降解氰氟草酯的同時，能夠利用氰氟草酯作為碳源生長。實施例4菌株JW-I對土壤中氰氟草酯殘留的降解效果
Jff-I (CCTCC NO M 2012297)對土壤中除草劑氰氟草酯殘留降解效果測定在IOOOg 土壤中加入氰氟草酯，使土壤中含藥濃度為10mg/kg，加入實施例2制備的JW-I菌液，混勻，置于30°C培養(yǎng)箱中黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，定時取樣測定氰氟草酯在土壤中的殘留量，同時設(shè)置不接菌的對照。結(jié)果見表1，表I中數(shù)據(jù)表明在不接菌的對照土壤中，氰氟草酯殘留濃度在第一天下降了 21. 2%，可能是由于土壤吸附的原因，而非氰氟草酯被降解，在此后的十多天里下降十分緩慢。而接種了降解菌JW-I (CCTCC NO M 2012297)的土壤，氰氟草酯殘留濃度在第一天下降了 25. 1%，在此后的幾天下降非常迅速，到第15天氰氟草酯殘留濃度降解率達(dá)到95. 6%。表I菌株JW-I (CCTCC NO M 2012297)在土壤中對氰氟草酯殘留解效果
權(quán)利要求
1.一種降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌Aquamicrobium lusatiense JW_1,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號為=CCTCC NO M 2012297，保藏日期為2012年7月20日。
2.一種含有權(quán)利要求I所述的降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌JW-I的降解菌劑。
3.權(quán)利要求I所述的降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌JW-I在降解水體和/或土壤中的除草劑氰氟草酯殘留的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的含有降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌JW-I的菌劑在降解水體和/或土壤中的除草劑氰氟草酯殘留的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于環(huán)境污染生物修復(fù)領(lǐng)域，公開了一種降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌及其應(yīng)用。一種降解除草劑氰氟草酯的細(xì)菌Aquamicrobium lusatiense JW-1，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，菌種保藏號為CCTCC NOM2012297，保藏日期為2012年7月20日。由該細(xì)菌制備的菌劑對氰氟草酯降解效率高達(dá)到95％以上，降解速度快，消除農(nóng)產(chǎn)品中除草劑氰氟草酯殘留，可用于降解土壤和水體中除草劑氰氟草酯殘留，解決除草劑氰氟草酯對對土壤水體環(huán)境的危害問題。
文檔編號A62D101/04GK102827799SQ20121034276
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月14日
發(fā)明者顧立鋒, 顧子衡, 蔣子才 申請人:江蘇碧諾環(huán)?？萍加邢薰?br>