00ml水混勻，調(diào)PH6.0,至在45°C下保溫lOmin，然后按2000U/g的比 例加入木瓜蛋白酶，同樣溫度下酶解八小時(shí)，然后酶解液離心去沉淀，調(diào)PH至6. 5,加入抗 壞血酸，再按比例加入FeCl2，恒溫振蕩器中螯合30min，最后真空濃縮，冷凍干燥成魚糜酶 解肽亞鐵螯合物粉末備用。
[0055] 2. 2雙層包埋微膠囊制備
[0056] 首先，以亞鐵螯合物：大豆油（1:3)的比例將亞鐵亞鐵螯合物乳化，獲得W/0的乳 液；然后將處理過(guò)的樣品與SIP溶液（PH為8. 0)乳化，獲得0/W乳液，以上兩步都在高速均 質(zhì)器（2000rmp, 2min)里實(shí)現(xiàn)。
[0057] 將果膠水溶液緩慢倒入該乳液中，在電磁攪拌器下混勻。然后用lmol/L的磷酸將 乳液PH調(diào)到4. 4 (溫度保持在40°C)。
[0058] 將處理好的材料在7°C下儲(chǔ)存過(guò)夜，然后在普通冰箱（_18°C)里冰凍，最后冷凍干 燥成粉末即可。
[0059] 2. 3微膠囊包埋率的測(cè)定
[0060] 包埋率是測(cè)定微膠囊產(chǎn)品最重要的指標(biāo)。計(jì)算方式為式（1)
[0061]
(1)
[0062] 用原子吸收光譜法測(cè)定鐵離子濃度。測(cè)定微膠囊產(chǎn)品的包埋率，先用蒸餾水反復(fù) 洗滌已制備好亞鐵螯合物微膠囊，洗去微膠囊表面的螯合物，抽濾，干燥。再精密稱取干燥 的微膠囊l〇〇mg于100ml具塞錐形瓶中，加入0. 5mol/l的梓檬酸鈉溶液50ml，于40°C、50r/ min振搖6h，5000r/min離心lOmin，取濾液lml稀釋至10ml。以上步奏中空白處理為對(duì)照， 用原子吸收光譜法測(cè)定鐵離子濃度，然后按式（1)計(jì)算微膠囊包埋率。
[0063] 2. 4微膠囊溶解度的測(cè)定
[0064] 固體樣品（10毫克/毫升）溶解在蒸餾水中（pH值7. 0)。在室溫下不斷攪拌，90 分鐘和24小時(shí)。然后在6000r離心5分鐘在15°C。從上清液解度測(cè)定使用Lowry-Folin 方法，從溶液的微膠囊濃度計(jì)算，分光光度計(jì)在750nm下測(cè)定吸光度，參考式（2)。
[0065]
m
[0066] 式（2)線性和角系數(shù)來(lái)自亞鐵螯合物濃度（毫克/毫升）和吸光度。式（3)顯示 了亞鐵螯合物濃度（毫克/毫升）的公式。
[0067]
(3)
[0068] 可溶性亞鐵螯合物溶解度表示為g蛋白質(zhì)總量的每100克。微膠囊溶解度進(jìn)行測(cè) 定溶解在90分鐘和24小時(shí)后的樣品觀察他們的行為在短和擴(kuò)展與水接觸。
[0069] 2. 2. 5含水量及吸水性的測(cè)定
[0070] 微膠囊的含水量測(cè)定，0. 2g的封裝粉干在100°C24小時(shí)內(nèi)預(yù)先干燥和冷卻培養(yǎng) 皿。然后根據(jù)公式（4)計(jì)算水分含量。
[0071]
<4>
[0072] 吸水率的測(cè)定，取樣品（2g)放置在培養(yǎng)皿中，放進(jìn)含有Na2s〇4的密閉的塑料容器 中讓其滲透，一周以后，樣品增加的質(zhì)量即為樣品的吸水性。
[0073] 2. 2. 6微膠囊抗氧化效果的測(cè)定
[0074] 抗氧化測(cè)定的方法：稱取一定量新鮮大豆油，放入燒杯中，加入一定量抗氧化劑， 攪拌均勻，置于60±0.5°C恒溫箱中強(qiáng)化保存，每隔24h攪拌一次，并交換其在恒溫箱中的 位置，定期測(cè)定油樣中的過(guò)氧化值（P0V值）。
[0075] 3?結(jié)果與討論
[0076] 3. 1亞鐵螯合物的描述
[0077] 如圖1所示，酶解多肽未經(jīng)亞鐵螯合的產(chǎn)物呈淡黃色粉末狀。酶解蛋白亞鐵螯合 廣物呈白色，亦是粉末狀。
[0078] 采用傅里葉變換紅外光譜法進(jìn)行螯合物結(jié)構(gòu)的初步分析：取少量試樣，加入KBr 做稀釋劑，在瑪瑙研缽里研磨至粒子細(xì)小而均勻，壓片成型。用傅立葉變換紅外光譜儀測(cè) 試，分辨率設(shè)置為4cm\掃描次數(shù)40次。結(jié)果見圖2和圖3。
[0079] 圖1中的紅外光譜圖分別是酶解肽與亞鐵螯合前后的紅外光譜圖，圖2中 2901. 23cm1是由N-H伸縮振動(dòng)引起，而在圖3中，此波段變?yōu)?011. 67cm\向高波段移動(dòng)了 110個(gè)波數(shù)，成為銨鹽NH4+的特征頻率，因此可判斷魚糜蛋白復(fù)合酶解肽中的氨基參與了亞 鐵的螯合；同時(shí)圖2中的1202. 12cm1在圖3中是1254. 36cm\向高波位移動(dòng)了 52個(gè)波數(shù)， 成為C00-伸縮振動(dòng)引起的羧酸鹽的特征頻率。因此可以判斷，羧基也參與了魚糜蛋白復(fù)合 酶解肽-亞鐵的螯合反應(yīng)。
