專利名稱：利用一種基于小珠的寡核苷酸檢測(cè)法的信號(hào)擴(kuò)增的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)、序列分析和基因表達(dá)分析領(lǐng)域。更具體地講，本發(fā)明的領(lǐng)域涉及擴(kuò)增來自基于小珠的寡核苷酸基因表達(dá)檢測(cè)法的信號(hào)。
背景技術(shù)：
核酸序列檢測(cè)的方法有多種應(yīng)用，所述應(yīng)用包括基因表達(dá)譜分析、多核苷酸的測(cè)序、基因突變的檢測(cè)、基因型鑒定、物種鑒定和表型描述、特異化學(xué)藥品(毒性的和/或治療性的)暴露等。檢測(cè)核酸序列的方法目前的缺點(diǎn)包括背景噪音、需要時(shí)間與勞動(dòng)、缺乏特異性和缺乏靈敏度。一些檢測(cè)方法利用聚合物陣列，例如利用核酸，它能被篩選用于特異性結(jié)合到諸如互補(bǔ)的核苷酸這樣的靶上。基因表達(dá)研究近來通過微陣列的應(yīng)用已經(jīng)被加速了。通過一次檢測(cè)幾千個(gè)基因，微陣列已經(jīng)導(dǎo)致了許多涉及特定生物化學(xué)過程的基因的發(fā)現(xiàn)。這些研究的下一步集中在利用陣列鑒定出的部分重要基因上。
McHugh等人(1988)的研究涉及包含能誘導(dǎo)人抗體的病毒抗原的微球體，所述人抗體通過使用生物素標(biāo)記的抗人IgG，然后通過抗生物素蛋白鏈菌素-PE檢測(cè)。
Lindmo等人(1990)的研究涉及一種利用兩種類型顆粒的檢測(cè)法，所述兩種類型顆粒有相同的特異性，但對(duì)抗癌胚抗原抗原表位的生物素-抗生物素蛋白鏈菌素-藻紅蛋白-共軛第二抗體的親和力不同。
Spycher等人(1991)涉及微球體，所述微球體暴露于人血清，然后暴露于生物素標(biāo)記的抗-C3d或抗-C4d單克隆抗體，和藻紅蛋白-抗生物素蛋白鏈菌素，其中熒光通過流式細(xì)胞儀測(cè)量，并對(duì)應(yīng)于沉淀的C3和C4的量。
Bhalgat等人(1998)的研究涉及帶有兩種不同的熒光團(tuán)的其中一種的微球體，其中熒光團(tuán)被結(jié)合到抗生物素蛋白鏈菌素上，用以選擇用生物素標(biāo)記的一抗標(biāo)記好的細(xì)胞表面標(biāo)記。
Dunbar等人(2003)描述了用以檢測(cè)細(xì)菌病原體的LabMAP微球體，其中結(jié)合到特異性針對(duì)一種特定微生物的捕獲抗體上的微球體，被用于處理包含微生物特異抗原的樣品，然后用生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體和抗生物素蛋白鏈菌素-R-藻紅蛋白處理所述微球體。
Yang等人(2001)和美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?002/0034753涉及提供連接到捕獲探針的微球體，所述捕獲探針有與單鏈靶核酸序列的一個(gè)第一片段互補(bǔ)的序列；將底物與雜交到捕獲探針的核酸樣品接觸，其中雜交上的靶核酸序列有至少一個(gè)第二片段保持單鏈狀態(tài)；暴露此底物到用以補(bǔ)平靶核酸的至少一個(gè)第二片段的條件下，其中所述互補(bǔ)核酸包含能夠增強(qiáng)互補(bǔ)核酸檢測(cè)靈敏度的帶有標(biāo)記的核苷酸；并分析此標(biāo)記以測(cè)定核酸樣品中存在或不存在靶核酸。
美國(guó)專利6,203,989和美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?001/0041335涉及在特異性結(jié)合檢測(cè)法中用以擴(kuò)增信號(hào)的方法和組合物，例如通過雜交一種靶核酸到一種核酸探針上，其中所述靶核酸包含一個(gè)結(jié)合配體，將此雜交后的靶核酸接觸一個(gè)包含多個(gè)位點(diǎn)的受體，所述位點(diǎn)能結(jié)合此結(jié)合配體以將此受體與結(jié)合配體結(jié)合，將此受體與一種包含多個(gè)結(jié)合配體的試劑接觸，以將此試劑與受體結(jié)合，并檢測(cè)此結(jié)合態(tài)試劑的存在。在具體的實(shí)施方案中，

圖1說明此核酸探針被固定在線性固體基質(zhì)上。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供材料用于檢測(cè)聚合物，尤其是核酸。本發(fā)明的一個(gè)特別的目標(biāo)是提供方法和組合物，用以擴(kuò)增在特異性結(jié)合檢測(cè)法中檢測(cè)核酸序列所使用的標(biāo)記信號(hào)。本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的目標(biāo)是提供使核酸序列能被特異性地、迅速地、高靈敏度和高分辨率地檢測(cè)的方法和組合物。
本發(fā)明涉及一種高通量的基因表達(dá)檢測(cè)法，用以評(píng)估特定的基因表達(dá)情況。本發(fā)明提供了對(duì)現(xiàn)有基于小珠的檢測(cè)法的幾項(xiàng)改進(jìn)，所述檢測(cè)法在信號(hào)和基因調(diào)節(jié)方面與微陣列技術(shù)高度相關(guān)。這些改進(jìn)除了最優(yōu)化時(shí)間、溫度和其它檢測(cè)條件之外，至少還包括示例的利用生物素標(biāo)記的抗抗生物素蛋白鏈菌素進(jìn)行的抗生物素蛋白鏈菌素藻紅蛋白擴(kuò)增。使用這種方法，已經(jīng)達(dá)到了下至1埃摩爾的檢測(cè)水平，檢測(cè)復(fù)雜cRNA樣品中稀有的信使RNA分子，例如利用少至1.0μg的樣品。與現(xiàn)有的微陣列技術(shù)相比，這種檢測(cè)法具有增加的通量和減少的費(fèi)用。在具體的實(shí)施方案中，這種擴(kuò)增技術(shù)被應(yīng)用到蛋白質(zhì)和/或基因表達(dá)檢測(cè)中，例如用總RNA進(jìn)行的檢測(cè)。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用基于例如市售的寡核苷酸雜交體系，如LuminexxMAP體系的檢測(cè)法。這種體系是一種迅速的多元檢測(cè)平臺(tái)，它在96孔板中同時(shí)定量一個(gè)單獨(dú)樣品中的最多100個(gè)不同的分析物。此xMAP體系基于用不同比率的兩種光譜不同的熒光染料進(jìn)行內(nèi)部染色的聚苯乙烯微球體，所述熒光染料提供100個(gè)不同成分的光譜陣列。使用此xMAP體系，本發(fā)明人使用小珠結(jié)合最優(yōu)化選擇的寡核苷酸，發(fā)展了一種對(duì)特定數(shù)目的不同目標(biāo)基因特異性的表達(dá)譜檢測(cè)法。這種檢測(cè)法也將應(yīng)用到如上所引的全套100個(gè)分析物。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，有一種擴(kuò)增信號(hào)以檢測(cè)寡核苷酸的方法，包括以下步驟(a)提供至少一個(gè)連接到至少一個(gè)預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸的微球體；(b)雜交標(biāo)記的靶多核苷酸到所述寡核苷酸以形成一種寡核苷酸/靶多核苷酸復(fù)合物，其中所述復(fù)合物包含一種通過將受體結(jié)合到標(biāo)記可檢測(cè)的信號(hào)；和(c)提供一種針對(duì)所述受體的標(biāo)記的配體，其中當(dāng)所述配體結(jié)合所述受體時(shí)，信號(hào)被擴(kuò)增。在具體的實(shí)施方案中，預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸用算法進(jìn)行選擇。
一種用以選擇預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸的算法可以利用至少一種以下的選擇標(biāo)準(zhǔn)(a)選擇至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中此被選擇的至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸具有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)值的可接受的相關(guān)性檢驗(yàn)值；(b)選擇至少一種完全匹配的和略錯(cuò)配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸對(duì)，其中在一對(duì)內(nèi)，被選擇的至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸減去錯(cuò)配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸具有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)值的可接受的相關(guān)性檢驗(yàn)值；(c)從不同的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸對(duì)中選擇至少一對(duì)預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中在所述至少一對(duì)預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸中的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸中的信號(hào)比率具有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)比率的可接受的相關(guān)性；和(d)選擇至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中所述完全匹配的預(yù)優(yōu)化寡核苷酸具有可接受的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
