專利名稱：用于處理油脂污染物的脂肪酶、編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于處理油脂污染物的脂肪酶、編碼基因及其在微生物法水解處理油脂污染物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，環(huán)境中油脂類物質(zhì)造成的污染日益嚴(yán)重，已成為一個(gè)亟待解決的環(huán)境問題。含油廢水是一種量大而面廣的污染源。隨著人們生活質(zhì)量的提高和環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)， 油脂的污染問題越來越受到人們的關(guān)注。目前油脂污染物常用的處理方法主要有物理法和化學(xué)法，但無法徹底消除廢水中的油脂，而且易造成二次污染。生物法是處理油脂污染物的一種最有效、最安全和最徹底的方法。脂肪酶(Lipase，甘油酯水解酶)是一種特殊的水解酶，能夠水解非水溶性酯類物質(zhì)，如長鏈三酸甘油酯(脂肪)。脂肪酶的一個(gè)最顯著的特點(diǎn)是它能特異性地在油-水兩相界面上將脂肪水解為脂肪酸和甘油。近年來，對(duì)于脂肪酶的分子生物學(xué)研究在不斷深入，到目前為止已克隆了很多脂肪酶基因，測(cè)定了它們的核苷酸序列，部分脂肪酶的蛋白晶體結(jié)構(gòu)也已經(jīng)研究清楚 (Winkler F K, Arcy AD et al. 1990 ；Brady L，1991)。大量文獻(xiàn)報(bào)道了利用大腸桿菌(Escherichia coli)和畢赤酵母(Pichia Piastoris)等表達(dá)體系表達(dá)脂肪酶基因，Brocca等合成了全長為1647個(gè)堿基的經(jīng)過密碼子優(yōu)化的Iipl基因，實(shí)現(xiàn)了其在畢赤酵母(Pichia pastoris)中的異源高效表達(dá)，產(chǎn)酶量高達(dá) 150U/ml (Brocca S, et al. 1998)。Pfeffer 等在 Escherichia coli Origami B 中采用一系列優(yōu)化策略表達(dá) Candidaantarctica 脂肪酶 A(CalA) (Pfeffer J, et al. 2007)。從自然界中篩選到的產(chǎn)脂肪酶野生菌，其脂肪酶基因一般受宿主菌的嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控， 表達(dá)的脂肪酶滿足自身的代謝即可；而市場(chǎng)導(dǎo)向要求高效表達(dá)以提高脂肪酶產(chǎn)量。大量微生物脂肪酶基因的克隆與重組表達(dá)為市場(chǎng)需求提供了可保障的酶源，但是原有脂肪酶基因的表達(dá)效率仍然不高，是脂肪酶大量應(yīng)用的一個(gè)瓶頸。目前能夠在實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的微生物僅占其總數(shù)的不到1%，絕大多數(shù)微生物不可培養(yǎng)，無法通過分離純化的傳統(tǒng)培養(yǎng)方式得到純菌落，從而限制了新的脂肪酶基因的開發(fā)。 利用分子生物學(xué)的方法篩選新的脂肪酶基因，提高脂肪酶的表達(dá)活力，對(duì)于促進(jìn)脂肪酶在含油脂廢水處理中的應(yīng)用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種從環(huán)境中篩選出的新的脂肪酶基因，該基因能夠在酵母細(xì)胞中高效表達(dá)，克服了原有脂肪酶基因表達(dá)效率不高的缺陷。一種用于處理油脂污染物的脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。本發(fā)明還涉及編碼權(quán)利要求1所述脂肪酶的基因。具體的，所述基因核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。本發(fā)明通過構(gòu)建活性污泥的DNA文庫，篩選到一個(gè)新的高效表達(dá)的脂肪酶基因?？朔藗鹘y(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)的不足，是一條尋找新的脂肪酶基因的新途徑。本發(fā)明涉及的脂肪酶基因，是一種新的基因，與同類基因沒有同源性。其編碼的脂肪酶是一種新的脂肪酶，與其他已報(bào)道的脂肪酶氨基酸序列相比，相似性小于30%。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本發(fā)明的脂肪酶基因所編碼的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、插入或缺失所得到的功能類似物均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。