[0080] 3. 2微膠囊形態(tài)
[0081] 圖2表示亞鐵螯合物在以SPI和果膠為壁材的微膠囊形態(tài)，考馬斯亮藍(lán)染色顯示 出他們形成了不同的層。有研究顯示，微膠囊的形態(tài)會(huì)呈現(xiàn)出固定形態(tài)，即如果出現(xiàn)類似的 形態(tài)，意味著那么用雙層包埋（復(fù)凝聚法）制備微膠囊成功。圖3清楚的顯示了油滴的存 在，也有微膠囊與周圍亞鐵螯合物不規(guī)則的聚集。
[0082] 3. 3與包埋率有關(guān)的因素研究
[0083] 在試驗(yàn)流程中，很多因素會(huì)影響微膠囊的包埋率，這里我們通過(guò)文獻(xiàn)對(duì)比，選取對(duì) 包埋率影響較大的壁芯比、壁材材料之比（SPI/果膠）與包埋時(shí)間做單因素實(shí)驗(yàn)。
[0084] 3. 2. 1壁芯比對(duì)包埋率的影響
[0085] 取SPI與果膠之比為1: 1，包埋時(shí)間20min，其他因素照實(shí)驗(yàn)流程中參考，設(shè)計(jì)壁芯 比分別為1:3、1:2、1:1、2 :1、3:1、5:1，測(cè)定包埋率。結(jié)果顯示如下：
[0086] 圖4結(jié)果顯示，當(dāng)壁材材料漸漸大于芯材材料是，包埋率會(huì)上升，壁芯比在2:1的 時(shí)候達(dá)到比較理想的水平，即使后來(lái)壁材的質(zhì)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于芯材質(zhì)量對(duì)包埋率的影響也沒有 特別顯著。后面兩個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)將壁芯比定在2:1。
[0087] 3. 2. 2SPI與果膠質(zhì)量之比對(duì)包埋率的影響
[0088] 取壁芯比為2:1，包埋時(shí)間定為20min，設(shè)計(jì)SPI與果膠的質(zhì)量之比分別為30% : 70%、40% :60%、45% :55%、50% :50%、60% :40%，測(cè)定包埋率結(jié)果如下：
[0089] 圖5顯示，當(dāng)果膠的質(zhì)量分?jǐn)?shù)稍大于SPI時(shí)，包埋率會(huì)達(dá)到比較理想的水平，SPI與 果膠質(zhì)量之比為45% :55%時(shí)，包埋率達(dá)到最佳水平，這個(gè)結(jié)果也與DeboraV等人的研究 結(jié)果相似，即雙層包埋法中，外層壁材的質(zhì)量分?jǐn)?shù)略大于內(nèi)層壁材的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，有利于產(chǎn)品 提高包埋率。
[0090] 3. 2. 3包埋時(shí)間對(duì)包埋率的影響
[0091] 由以上兩個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)，我們定SPI與果膠質(zhì)量之比為45%:55%、壁芯比為2:1， 設(shè)置包埋時(shí)間分別為10min、20min、30min、40min、50min、60min。分別測(cè)定包埋率，結(jié)果顯示 如下：
[0092] 以上結(jié)果直觀的顯示了包埋時(shí)間對(duì)包埋率的影響，包埋時(shí)間在20至30min的時(shí)達(dá) 到最大值，但是，當(dāng)時(shí)間超過(guò)30min后，包埋率幾乎無(wú)變化，意味著30min是包埋微膠囊最佳 的時(shí)間，延長(zhǎng)時(shí)間并不能有效提高包埋率，還會(huì)造成資源浪費(fèi)。
[0093] 包埋率受很多因素影響，在我們的研究中，確定最佳了包埋微膠囊的最佳工藝條 件為：壁芯比為2:1，SPI與果膠質(zhì)量之比為45% :55%，包埋時(shí)間為三十分鐘，可最大程度 的利用到我們的芯材亞鐵螯合物。
[0094] 3. 4溶解度研究
[0095] 進(jìn)行溶解度的評(píng)估是為了觀察微膠囊在水中的行為，這是為了驗(yàn)證亞鐵螯合物水 解物將被釋放在這個(gè)媒介。作為微膠囊的預(yù)期產(chǎn)生的凝聚，如果在水中溶解度很低（即使 浸泡24小時(shí)后），則證實(shí)微膠囊完整性的維護(hù)。因此可以知道使用方法和封裝材料可以獲 得非常穩(wěn)定的微膠囊，具有良好的控釋特性。
[0096] 溶解度增加直接與微膠囊的水解程度的增加有關(guān)。在樣品可溶性的90分鐘和24 小時(shí)不斷增長(zhǎng)。這個(gè)結(jié)果可以