在具體的實(shí)施方案中，預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸被進(jìn)一步定義為通過以下步驟被選擇提供一種包含至少一個(gè)靶多核苷酸的樣品；使所述樣品經(jīng)受一種寡核苷酸陣列，其中所述靶多核苷酸與陣列中的至少一個(gè)寡核苷酸的雜交提供一種可檢測(cè)的雜交指紋；并從所述指紋中鑒定至少一個(gè)最佳的寡核苷酸。預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸可以被進(jìn)一步定義為通過以下步驟被選擇提供一種包含多個(gè)靶多核苷酸的樣品，所述靶多核苷酸定義為來自一個(gè)以上基因的RNA多核苷酸；使所述樣品經(jīng)受一種寡核苷酸陣列，其中一個(gè)以上不同的RNA多核苷酸與陣列中各自的寡核苷酸的雜交提供一種對(duì)一個(gè)以上基因來說可檢測(cè)的雜交指紋；并從所述指紋中鑒定至少一個(gè)對(duì)所述一個(gè)以上基因來說最佳的寡核苷酸。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，鑒定步驟利用一種算法以鑒定寡核苷酸。
在本發(fā)明的其它具體實(shí)施方案中，所述算法鑒定與靶多核苷酸的至少一部分序列完全互補(bǔ)的寡核苷酸。靶多核苷酸可以被包含在多個(gè)RNA多核苷酸中，并且此多個(gè)多核苷酸的濃度可以是約1μg至約10μg。
在此外的具體實(shí)施方案中，所述配體包含一種抗體。并且，靶多核苷酸的標(biāo)記和/或配體的標(biāo)記可以包含熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記和/或金標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，靶多核苷酸的標(biāo)記和配體的標(biāo)記是基本上類似的或相同的。
在更多的具體實(shí)施方案中，微球體被包括在多個(gè)微球體中，而靶多核苷酸被包括在多個(gè)RNA多核苷酸中。所述多個(gè)RNA多核苷酸可以被包含在一份包含mRNA的樣品中，并且此方法可以被進(jìn)一步定義為用以提供mRNA表達(dá)譜信息的方法。在具體的實(shí)施方案中，所述多個(gè)微球體中的至少一個(gè)微球體包含與所述多個(gè)微球體中的另一個(gè)微球體所包含的寡核苷酸不同的寡核苷酸。所述多個(gè)微球體中的至少一個(gè)微球體可以包含一個(gè)以上不完全相同的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，所述寡核苷酸與相同RNA多核苷酸具有序列互補(bǔ)性。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，涉及一種組合物，所述組合物包括多個(gè)微球體，每個(gè)微球體連接到至少一個(gè)預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被雜交到一種標(biāo)記的RNA多核苷酸上從而形成一種寡核苷酸/標(biāo)記的RNA多核苷酸雜交復(fù)合物，并且其中所述復(fù)合物包含一種通過受體到標(biāo)記的結(jié)合而可檢測(cè)的信號(hào)，此信號(hào)通過結(jié)合標(biāo)記的配體到受體而被擴(kuò)增。所述多個(gè)微球體中的至少一個(gè)微球體可以包含與所述多個(gè)微球體中的另一個(gè)微球體所包含的寡核苷酸不同的寡核苷酸。并且，所述多個(gè)微球體中的至少一個(gè)微球體可以包含一個(gè)以上不完全相同的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自與相同RNA多核苷酸具有序列互補(bǔ)性。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方案中，涉及一種優(yōu)化一種基于寡核苷酸雜交的檢測(cè)法的方法，所述方法包括以下步驟提供一種包含至少一個(gè)靶多核苷酸的樣品；使所述樣品經(jīng)受寡核苷酸陣列，其中所述靶多核苷酸與陣列中的至少一個(gè)寡核苷酸的雜交提供一種可檢測(cè)的雜交指紋；從所述指紋中鑒定至少一個(gè)最佳的寡核苷酸，其中鑒定步驟利用一種被以下選擇標(biāo)準(zhǔn)中至少一種所定義的算法(a)選擇至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中所述被選擇的至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸具有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)值的可接受的相關(guān)性檢驗(yàn)值；(b)選擇至少一種完全匹配的和略錯(cuò)配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸對(duì)，其中在一對(duì)內(nèi)，所述被選擇的至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸減去錯(cuò)配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸具有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)值的可接受的相關(guān)性檢驗(yàn)值；(c)從不同的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸對(duì)中選擇至少一對(duì)預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中在所述至少一對(duì)預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸中的所述預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸中的信號(hào)比率具有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)比率的可接受的相關(guān)性；和(d)選擇至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中所述完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸具有可接受的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；并使此最佳的寡核苷酸經(jīng)受一種基于寡核苷酸雜交的檢測(cè)法。
為了本發(fā)明接下來的發(fā)明詳述能被更好地理解，前述內(nèi)容已經(jīng)相當(dāng)廣泛地概述了本發(fā)明的特征和技術(shù)優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明另外的特征和優(yōu)點(diǎn)將在下文中描述，它們構(gòu)成了本發(fā)明的權(quán)利要求的主題。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠意識(shí)到，本發(fā)明所公開的概念和具體的實(shí)施方案可以被容易地利用來作為修改或設(shè)計(jì)其它的構(gòu)造以實(shí)現(xiàn)與本發(fā)明相同的目標(biāo)的基礎(chǔ)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，正如附加的權(quán)利要求中所闡明那樣，這些等效的構(gòu)造并沒有超出本發(fā)明的精神和范圍。據(jù)信為本發(fā)明所特有的新特征，包括關(guān)于它的組織和實(shí)施方法，以及進(jìn)一步的目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)，將由下列說明得到更好的理解。
發(fā)明詳述定義本文說明書中使用的“一個(gè)”可以指一個(gè)或多個(gè)。當(dāng)與“包含”一詞一起使用時(shí)，本文權(quán)利要求中使用的詞“一個(gè)”可以指一個(gè)或多個(gè)。本文使用的“另一個(gè)”一詞可以指另外的至少一個(gè)或多個(gè)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“指紋”是指具體樣品中的至少一個(gè)靶多核苷酸與一種或多種寡核苷酸探針的雜交的標(biāo)記模式，所述探針例如固定的寡核苷酸探針。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，指紋提供多個(gè)不同的靶多核苷酸的至少一個(gè)雜交模式的信息，所述靶多核苷酸中的至少一些包含來自不同基因(或者它們的代表性的mRNA或cRNA)的序列。