在已知本發(fā)明脂肪酶基因的情況下， 本發(fā)明普通技術(shù)人員可按本領(lǐng)域常規(guī)方法構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)化、表達(dá)，獲得所述脂肪酶。本發(fā)明還涉及含有所述基因的重組載體，將含有所述基因的重組載體轉(zhuǎn)化至宿主菌(通常為酵母菌)中，進(jìn)行表達(dá)，即可獲得本發(fā)明脂肪酶。本發(fā)明還涉及所述基因在制備重組脂肪酶中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及所述的脂肪酶在微生物法水解處理油脂污染物中的應(yīng)用。本發(fā)明的脂肪酶的最適溫度是25 ;35°C，最適pH為6. 5 7. 5。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在本發(fā)明提供了一種新的脂肪酶基因，能夠在酵母菌中高效表達(dá)，克服了傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)的不足，可提高脂肪酶的表達(dá)活力，對(duì)于促進(jìn)脂肪酶在含油脂廢水處理中的應(yīng)用具有重要意義。


圖1為活性污泥總DNA電泳圖譜；圖2為Sau3A I酶切DNA電泳圖譜；圖3為重組質(zhì)粒pPIC9K_lipN的EcoR I/Not I雙酶切驗(yàn)證電泳圖譜；圖4為轉(zhuǎn)化酵母中IipN目的基因的PCR驗(yàn)證電泳圖譜；M =Marker, A 以5’ AOXl 和3’ AOXl作為引物擴(kuò)增，B 以α -factor和3’ AOXl作為引物擴(kuò)增圖5為脂肪酶的最適pH曲線；圖6為脂肪酶的最適溫度曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此實(shí)施例1 活性污泥DNA文庫的構(gòu)建1、活性污泥DNA的提取從某食品污水處理廠采集污泥，經(jīng)過適當(dāng)稀釋作為樣品進(jìn)行DNA的提取。 12000r ^irT1離心5min收集樣品，TE重懸洗滌一次后，加溶菌酶至終濃度為100 μ g -πιΓ1, 37°C水浴2小時(shí)。加5Μ NaCl調(diào)整終濃度至0. 5Μ，混勻后加入40 μ 1蛋白酶K和20 % SDS (終濃度為0. 5 1 % )，37°C過夜或者50°C水浴池至溶液粘稠澄清。加1/3體積的飽和NaCl 劇烈振蕩1 后，12000r · HiirT1離心5min，收集上清至一滅菌離心管中，加入0. 6V異丙醇混勻后沉淀，12000r · HiirT1離心收集沉淀，用70%乙醇洗滌，吹干后溶于400 μ 1滅菌去離子水中，總DNA電泳如圖1所示。2、DNA文庫的構(gòu)建(I)DNA 的酶切用Sau3A I部分酶切活性污泥總DNA，先用檢測(cè)型反應(yīng)體系進(jìn)行酶切，確定最適酶切濃度及時(shí)間，最終進(jìn)行制備型部分酶切。檢測(cè)型酶切反應(yīng)體系(IOyL)總DNA 2yL, Sau3AI適量，緩沖液1 μ L，加ddH20至終體積10 μ L。制備型酶切反應(yīng)體系(100 μ L)總 DNA20 μ L，Sau3AI適量，緩沖液10 μ L，加ddH20至終體積100 μ L。其中所加Sau3AI酶量根據(jù)酶切濃度及時(shí)間進(jìn)行摸索，切膠回收2 41Λ條帶的DNA片段，作為外源片段，電泳如圖 2所示。(2)脫磷載體的制備提取pucl8質(zhì)粒，用BamHI進(jìn)行單酶切，回收1. Skb大小的線性片段進(jìn)行去磷酸化反應(yīng)。在微量離心管中建立以下的反應(yīng)體系線性化PUC18載體^ul，10X堿性磷酸酯酶緩沖液 5 μ 1，CIAP (16U/μ 1 TAKARA) 0. 5ul，加 ddH20 至終體積 50 μ 1。50°C反應(yīng) 30min，加 1/10體積0. 5M的EDTA終止反應(yīng)；合并四管用ddH20補(bǔ)足至500ul ；加400ul酚/氯仿抽提 1次，吸出上清；加1/10V的3M NaAc, 2V預(yù)冷的乙醇，在_20度沉淀60min ；離心收集沉淀， 用200 μ 1 70%乙醇洗滌后吹干，用20 μ ITE溶解。電泳定量，50 IOOng/管分裝保存于終濃度為50%的滅菌甘油中，備用。(3)轉(zhuǎn)化將外源片段和載體按比例進(jìn)行過夜酶連。