本文所用術(shù)語(yǔ)“雜交”是指兩種核酸之間的結(jié)合，例如通過堿基對(duì)氫鍵和堿基堆積形成的非共價(jià)相互作用。
本文所用術(shù)語(yǔ)“微球體”是指一種球形構(gòu)造，例如一種一般的球形構(gòu)造，它包含一種在該構(gòu)造上和/或在該結(jié)構(gòu)中的可檢測(cè)的標(biāo)記信號(hào)，例如通過至少一個(gè)可識(shí)別的標(biāo)記。在具體的實(shí)施方案中，微球體包含至少一個(gè)寡核苷酸，例如連接到其上的寡核苷酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，微球體可以指一種小珠。在多個(gè)微球體中一個(gè)特定的微球體可以通過至少一個(gè)特征與另一個(gè)微球體分辨開來。例如，微球體可以基于至少一個(gè)標(biāo)記被分辨，如在微球體上和/或在微球體中的比色的或熒光的標(biāo)記；或者基于尺寸、電荷等等。
多核苷酸(包括寡核苷酸)在本發(fā)明中可以被利用。技術(shù)人員能認(rèn)識(shí)到，本文所用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”或“核酸”是指任何長(zhǎng)度的核苷酸的一種聚合形式，所述核苷酸或者是核糖核苷酸或者是脫氧核糖核苷酸，它們包含嘌呤和嘧啶堿基，或者其它天然的、經(jīng)化學(xué)或生物化學(xué)修飾的、非天然的或衍生的核苷酸堿基。多核苷酸的主鏈可以包含糖和磷酸基團(tuán)(這些基團(tuán)典型地存在于RNA或DNA)，或經(jīng)修飾的或取代的糖或磷酸基團(tuán)。多核苷酸可以包含經(jīng)修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物，并且在具體的實(shí)施方案中，所述多核苷酸被標(biāo)記，例如通過在存在標(biāo)記的核苷酸的條件下進(jìn)行聚合反應(yīng)而產(chǎn)生標(biāo)記的多核苷酸。
本文中，“嚴(yán)謹(jǐn)性”涉及一種具體的雜交反應(yīng)的條件，它影響核酸雜交的程度。雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性能被選擇以使核酸雙鏈可以基于它們的互補(bǔ)程度而被選擇。例如，高嚴(yán)謹(jǐn)性與形成包含錯(cuò)配堿基的雙鏈的較低可能性相聯(lián)系，因此，嚴(yán)謹(jǐn)性越高，具有相應(yīng)的錯(cuò)配雙鏈的兩條單鏈核酸保持不雜交狀態(tài)的可能性越高。通常，能增加嚴(yán)謹(jǐn)性并因此在雜交的分子間選擇形成更高的互補(bǔ)程度的條件包括較高的溫度、較低的離子強(qiáng)度和/或存在或缺乏溶劑?？晒┻x擇地，在嚴(yán)謹(jǐn)性較低時(shí)形成錯(cuò)配雙鏈的可能性增加。較低的嚴(yán)謹(jǐn)性可通過較低的溫度、較高的離子強(qiáng)度、和/或較低的或較高的溶劑濃度(例如降低的甲酰胺或二甲基亞砜的濃度)實(shí)現(xiàn)。雜交反應(yīng)的持續(xù)時(shí)間和反應(yīng)物(即單鏈核酸)的濃度也能影響嚴(yán)謹(jǐn)性，短的反應(yīng)時(shí)間和低的反應(yīng)物濃度能獲得更高的嚴(yán)謹(jǐn)性。技術(shù)人員能認(rèn)識(shí)到，合適的嚴(yán)謹(jǐn)性通?？捎山?jīng)驗(yàn)決定，所述合適的嚴(yán)謹(jǐn)性將允許選擇產(chǎn)生完全匹配的雙鏈，而不是包含一個(gè)或多個(gè)錯(cuò)配的雙鏈。調(diào)節(jié)雜交反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)性的方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。本領(lǐng)域發(fā)展的核酸雜交檢測(cè)程序和條件可以被用于本發(fā)明，如在以下例子中所描述的程序和條件Maniatis等人，“Molecular CloningA Laboratory Manual”第二版，Cold SpringHarbor，N.Y.，1989；Berger和Kimmel，“MethodsinEnzymology，”第152卷，“Guide to Molecular CloningTechniques”，Academic Press，Inc.，San Diego，Calif.，1987；Young和Davis，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，801194(1983)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“靶多核苷酸”是指被測(cè)試其雜交到本發(fā)明所述微球體上的一個(gè)或多個(gè)固定的寡核苷酸的能力的至少一個(gè)多核苷酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，靶多核苷酸被標(biāo)記，例如用生物素。靶多核苷酸可以在5’末端和/或3’末端被標(biāo)記，和/或在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部核苷酸上被標(biāo)記。在其它具體的實(shí)施方案中，靶多核苷酸被包含在多個(gè)多核苷酸中，這些多核苷酸可以是其它的具有不同序列的靶多核苷酸。靶多核苷酸可以是任何種類的核酸，但是在具體的實(shí)施方案中它是RNA多核苷酸。在進(jìn)一步具體的實(shí)施方案中，它是mRNA或cRNA多核苷酸。在其它的實(shí)施方案中，所述靶多核苷酸被包含在一份樣品中。
本發(fā)明本文公開的方法和組合物可以被用于涉及檢測(cè)靶多核苷酸與寡核苷酸探針的雜交以及因此產(chǎn)生的信號(hào)的擴(kuò)增的多種應(yīng)用。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)包含不同靶序列的靶多核苷酸被篩選用于與固定的寡核苷酸探針的高密度陣列雜交，所述寡核苷酸探針包含不同的序列，并且擴(kuò)增了的信號(hào)被檢測(cè)到。
提供了方法和化合物，所述方法和化合物在利用特異性結(jié)合檢測(cè)法對(duì)至少一個(gè)靶分子的檢測(cè)中用于信號(hào)擴(kuò)增。雖然本文詳細(xì)的提供了示例性的寡核苷酸和RNA多核苷酸，本文公開的方法和化合物也可以被用于檢測(cè)其它分子的結(jié)合，例如多肽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了檢測(cè)靶核酸的方法，其中所述方法包括將優(yōu)選標(biāo)記的靶核酸(例如RNA多核苷酸)雜交到包含在微球體上的固定的寡核苷酸上，其中所述靶多核苷酸包含能被識(shí)別和/或否則被受體結(jié)合的標(biāo)記。將雜交的靶核酸與受體接觸，所述受體可包含多個(gè)能夠結(jié)合靶多核苷酸上的標(biāo)記的位點(diǎn)，并且將所述受體與配體接觸，所述配體可包含對(duì)多個(gè)受體的結(jié)合能力。然后配體與其受體的結(jié)合物和需要的雜交的靶核酸的存在可以被檢測(cè)到，例如，通過檢測(cè)在至少其中一個(gè)受體和配體上的可檢測(cè)的標(biāo)記。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在將配體與結(jié)合了雜交的靶核酸的受體相結(jié)合之后，配體與標(biāo)記的受體分子接觸，并且此與配體結(jié)合的標(biāo)記的受體分子被檢測(cè)到。這令可檢測(cè)的信號(hào)可被增強(qiáng)并更容易被檢測(cè)到。
此外，提供了本發(fā)明涉及的組合物，其中所述組合物包括一種包含至少一個(gè)標(biāo)記的靶多核苷酸、一種受體和一種可包含至少一個(gè)標(biāo)記的配體。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體是所述受體的一種抗體，并且此受體是抗生物素蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種微球體，它包含至少一個(gè)固定在其上的、雜交到一種標(biāo)記的靶多核苷酸的寡核苷酸探針，其中靶多核苷酸上的標(biāo)記與至少一個(gè)受體相結(jié)合，在一些實(shí)施方案中所述受體包含多個(gè)能夠結(jié)合所述標(biāo)記的位點(diǎn)，并且其中受體與至少一個(gè)配體相結(jié)合，所述配體被標(biāo)記并產(chǎn)生一種擴(kuò)增了的信號(hào)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，靶多核苷酸與一種寡核苷酸探針的雜交在包含一種緩沖液的雜交溶液中進(jìn)行。
在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供雜交的小珠熒光信號(hào)的擴(kuò)增，所述擴(kuò)增通過一種受體，例如抗生物素蛋白鏈菌素，優(yōu)選的具有一種標(biāo)記如藻紅蛋白，與生物素標(biāo)記的山羊IgG/抗抗生物素蛋白鏈菌素抗體的共同使用而實(shí)現(xiàn)。在具體的實(shí)施方案中，此擴(kuò)增利用特定的試劑和孵育條件。這些條件可以包括一種搖動(dòng)檢測(cè)板，在約45℃以52rad/s(500rpm)孵育過夜；檢測(cè)的雜交/洗滌步驟使用0.5X TMAC緩沖液；和/或在每孔使用的混合物(在這里也指多個(gè)小珠)中有總計(jì)約1000個(gè)小珠。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明可利用約500個(gè)微球體(一個(gè)分析物，其中術(shù)語(yǔ)“分析物”指被分析的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)至最多約100,000個(gè)微球體(100個(gè)分析物)。通過結(jié)合使用抗生物素蛋白鏈菌素藻紅蛋白和生物素標(biāo)記的山羊IgG/抗抗生物素蛋白鏈菌素抗體進(jìn)行的雜交小珠熒光信號(hào)的擴(kuò)增，可以在0.5X TMAC緩沖體系或1X MES緩沖體系中進(jìn)行。
通過本發(fā)明的出現(xiàn)提供了特別的優(yōu)點(diǎn)。例如，本發(fā)明從基因組表達(dá)微陣列檢測(cè)結(jié)果中復(fù)制數(shù)據(jù)，通過對(duì)數(shù)量經(jīng)過選擇的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行分析，所述檢測(cè)結(jié)果有利于檢測(cè)法在預(yù)言方面的能力。即，本發(fā)明包括提供了一種與基因組表達(dá)微陣列數(shù)據(jù)最一致的檢測(cè)法的實(shí)施方案。在具體的實(shí)施方案中，一種檢測(cè)多種基因的微陣列檢測(cè)法可提供關(guān)于目標(biāo)基因的信息。在所述的鑒定之外，本發(fā)明的檢測(cè)法還提供一種更加集中的檢測(cè)法以檢測(cè)這些目標(biāo)基因中特定的一部分。
本發(fā)明提高了對(duì)基因，甚至是那些低豐度基因的檢測(cè)的靈敏度。例如，在具體的實(shí)施方案中僅需提供小量的cRNA，例如甚至低至約1.0μg的量。此外，利用公開的緩沖體系，本發(fā)明提供低百分比的小珠集合物和每孔中小珠持續(xù)的高數(shù)量。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)涉及用于寡核苷酸的選擇和用于檢測(cè)數(shù)據(jù)的分析所用改進(jìn)方法的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。
在其它的具體實(shí)施方案中涉及一種用于選擇最佳的一種或多種寡核苷酸的算法，所述算法基于一種現(xiàn)有的寡核苷酸選擇檢測(cè)法。在具體的實(shí)施方案中，所述寡核苷酸選擇檢測(cè)法是市售的，例如Affymetrix GeneChip檢測(cè)法。在具體的實(shí)施方案中，每次檢測(cè)中分析物的數(shù)量為約1至約100個(gè)。
技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到本發(fā)明的參數(shù)的變化完全處于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。此外，技術(shù)人員知道怎樣調(diào)節(jié)這些參數(shù)以最優(yōu)化結(jié)果。例如，檢測(cè)法中雜交步驟的持續(xù)時(shí)間可以是最小約3小時(shí)，但是可以持續(xù)至少約18小時(shí)。同樣地，檢測(cè)法中雜交步驟的溫度可以是約45℃至48℃，但是視所需的結(jié)果而定的其它的溫度也可以是合適的。需提供的多核苷酸的量可以少至以多核苷酸復(fù)雜混合物形式提供的1μg至10μg，所述多核苷酸復(fù)雜混合物例如總RNA、mRNA或cRNA。
在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)擴(kuò)增的信號(hào)，但是其它檢測(cè)擴(kuò)增信號(hào)的方法也是合適的并屬于本發(fā)明的范圍。BioPlex和Luminex 100分析儀將小珠從板孔中轉(zhuǎn)移到并通過流式細(xì)胞儀，所述小珠在流式細(xì)胞儀中被一種雙激光體系鑒定并讀取。第一激光通過激發(fā)小珠內(nèi)的熒光團(tuán)鑒定被分析物，而第二激光測(cè)量結(jié)合到小珠上所連結(jié)的多核苷酸上的檢測(cè)對(duì)象的量。這通過激發(fā)雜交到小珠上的檢測(cè)對(duì)象上的藻紅蛋白標(biāo)記實(shí)現(xiàn)。檢測(cè)的動(dòng)態(tài)范圍得到擴(kuò)展，允許多元平臺(tái)中的低豐度和高豐度轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的定量。應(yīng)用此檢測(cè)法的推薦體積的范圍為約65μL至125μL，此范圍是制造商提供的指導(dǎo)范圍。
以下描述提供關(guān)于本發(fā)明的實(shí)施方案的示例性的細(xì)節(jié)，盡管技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明的新特點(diǎn)可以被改變并在改變后依然在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
寡核苷酸的選擇在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，固定的寡核苷酸探針可以用非隨機(jī)的方法進(jìn)行選擇，這種方法也被稱為非任意的方法。寡核苷酸可以是預(yù)優(yōu)化的，這是指在本發(fā)明的檢測(cè)步驟之前使寡核苷酸先經(jīng)受一個(gè)檢測(cè)步驟，以測(cè)定它對(duì)本發(fā)明的檢測(cè)法的適用性和/或縮窄本發(fā)明的檢測(cè)法所利用的寡核苷酸的范圍，以達(dá)到效率和/或經(jīng)濟(jì)的目的。例如，一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸可以經(jīng)受一種基于雜交的檢測(cè)，其中包含多個(gè)多核苷酸的樣品被提供給所述一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸，并根據(jù)對(duì)雜交情況的檢測(cè)，測(cè)定在給定參數(shù)下(例如一種具體的一個(gè)或多個(gè)基因序列)哪種或哪些寡核苷酸提供了最好的信號(hào)。在具體的實(shí)施方案中，所述參數(shù)下的雜交信號(hào)被稱為雜交指紋。從這種雜交指紋中可以測(cè)定哪種或哪些寡核苷酸最適用于本文所述的本發(fā)明的檢測(cè)法。在具體的實(shí)施方案中，這種測(cè)定包括算法的使用。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，算法包括三個(gè)主要的部分。這些部分用于選擇基因的探針，所述基因包括經(jīng)過試驗(yàn)條件發(fā)生改變的基因、經(jīng)過試驗(yàn)條件保持不變的基因(例如“管家基因”)或用于評(píng)估試驗(yàn)質(zhì)量的基因如GAPDH(3’末端)或GAPDH(中間)。
在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用來自以前的微陣列研究的算法結(jié)果，包括基因表達(dá)值(信號(hào)值)以及試驗(yàn)中來自所有微陣列的單個(gè)寡核苷酸探針?biāo)綇?qiáng)度。典型的研究將有一個(gè)或多個(gè)變化的條件，例如劑量水平、化學(xué)活性試劑、暴露時(shí)間等等。一個(gè)或多個(gè)這種研究提供數(shù)據(jù)，基于這些數(shù)據(jù)進(jìn)行探針選擇。
對(duì)于經(jīng)過變化的條件發(fā)生改變的基因，選擇基于在基因表達(dá)值和探針?biāo)綇?qiáng)度之間的相關(guān)性的檢驗(yàn)值。對(duì)每個(gè)探針來說，在減去錯(cuò)配強(qiáng)度和不減去錯(cuò)配強(qiáng)度情況下的檢驗(yàn)值都被計(jì)算。同樣對(duì)每對(duì)探針、每三個(gè)探針、和每四個(gè)探針進(jìn)行計(jì)算，因?yàn)閷⒁粋€(gè)以上的探針(與或不與它的相應(yīng)的錯(cuò)配探針一起)包括在內(nèi)，可能導(dǎo)致更好的相關(guān)性。在對(duì)一對(duì)、三個(gè)、和四個(gè)探針進(jìn)行計(jì)算時(shí)，檢測(cè)探針序列以測(cè)定重疊的量。例如，最好的三個(gè)探針可能比最好的一對(duì)探針稍好，并且所述三個(gè)探針由所述一對(duì)探針外加一個(gè)重疊探針組成。在這種情況下，所述重疊探針的加入可能不帶來顯著的額外好處。
對(duì)于利用經(jīng)過試驗(yàn)條件不發(fā)生改變的基因的實(shí)施方案，一個(gè)目標(biāo)是最小化獲得信噪比的可變性的測(cè)量值。具體地講，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)被使用，它被表示為標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)平均值的比率。對(duì)每個(gè)完全匹配(PM)探針，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差使用每個(gè)探針的探針?biāo)綇?qiáng)度進(jìn)行計(jì)算，對(duì)每對(duì)“完全匹配-錯(cuò)配”(PM-MM)探針對(duì)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差使用完全匹配和錯(cuò)配(MM)探針?biāo)綇?qiáng)度的差異進(jìn)行計(jì)算。選擇有最低RSD的探針。