取E. coli DH5a高效感受態(tài)細(xì)胞(每管約200μ 1)于冰浴中融化，每管加2μ 1酶連產(chǎn)物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，冰浴中放置 30min,將離心管放入42°C的循環(huán)水浴中，熱激90s，不要搖動(dòng)離心管?？焖賹㈦x心管移到冰浴中使細(xì)胞冷卻1 anin后每管加800 μ 1預(yù)熱至37°C的LB培養(yǎng)基，混勻后在37°C搖床中，150r · miiT1溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因。涂布復(fù)蘇后的轉(zhuǎn)化液到加氨芐青霉素(lOOyg.mr1)的新鮮LB平板上，待菌液被完全吸收后，倒置平板于37°C培養(yǎng)，12 1 后出現(xiàn)菌落。(4)文庫的檢查與保存挑取150個(gè)陽性克隆接種于抗生素平板上，37°C培養(yǎng)至菌落長出后，隨機(jī)挑取部分轉(zhuǎn)化子進(jìn)行質(zhì)粒提取，檢查外源片段插入情況，并將培養(yǎng)好的平板于4°C保存?zhèn)溆谩z測(cè)后的平板用無菌水將菌落洗下后加甘油至終濃度15%，于-70°C保存?zhèn)溆谩?shí)施例2 脂肪酶基因的篩選和序列分析將DNA文庫中克隆子置于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，經(jīng)適當(dāng)稀釋后涂布于表面均勻涂布2滴橄欖油的初篩平板上，置于37°C條件下培養(yǎng)Mh，選取在平板上生長的菌株接入復(fù)篩液體培養(yǎng)基中，37°C條件下培養(yǎng)3 后測(cè)定每種發(fā)酵液中的橄欖油含量。選取對(duì)橄欖油有最強(qiáng)降解能力的菌株，提取質(zhì)粒對(duì)插入序列進(jìn)行測(cè)序。脂肪酶基因命名為lipN，載體命名為 puc-lipN。測(cè)序結(jié)果在NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明，在數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)和該基因序列同源的序列，其應(yīng)為一新序列。經(jīng)過對(duì)脂肪酶基因IipN的分析，預(yù)測(cè)了該酶可能的編碼序列，去除信號(hào)肽后，包括起始密碼及終止密碼在內(nèi)，共12M個(gè)核苷酸(SEQ ID NO :2)，編碼 408 個(gè)氨基酸(SEQ ID NO :1)。上述初篩培養(yǎng)基(g· I/1) (NH4)2S042. 0，KH2PO4L 0，MgSO4 · 7Η200· 5，瓊脂 20. 0， 每皿 2 滴橄欖油。復(fù)篩培養(yǎng)基(g · L—1) (NH4) 2S042. 0，K2HP042. 0，NaH2P042. 0，NaCl 2. 0， MgSO4 · 7H20 0. 5，橄欖油 20. 0。實(shí)施例3 脂肪酶基因在酵母細(xì)胞中的表達(dá)
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1、表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)酶切位點(diǎn)分別為EcoR I和Not I的引物IipNF (ACTG AATTCATGTCCTATGTACCGTTCAG)和 lipNR(ACTGCGGCCG CCTACCAGTGGGTCGTACCAA)，以質(zhì)粒 puc-lipN為模板，擴(kuò)增帶有EcoR I/Not I酶切位點(diǎn)的脂肪酶基因lipN，PCR產(chǎn)物用EcoR I/Not I雙酶切，回收1. 4kb片段，與同樣雙酶切的pPIC9K(美國invitrogen公司)連接， 轉(zhuǎn)化E. coli DH5a，獲得重組質(zhì)粒pPIC9K-lipN。該重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI/Not I雙酶切驗(yàn)證。 酶切驗(yàn)證圖譜如圖3所示。2、準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化用DNA將pPICTk-lipN用Ml I或Me I或Bgl II酶切線性化，對(duì)于酵母細(xì)胞而言，用 Sal I或&ic I線性化得到的轉(zhuǎn)化子是His+Mut+表型；用Bgl II得到的轉(zhuǎn)化子是His+Muts 表型。建議同時(shí)分離His+Mut+及His+Muts酵母轉(zhuǎn)化子，因?yàn)楹茈y預(yù)測(cè)哪種結(jié)構(gòu)更利于蛋白表達(dá)。