對(duì)于利用用于評(píng)估試驗(yàn)質(zhì)量的基因的實(shí)施方案，一個(gè)質(zhì)量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)是3′/5′比率，所述比率從針對(duì)GAPDH(3’末端)的探針組和針對(duì)GAPDH(5’末端)的探針組算出。這個(gè)比率在一個(gè)微陣列與下一個(gè)微陣列之間可能不同。計(jì)算每對(duì)探針p1和p2的所述比率，其中p1選自針對(duì)GAPDH(3’末端)的探針組而p2選自針對(duì)GAPDH(5’末端)的探針組。
因此，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明中利用的算法具有以下選擇標(biāo)準(zhǔn)中的至少一個(gè)(a)選擇具有信號(hào)值的最高相關(guān)性檢驗(yàn)值的PM探針(這涉及檢查相關(guān)性圖以確保相關(guān)性檢驗(yàn)值不受異常值的影響；(b)選擇PM和MM探針對(duì)，其縮放的(或未縮放的)PM-MM探針?biāo)街稻哂行盘?hào)值的最高的相關(guān)性測(cè)量值；(c)選擇探針對(duì)(從兩個(gè)不同的探針組)，其比率與信號(hào)比率最相關(guān)；和/或(d)選擇具有最小可變性測(cè)量值(具體地講，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)的PM探針。
所述算法可以利用以下選擇標(biāo)準(zhǔn)中的至少一種(a)選擇至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中此被選擇的至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸具有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)值的可接受的相關(guān)性檢驗(yàn)值；(b)選擇至少一種完全匹配的和略錯(cuò)配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸對(duì)，其中在一對(duì)內(nèi)，被選擇的至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸減去錯(cuò)配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸具有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)值的可接受的相關(guān)性檢驗(yàn)值；(c)從不同的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸對(duì)中選擇至少一對(duì)預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中在所述至少一對(duì)預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸中的所述預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸中的信號(hào)比率，具有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)比率的可接受的相關(guān)性；和(d)選擇至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中此完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸具有可接受的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
關(guān)于術(shù)語(yǔ)“可接受的相關(guān)性水平”，本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到優(yōu)選地使用最高水平的相關(guān)性，但是其它基本上類似的相關(guān)性值在本發(fā)明中也適用。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到檢驗(yàn)相關(guān)性有不同的方法，包括Pearson’s r、Spearman秩相關(guān)與多種參數(shù)的、非參數(shù)的和粗程序的可選方法。技術(shù)人員知道，術(shù)語(yǔ)“參數(shù)的”是指基于估計(jì)一個(gè)模型中的一種具體的相關(guān)性參數(shù)；術(shù)語(yǔ)“非參數(shù)的”是指基于秩或排列的方法；術(shù)語(yǔ)“粗程序的”是指對(duì)異常數(shù)據(jù)靈敏度較低的方法。
本文所用術(shù)語(yǔ)“標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)值”是指獲取自至少一個(gè)以前的微陣列輸出結(jié)果的值。此術(shù)語(yǔ)應(yīng)用到所有種類的平臺(tái)和檢測(cè)法，但是在具體的實(shí)施方案中，它是一種AffymetrixGeneChip微陣列檢測(cè)法的標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)值(也稱為平均差值)。
本文所用術(shù)語(yǔ)“標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)比率”是指來自各個(gè)寡核苷酸對(duì)的信號(hào)比率的加權(quán)和。
配體配體可以是任何包含識(shí)別和/或結(jié)合受體能力的化學(xué)物質(zhì)。優(yōu)選地，擴(kuò)增活性包括多個(gè)能夠結(jié)合受體的配體。在靶多核苷酸中和/或在靶多核苷酸末端的標(biāo)記，所述靶多核苷酸例如示例性的RNA多核苷酸，也能夠結(jié)合受體，例如經(jīng)由非共價(jià)的特異性結(jié)合相互作用。
在一個(gè)實(shí)施方案中，配體可以包括一種抗體。本文使用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指一種免疫球蛋白分子或其具有特異性結(jié)合特定抗原的能力的片段。抗體可以是一種對(duì)所述檢測(cè)法中使用的受體具有特異性的抗受體抗體。因此，此抗體能夠特異性地結(jié)合作為抗原的受體?？贵w和它們的制造方法為免疫學(xué)領(lǐng)域所熟知?？贵w可以被生產(chǎn)，例如，通過雜交瘤細(xì)胞系、通過免疫引起多克隆抗體反應(yīng)、和/或通過已經(jīng)被編碼抗體的重組DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組宿主細(xì)胞?？贵w包括但不限于任何同種型的免疫球蛋白分子(IgA、IgG、IgE、IgD、IgM)，和/或包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Facb、Fv、ScFv、Fd、VH和VL的活性片段。抗體包括但不限于單鏈抗體、嵌合抗體、突變型、融合蛋白、人源化抗體和/或任何其它經(jīng)修飾的免疫球蛋白分子的構(gòu)型，該免疫球蛋白分子包含一個(gè)具有所需特異性的抗原識(shí)別位點(diǎn)。
配體優(yōu)選地包含至少一個(gè)標(biāo)記和在一些實(shí)施方案中包含多個(gè)標(biāo)記。優(yōu)選地，所述標(biāo)記被共價(jià)地連接到配體。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記包含生物素，受體是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素，而配體是一種抗抗生物素蛋白鏈菌素抗體。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，例如，多個(gè)生物素分子，例如約3至10個(gè)生物素分子，被共價(jià)結(jié)合到抗體上。
抗體，包括抗體片段和其它經(jīng)修飾的形式，其制備被描述于，例如“Immunochemistry in Practice，”Johnstone和Thorpe，Eds.，Blackwell Science，Cambridge，Mass.，1996；“AntibodyEngineering，”第2版，C.Borrebaeck，Ed.，Oxford UniversityPress，New York，1995；“Immunoassay”，E.P.Diamandis和T.K.Christopoulos，Eds.，Academic Press，Inc.，San Diego，1996；“Handbook of Experimental Immunology，”Herzenberg等人，Eds，Blackwell Science，Cambridge，Mass.，1996；和“Current Protocolsin Molecular Biology”F.M.Ausubel等人，Eds.，Greene Pub.Associates和Wiley Interscience，1987，它們的公開內(nèi)容均引入此文，以供參考。同樣，多種抗體可商購(gòu)獲得。
利用抗體進(jìn)行的擴(kuò)增在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種用于檢測(cè)靶多核苷酸與一種寡核苷酸探針之間的雜交的方法，所述靶多核苷酸例如一種RNA多核苷酸，所述寡核苷酸探針例如一種連接到微球體的寡核苷酸。所述寡核苷酸優(yōu)選固定在微球體的表面。在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記優(yōu)選地通過共價(jià)連接被結(jié)合到靶多核苷酸上。
在一種檢測(cè)法中，固定的寡核苷酸依次接觸，例如，包含至少一個(gè)標(biāo)記的靶多核苷酸、包含一個(gè)或多個(gè)能夠結(jié)合所述標(biāo)記的位點(diǎn)的受體和一個(gè)抗受體抗體，所述抗受體抗體包含一個(gè)或多個(gè)優(yōu)選地共價(jià)連接到此抗體的標(biāo)記。如果寡核苷酸探針已經(jīng)雜交到靶多核苷酸，那么就形成了一個(gè)包含靶多核苷酸、受體和抗體的至少一個(gè)標(biāo)記的復(fù)合物。所得的復(fù)合物被檢測(cè)，例如通過提供和檢測(cè)抗體上的一個(gè)可檢測(cè)的標(biāo)記，或通過使復(fù)合態(tài)的抗體接觸并檢測(cè)帶標(biāo)記的可檢測(cè)受體分子，此受體分子能夠結(jié)合到抗體上的至少一個(gè)標(biāo)記分子。對(duì)標(biāo)記的檢測(cè)由此提供了一種靶核酸與探針雜交的陽(yáng)性指示劑，并且通過這些方法得到擴(kuò)增。
在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記和受體分別是生物素和抗生物素蛋白鏈菌素。在這個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種測(cè)定靶多核苷酸與固定的寡核苷酸探針雜交的方法。提供了標(biāo)記的靶多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，方法包括使固定的寡核苷酸探針接連接觸，例如以下物質(zhì)一種示例性的生物素標(biāo)記的靶多核苷酸；示例性的抗生物素蛋白鏈菌素；一種示例性的包含多個(gè)生物素的生物素標(biāo)記的抗抗生物素蛋白鏈菌素抗體；和標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素分子。抗生物素蛋白鏈菌素被可檢測(cè)的標(biāo)記物標(biāo)記，所述標(biāo)記物例如熒光標(biāo)記物。在這個(gè)實(shí)施方案中，靶多核苷酸與探針通過雜交的結(jié)合可以被高靈敏度地檢測(cè)到。在寡核苷酸探針和靶多核苷酸雜交時(shí)，靶僅包括一個(gè)或一些抗生物素蛋白鏈菌素能結(jié)合的生物素部分。在一些實(shí)施方案中，在抗生物素蛋白鏈菌素與生物素標(biāo)記的靶多核苷酸結(jié)合時(shí)，生物素分子的數(shù)量被極大的擴(kuò)增。在同一實(shí)施方案中，在標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素結(jié)合到抗體上的生物素時(shí)，可檢測(cè)的標(biāo)記的數(shù)量被極大地?cái)U(kuò)增，從而極大地增強(qiáng)了檢測(cè)法的靈敏度。
標(biāo)記及其檢測(cè)在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，提供的標(biāo)記存在于本文所述發(fā)明的一個(gè)組分上，或和該組分一起被提供。技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，標(biāo)記可以是可檢測(cè)的，或者可供選擇地作為另一個(gè)組分的結(jié)合對(duì)象，所述另一個(gè)組分例如受體，所述標(biāo)記也可以不被檢測(cè)，例如不被直接地檢測(cè)。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶多核苷酸如RNA多核苷酸的標(biāo)記是生物素，受體是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素。例如在其中的配體是一種抗體的實(shí)施方案中，生物素可以被共價(jià)結(jié)合到抗體上。例如，抗體可以是一種包含多個(gè)共價(jià)結(jié)合到所述抗體的生物素分子的抗抗生物素蛋白鏈菌素抗體。在一個(gè)檢測(cè)中，在抗體結(jié)合到與生物素標(biāo)記的靶多核苷酸結(jié)合的抗生物素蛋白鏈菌素受體上之后，抗體可以接觸標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素，從而將多個(gè)標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素分子結(jié)合到抗體上，并且與抗體結(jié)合的標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素分子因此能被檢測(cè)到，這樣即在此檢測(cè)中實(shí)現(xiàn)了信號(hào)擴(kuò)增。
標(biāo)記可以在配體、受體和/或靶多核苷酸上被提供。標(biāo)記的實(shí)施例包括熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記和無機(jī)標(biāo)記如金標(biāo)記，以及酶標(biāo)記。
標(biāo)記可以被稱為可檢測(cè)的，例如通過顯色檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)和熒光檢測(cè)。示例性的標(biāo)記包括標(biāo)記酶，例如堿性磷酸酶、β-半乳醣苷酶或辣根過氧化物酶，它們用顯色底物檢測(cè)。例如，堿性磷酸酶可以使用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽或硝基氮藍(lán)四唑鹽進(jìn)行檢測(cè)。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素可以與熒光標(biāo)記結(jié)合，例如在具體的實(shí)施方案中的藻紅蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用的可檢測(cè)的抗生物素蛋白鏈菌素是抗生物素蛋白鏈菌素藻紅蛋白，它是市售的，例如可購(gòu)自Molecular Probes(Eugene，Oreg.)。生物素標(biāo)記的抗抗生物素蛋白鏈菌素抗體可購(gòu)自，例如VectorLaboratories(Burlingame，Calif.)。
抗生物素蛋白-生物素體系已經(jīng)被發(fā)展用于多種檢測(cè)分析法。生物素體系中的核酸檢測(cè)和標(biāo)記的方法被描述在，例如，“NonradioactiveLabeling and Detection Systems”，C.Kessler，Ed.，Springer-Verlag，New York，1992，第70至99頁(yè)；和在“Methods inNonradioactive Detection，”，G.Howard，Ed.，Appleton和Lange，Norwalk，Conn.1993，第11至27頁(yè)和137至150頁(yè)。
熒光標(biāo)記如藻紅蛋白、熒光黃、羅丹明、試鹵靈和它們的衍生物，以及香豆素如羥基香豆素，可以被用在本發(fā)明中。此外，熒光共振能量轉(zhuǎn)移可以被測(cè)量，這描述在Cardullo，Nonradiative FluorescenceResonance Energy Transfer在“Nonradioactive Labeling andDetection of Biomolecules”，C.Kessler，Ed.，Springer-Verlag，New York，1992，第414至423頁(yè)，其公開內(nèi)容均引入此文，以供參考?？晒┻x擇地，無機(jī)標(biāo)記可以被用于本發(fā)明，例如膠體金顆?；蜩F蛋白。膠體金顆粒用作標(biāo)記被描述在，例如Van de Plas和Leunissen，Colloidal Gold as a Marker in Molecular BiologyThe Use ofUltra-Small Gold Particles，在“Nonradioactive Labeling andDetection of Biomolecules”，C.Kessler，Ed.，Springer-Verlag，New York，1992，第116至126頁(yè)，其公開內(nèi)容均引入此文，以供參考。