3、電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的制備在含5ml YPD的50ml離心管中，培養(yǎng)酵母細(xì)胞，30度過夜；取30 50ul過夜培養(yǎng)物，接種含50ml新鮮培養(yǎng)基的250ml搖瓶，過夜生長至0D600 = 1. 3 1. 5 ；在4度，1500g 離心5min收集細(xì)胞，用50ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞；如上離心，用25ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞；如上離心，用2ml預(yù)冷的IM山梨醇懸浮細(xì)胞；如上離心，用IOOul預(yù)冷的IM山梨醇懸
浮細(xì)胞。4、電轉(zhuǎn)化將5 IOug線性化DNA與80uL電轉(zhuǎn)化細(xì)胞混勻，轉(zhuǎn)移到0. Icm電轉(zhuǎn)化杯，冰浴 5min。電轉(zhuǎn)化參數(shù)0. 75kV，25uF，200Q。電擊后立即加入ImL預(yù)冷的IM山梨醇。取150ul
涂布MD平板上培養(yǎng)。在30度孵育平板至克隆產(chǎn)生。5、篩選遺傳霉素抗性轉(zhuǎn)化子吸取1 2ml滅菌水于所有HIS+轉(zhuǎn)化子平板上；用滅菌刮子重懸HIS+轉(zhuǎn)化子，不要?jiǎng)澠骗傊?；將?xì)胞懸液集中轉(zhuǎn)移至滅菌的50ml離心管中，稍渦旋(5 10S)；用分光光度計(jì)測(cè)定濃度(10D600 = 5X107細(xì)胞/ml)；在每塊含有遺傳霉素的YPD平板上涂105細(xì)胞。 (遺傳霉素濃度梯度為 0，0. 25，0. 5，0. 75，1. 0，1. 5，1. 75，2. 0，3. 0 及 4. 0mg/ml)；在 30 度孵育平板，每天檢查?？惯z傳霉素克隆需2 5天出現(xiàn)。根據(jù)文獻(xiàn)已經(jīng)研究過植酸酶基因在酵母中的表達(dá)量與其整合在染色體上的拷貝數(shù)成正比，而其拷貝數(shù)又與其抗遺傳霉素的能力成正比，所以需要篩選抗G418濃度3. 0及 4. 0mg/ml的轉(zhuǎn)化子，但是抗如此高遺傳霉素的克隆比較少見，需要篩選數(shù)以千計(jì)的HIS+轉(zhuǎn)化子以分離抗2-%ig/ml遺傳霉素的克隆。6、遺傳霉素抗性驗(yàn)證將從0. 4、1. 0和1. 75mg/ml濃度的G418平板得到的轉(zhuǎn)化子分別劃線于相應(yīng)抗性的平板上，5天后發(fā)現(xiàn)菌落生長良好，并出現(xiàn)單菌落。接單菌落于YPD液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，保藏菌種。7、PCR鑒定轉(zhuǎn)化子基因用弓丨物5，AOX 1 (GACTGGTTCCAATTGACAAGC)、α -factor (TACT AT T G CCAGCATTGCTGC)和 3，A0X1 (GGCAAATGGCATTCTGACAT)擴(kuò)增目的基因。PCR 條件95°C 3min ；950C lmin, 56°C 30s, 72°C lminJ8 個(gè)循環(huán)；72°C 5min。PCR 結(jié)束后，通過 0. 8%瓊脂糖電泳檢測(cè)大小。結(jié)果如圖4所示，外源線性片段已成功整合入酵母染色體。8、Mut+ 和 Muts 表型驗(yàn)證用滅菌牙簽挑取單克隆，在MM及MD平板上分別點(diǎn)轉(zhuǎn)化子，確保先在MM平板上點(diǎn)， 每個(gè)克隆換一次牙簽，30度孵育2天。兩天后，觀察平板，MD平板上生長快，MM平板上生長緩慢或不生長的轉(zhuǎn)化子為Muts，生長速度一樣的轉(zhuǎn)化子為Mut+。原理是Mut+能夠快速利用甲醇為碳源，而Muts則不能利用甲醇為碳源。所以Mut+能夠在含甲醇(MM)平板也快速生長，而Muts只能在含葡萄糖(MD)平板快速生長。根據(jù)PCR產(chǎn)物大小和MD平板點(diǎn)菌實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)化子為Muts型。9、誘導(dǎo)表達(dá)挑取單克隆，接種至含100ml BMGY的IL搖瓶中。在搖床中觀 30度，250 300rpm生長至0D600 = 2 6 (約16 18小時(shí))；室溫1500_3000g離心5min收集細(xì)胞， 去除上清，用1/5 1/10原培養(yǎng)基體積的BMMY重懸細(xì)胞(約10 20ml)；置于IOOml隔板搖瓶中，用2層滅菌紗布或干酪包布蓋住瓶口，放入搖床繼續(xù)培養(yǎng)；每隔M小時(shí)，加入甲醇至終濃度為0. 