用熒光標(biāo)記標(biāo)記抗生物素蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白的試劑是市售的。例如，示例性的試劑5(6)-羧基熒光素-N-羥基琥珀酰亞胺酯(FLUOS)、7-氨基-4-甲基-香豆素-3-乙酸-N′-羥基琥珀酰亞胺酯(AMCA，活化的)和異硫氰酸熒光素(FITC)是市售的，可購(gòu)自BoehringerMannheim，Indianapolis，Ind。用熒光標(biāo)記物對(duì)蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記的方法和檢測(cè)熒光標(biāo)記的方法被描述在Howard，G.，Labeling Proteinswith Fluorochromes，在“Methods in NonradioactiveDetection，”，G.Howard，Ed.，Appleton和Lange，Norwalk，Conn.1993，第39至68頁(yè)，其公開內(nèi)容均引入此文，以供參考。此外，有多種市售的標(biāo)記的抗生物素蛋白鏈菌素和抗生物素蛋白分子。非限制性實(shí)施例包括抗生物素蛋白鏈菌素-金、抗生物素蛋白鏈菌素-熒光染料、抗生物素蛋白鏈菌素-AMCA、抗生物素蛋白鏈菌素-熒光黃、抗生物素蛋白鏈菌素-藻紅蛋白(SAPE)、抗生物素蛋白鏈菌素-磺酰羅丹明101、抗生物素蛋白-FITC和抗生物素蛋白-Texas red，它們可購(gòu)自BoehringerMannheim，Indianapolis，Ind.。
本領(lǐng)域?qū)?biāo)記連接到多核苷酸的可用的方法是已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有共價(jià)連接的標(biāo)記的核酸可以使用DNA合成儀和標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酰胺試劑進(jìn)行合成。例如，可以使用用于直接標(biāo)記合成的寡核苷酸的生物素亞磷酰胺。生物素亞磷酰胺可購(gòu)自Glen Research Corporation，Sterling，Va。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在標(biāo)記是生物素的情況下，生物素標(biāo)記的靶DNA可以使用切口平移和隨機(jī)引物延伸進(jìn)行制備，而生物素標(biāo)記的靶RNA可以通過利用RNA聚合酶進(jìn)行的體外轉(zhuǎn)錄進(jìn)行合成。生物素標(biāo)記的脫氧核苷三磷酸和核苷三磷酸已經(jīng)被用于生物素標(biāo)記的DNA和生物素標(biāo)記的RNA的酶促制備。示例性的方法被詳細(xì)公開在Rashtchian和Mackey，Labeling and Detection of Nucleic Acids，在“NonradioactiveLabeling and Detection of Biomolecules”，C.Kessler，Ed.，Springer-Verlag，New York，1992，第70至84頁(yè)。生物素分子的濃度可以通過使用補(bǔ)骨脂素生物素試劑來提高，如在Levenson等人，Methods Enzymol.，184577-583(1990)；和Cimono等人，Ann.Rev.Biochem.541151-1193(1985)中所述，上述每份文獻(xiàn)的公開內(nèi)容均引入此文，以供參考。背景雜交可以通過對(duì)生物素標(biāo)記的靶核酸進(jìn)行HPLC純化得到減少。
標(biāo)記例如生物素，可以使用本領(lǐng)域可用的方法被連接到配體，例如聚合物，包括抗體上。示例性的方法被詳細(xì)公開在Bayer和Wilchek，Labeling and Detection of proteins and Glycoproteins，在“Nonradioactive Labeling and Detection of Biomolecules”，C.Kessler，Ed.，Springer-Verlag，New York，1992，第91至100頁(yè)及其所引用的參考文獻(xiàn)，所述文獻(xiàn)及其參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容均引入此文，以供參考。此外，生物素化抗體如生物素化抗抗生物素蛋白鏈菌素分子是市售的，例如可購(gòu)自Vector Laboratories(Burlingame，Calif.)。
標(biāo)記受體對(duì)本文所用短語(yǔ)“標(biāo)記-受體對(duì)”是指一種標(biāo)記和受體，它們是能互相夠識(shí)別并互相結(jié)合的化學(xué)成分。所述標(biāo)記和受體可以是能夠互相識(shí)別并互相結(jié)合形成復(fù)合物的任何成分。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)記和受體可以經(jīng)由第三種中間物質(zhì)的結(jié)合而互相作用。典型地，構(gòu)成標(biāo)記-受體對(duì)的標(biāo)記和受體是彼此經(jīng)受特異性非共價(jià)結(jié)合相互作用的結(jié)合分子。標(biāo)記和受體可以是天然存在的或人工生產(chǎn)的，并且任選地可以與其它種類集合。
優(yōu)選地，標(biāo)記-受體對(duì)包括一個(gè)受體，它能夠結(jié)合多個(gè)，例如，2、3、4或更多個(gè)此種標(biāo)記分子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，標(biāo)記-受體對(duì)分別是生物素-抗生物素蛋白，或者分別是生物素-抗生物素蛋白鏈菌素。維生素生物素通過結(jié)合從蛋清中分離的指示蛋白抗生物素蛋白或從鏈霉菌(Streptomyces avidinii)中分離的抗生物素蛋白鏈菌素而得到檢測(cè)?？股锼氐鞍缀涂股锼氐鞍祖溇赜兴膫€(gè)生物素高親和力結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合常數(shù)為約K＝1015mol-1。Kessler，Overview of NonradioactiveLabeling Systems在“Nonradioactive Labeling and Detection ofBiomolecules”，C.Kessler，Ed.，Springer-Verlag，New York，1992，第27至34頁(yè)，其公開內(nèi)容均引入此文以供參考。
本文公開的檢測(cè)方法使用的配體能被連接到本領(lǐng)域中可用的多個(gè)標(biāo)記-受體結(jié)合對(duì)中任何一個(gè)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在核酸雜交檢測(cè)中使用一種能夠雜交到靶多核苷酸的固定的寡核苷酸，靶多核苷酸包含一種構(gòu)成一個(gè)標(biāo)記-受體結(jié)合對(duì)中的一個(gè)部分的標(biāo)記。此外，配體可以包含多個(gè)標(biāo)記。優(yōu)選地，標(biāo)記-受體對(duì)的受體能夠結(jié)合一個(gè)以上的標(biāo)記分子。例如，標(biāo)記可以是生物素，受體可以是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白鏈菌素，它們中的每個(gè)能夠結(jié)合四個(gè)生物素分子。靶多核苷酸與寡核苷酸探針的雜交可以通過檢測(cè)靶多核苷酸的標(biāo)記與受體的結(jié)合、進(jìn)一步通過檢測(cè)受體與配體的結(jié)合和進(jìn)一步通過檢測(cè)結(jié)合到配體的標(biāo)記的受體的結(jié)合，而得到檢測(cè)。配體通過，例如提供所述配體上的一種標(biāo)記，或?qū)⒍鄠€(gè)標(biāo)記的受體分子與此配體結(jié)合而得到檢測(cè)。
雜交技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到兩種每個(gè)都有至少一個(gè)單鏈區(qū)域的核酸互相雜交的能力取決于多個(gè)方面，包括兩個(gè)分子的單鏈區(qū)域間的互補(bǔ)程度和雜交反應(yīng)條件的嚴(yán)謹(jǐn)性。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，雜交是在一種固定的寡核苷酸探針和一種輸入的靶多核苷酸之間，所述靶多核苷酸例如一種RNA多核苷酸如mRNA。在具體的實(shí)施方案中，雜交條件是在固定的寡核苷酸的整個(gè)序列和靶多核苷酸的至少一部分之間完全互補(bǔ)這種情況下的雜交條件。
本領(lǐng)域中進(jìn)行核酸雜交檢測(cè)的方法已經(jīng)得到很好的發(fā)展。雜交檢測(cè)程序和條件將隨應(yīng)用發(fā)生變化，并依照本領(lǐng)域已知的常規(guī)結(jié)合方法進(jìn)行選擇。
在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明利用特定的緩沖液和緩沖濃度。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，由1X TMAC制得的0.5X TMAC，被用于懸浮樣品多核苷酸和/或用作雜交緩沖液。技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到1X TMAC包含3M TMAC、0.1％十二烷基肌氨酸鈉、50mM Tris-HCl pH8.0和4mM EDTApH 8.0。
對(duì)一些要求高選擇性的應(yīng)用來說，典型地希望使用相對(duì)高嚴(yán)謹(jǐn)性的條件來形成雜交產(chǎn)物。例如，相對(duì)低的鹽和/或相對(duì)高的溫度條件，例如約0.02M至約0.10M的NaCl，在約50℃至約70℃的溫度下提供的條件。這種高嚴(yán)謹(jǐn)性條件即使允許寡核苷酸探針和靶多核苷酸之間的錯(cuò)配，也只能允許極少數(shù)的錯(cuò)配出現(xiàn)。通常認(rèn)為通過增加甲酰胺的量能提供更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件。