5%以繼續(xù)誘導(dǎo)；在下列的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取Iml培養(yǎng)基至1. 5ml離心管。這些樣品用于分析表達(dá)水平及確定誘導(dǎo)后收集細(xì)胞的最佳時(shí)間。室溫用水平離心機(jī)最大轉(zhuǎn)速離心 2 3min。時(shí)間點(diǎn)0，6，12，M (1 天)，36，48 O 天)，60，72 (3 天)，84，96 G 天)；分泌表達(dá)時(shí)，將上清轉(zhuǎn)移至單獨(dú)管中，將上清及細(xì)胞沉淀存于-80度。10、脂肪酶活性的測(cè)定用底物ρ-硝基苯丁酸酯(p-nitrophenybutyrate)測(cè)定脂肪酶活力。酶活力單位定義為每分鐘釋放Iumol ρ-硝基酚(p-nitrophenol)所需的酶量。酶活力測(cè)定通過在25 度，脂肪酶水解P-硝基苯丁酸酯為P-硝基酚的量來確定。IipN基因在酵母細(xì)胞中表達(dá)，脂肪酶酶活在第7 達(dá)到最高，為210U/ml。實(shí)施例4 脂肪酶的特性研究UpH值對(duì)脂肪酶活性的影響將脂肪酶加入不同PH值的緩沖液體系中測(cè)定酶活力，pH設(shè)置從3. 0到10. 0，每隔 0.5取點(diǎn)測(cè)定。酶活性測(cè)定反應(yīng)在25°C進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為15min。結(jié)果如圖5示，脂肪酶的最適PH值為6. 5 7. 5，在pH5. 5到pH8. 5范圍內(nèi)，脂肪酶酶活能保持在60%以上。2、溫度對(duì)脂肪酶活性的影響脂肪酶的最適反應(yīng)溫度測(cè)定在最適pH值下進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間為15min，溫度設(shè)置從 15°C到75°C，每隔5°C取點(diǎn)測(cè)定。結(jié)果如圖6示，脂肪酶的最適溫度為25 35°C，20 45°C 時(shí)的酶活能保持60%以上。實(shí)施例5脂肪酶在污水處理中的應(yīng)用將脂肪酶按0. 的添加量添加到某油脂公司廢水處理廠SBR工藝(序列間歇式活性污泥法)曝氣池中進(jìn)行含油脂廢水的處理。進(jìn)水水質(zhì)為油脂1200mg*L-l，化學(xué)需氧量(COD) 3000mg·L-I。未使用脂肪酶的對(duì)照組油脂降解率為25%，化學(xué)需氧量(COD)去除率為70% ；使用脂肪酶后油脂降解率為95%，化學(xué)需氧量(COD)去除率為96%。與對(duì)照組相比，脂肪酶可明顯提高含油脂廢水處理的效率。
權(quán)利要求
1.一種用于處理油脂污染物的脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述脂肪酶的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述基因核苷酸序列如SEQID N0:2所示。
4.含有權(quán)利要求2所述基因的重組載體。
5.權(quán)利要求2所述基因在制備重組脂肪酶中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的脂肪酶在微生物法水解處理油脂污染物中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述水解在25 35°C、pH6.5 7. 5下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于處理油脂污染物的脂肪酶、編碼基因及其在微生物法水解處理油脂污染物中的應(yīng)用，該脂肪酶及其編碼基因序列如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示。本發(fā)明提供的新的脂肪酶基因，能夠在酵母菌中高效表達(dá)，克服了傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)的不足，可提高脂肪酶的表達(dá)活力，對(duì)于促進(jìn)脂肪酶在含油脂廢水處理中的應(yīng)用具有重要意義。
文檔編號(hào)A62D3/02GK102250854SQ20111018491
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月1日
發(fā)明者楊瑾, 鄭展望 申請(qǐng)人:浙江商達(dá)環(huán)保有限公司