對(duì)一些應(yīng)用來說，低嚴(yán)謹(jǐn)性條件是優(yōu)選的。在這些條件下，即使雜交鏈的序列不完全匹配，雜交也可以發(fā)生，但是在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)存在錯(cuò)配。通過增加鹽濃度和/或降低溫度可導(dǎo)致條件的嚴(yán)謹(jǐn)性較低。例如，中等嚴(yán)謹(jǐn)性條件可以通過約0.1至0.25M NaCl，在約37℃至約55℃溫度下獲得，而低嚴(yán)謹(jǐn)性條件可以通過約0.15M至約0.9M鹽，在約20℃至約55℃溫度下獲得。雜交條件可根據(jù)所需的結(jié)果容易地進(jìn)行操縱，并且技術(shù)人員知道怎樣進(jìn)行這種操縱。
在其它的實(shí)施方案中，雜交在以下條件下完成，例如50mM Tris-HCl(pH 8.3)，75mM KCl，3mM MgCl2，1.0mM二硫蘇糖醇，溫度約20℃至約37℃。其它利用的雜交條件包括約10mM Tris-HCl(pH 8.3)，50mMKCl，1.5mM MgCl2，溫度為約40℃至約72℃。
其它本領(lǐng)域常用的核酸雜交緩沖液包括磷酸和TRIS緩沖液，例如約pH6至約pH8的所述緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用了一種標(biāo)準(zhǔn)乙二胺四乙酸磷酸鹽(“SSPE”)緩沖液。一種示例性的磷酸緩沖液包括0.06M H2PO4/HPO4、1M Na+、0.006M EDTA(乙二胺四乙酸)、0.005％Triton，pH約為6.8，本文稱之為“6XSSPE-T”。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，提供了一種用于進(jìn)行核酸雜交檢測(cè)的方法，其中雜交液包含一種磺酸緩沖液?；撬犭s交緩沖液包括2-[N-嗎啉]乙磺酸(“MES”)和3-[N-嗎啉]丙磺酸)(“MOPS”)。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用磺酸緩沖液的雜交檢測(cè)可以使用固定在固體表面如微球體上的核酸探針來進(jìn)行。在核酸探針固定之前，固體表面可以被，例如，硅烷涂層涂敷。在包含磺酸緩沖液的溶液中進(jìn)行的雜交檢測(cè)可以在以下條件下進(jìn)行，例如溫度約25℃至70℃，例如至少約35℃，或45℃或更高，并且經(jīng)過一段時(shí)間，例如約10分鐘至約5小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間，例如約16小時(shí)或更長(zhǎng)?；撬峋彌_液可以被用于例如基因表達(dá)雜交檢測(cè)和其它的雜交檢測(cè)。
例如，雜交緩沖液可以包括約0.01M至約2M的MES或更高，例如，約0.25M的MES，在例如約6至7的pH值下。在一個(gè)實(shí)施方案中，MES緩沖液包括0.25M MES、1M Na+和0.005％TritonX-100，在約5.5至6.7的pH值下，例如6.7。雜交可以在約25℃至70℃、例如約45℃下進(jìn)行。任選地，緩沖液可以在使用前被過濾，例如通過2μm的過濾器。核酸雜交緩沖液可以進(jìn)一步包括表面活性劑，例如Tween-20和Triton-X100，以及添加劑如消泡劑。
試劑盒在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于擴(kuò)增來自基于小珠的寡核苷酸雜交檢測(cè)的信號(hào)的試劑盒，所述試劑盒可包括在合適的包裝中的至少一種以下物質(zhì)微球體、分開的和/或在微球體上的固定的寡核苷酸探針、受體、標(biāo)記和配體，其中配體可以以包含著標(biāo)記的形式提供。檢測(cè)標(biāo)記或檢測(cè)標(biāo)記的擴(kuò)增的試劑也可以被包括在試劑盒中。試劑可以是，例如，在試劑盒中的分開的容器中。試劑盒還可以包括雜交緩沖液、洗滌液、陰性和陽(yáng)性對(duì)照物以及實(shí)施檢測(cè)的書面說明。
實(shí)施例以下的實(shí)施例用以說明本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到下列實(shí)施例中公開的技術(shù)代表了本發(fā)明者發(fā)明的技術(shù)，在本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用中功用良好，因此可考慮用以建立其實(shí)際應(yīng)用的優(yōu)選模式。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到，按照本公開內(nèi)容，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的條件下，在公開的具體實(shí)施方案中可以進(jìn)行很多改變，并仍能獲得相同或相似的結(jié)果。
實(shí)施例1示例性的檢測(cè)規(guī)程本實(shí)施例提供一種示例性的檢測(cè)規(guī)程，其中包含多核苷酸的微球體被用于一種包含cRNA多核苷酸的樣品，在一種寡核苷酸和一種靶多核苷酸之間進(jìn)行雜交孵育，并且用受體處理此復(fù)合物，然后用配體處理受體，然后用標(biāo)記處理配體。
技術(shù)人員能認(rèn)識(shí)到，在本文所述的方法的特定步驟中使用了緩沖液。例如，緩沖液可以被用于懸浮多個(gè)靶多核苷酸如RNA多核苷酸。盡管技術(shù)人員知道，用于孵育、雜交等的條件可以根據(jù)操作過程的需求而加以改變，下文將描述示例性的可用的檢測(cè)條件。
1.小珠裝置的稀釋(一種小珠質(zhì)量控制規(guī)程可以被用于測(cè)定連接后小珠的濃度。例如，一個(gè)小珠被連接到至少一個(gè)寡核苷酸上，并以系列稀釋度進(jìn)行本檢測(cè)以測(cè)定連接到小珠上的寡核苷酸的優(yōu)選的量。進(jìn)行多重的第二次檢測(cè)以測(cè)定與代表其它待分析物的小珠進(jìn)行交叉雜交的可能性。)a)使用0.5X TMAC，緩沖液體積取決于所處理的樣品的量和小珠的數(shù)量；b)標(biāo)準(zhǔn)小珠濃度是107小珠每ml；c)每孔中加入40μl稀釋的小珠混合物(約1000個(gè)小珠每孔)；
用以下方法在1C中得到800μL體積的小珠混合物每2μL小珠稀釋5倍再加上790μL 0.5X TMAC雜交(Hyb)緩沖液；或每2μL小珠稀釋20倍再加上760μL 0.5X TMAC雜交緩沖液。
2.靶cRNA計(jì)算(注意cRNA是濃度為0.5μg/μL的片段)a)用包含M13oligo的0.5X TMAC的雜交緩沖液進(jìn)行稀釋；b)測(cè)定允許多少樣品，包括空白；c)每個(gè)孔中加入20μL cRNA(2μg)；M13 oligo在2×106稀釋液(M13儲(chǔ)備液＝1mM)中稀釋2μL的1mM溶液加998μL TE＝2μM；2μL的2μM溶液加198μL TE＝20nM；2.5μL的20nM溶液加入397.5μL TE＝125pM的工作液。
對(duì)重復(fù)孔，靶cRNA計(jì)算如下對(duì)5μg cRNA每孔，使用25μL儲(chǔ)備cRNA(0.5μg/μL)和25μL0.5X TMAC雜交緩沖液，它包含100阿托摩爾(amol)的M13(15μLM13工作液加235μL 0.5X TMAC雜交緩沖液)。對(duì)2.5μg cRNA每孔，使用12.5μL儲(chǔ)備cRNA(0.5μg/μL)和37.5μL 0.5X TMAC雜交緩沖液，它包含100amol的M13(10μL M13工作液加入240μL 0.5X TMAC雜交緩沖液)。對(duì)2.0μg cRNA每孔，使用10μL儲(chǔ)備cRNA(0.5μg/μL)和40μL 0.5X TMAC雜交緩沖液，它包含100amol的M13(8μL M13工作液加入242μL 0.5X TMAC雜交緩沖液)。
3.試劑a)1X TMAC＝3M TMAC，0.1％十二烷基肌氨酸鈉，50mM Tris-HClpH8.0，4mM EDTA pH8.0，其中0.5X TMAC＝由1X TMAC配制；b)PBS-BSA洗滌緩沖液＝9.7mL PBS+330μL 30％BSA；和c)結(jié)合液體積的測(cè)定，以對(duì)StreptAv每個(gè)樣品200μL，對(duì)抗體每個(gè)樣品100μL為基礎(chǔ)。
StreptAv-PE GoatIgGAnti-StAv儲(chǔ)備濃度1mg/mL儲(chǔ)備濃度10mg/mL儲(chǔ)備濃度0.5mg/mL終濃度20μg/mL終濃度100μg/mL終濃度5μg/mL4.雜交1.依照上述步驟2加入20μL稀釋的探針；
2.依照上述步驟1加入40μL小珠混合物到每孔；3.95℃下孵育2分鐘；4.轉(zhuǎn)移板到恒溫?cái)嚢杵?，上蓋并在45℃，52rad/s(500rpm)下雜交過夜；5.用離心機(jī)在2250g下離心樣品2分鐘，輕彈并移去溶液；6.用100μL的0.5X TMAC洗滌小珠；25℃，52rad/s(500rpm)下?lián)u動(dòng)2分鐘；7.在離心機(jī)2250g下離心樣品2分鐘，輕彈并移去溶液；8.用100μL的PBS-BSA洗滌小珠；25℃，52rad/s(500rpm)下?lián)u動(dòng)2分鐘；9.用離心機(jī)在2250g下離心樣品2分鐘，輕彈并移去溶液；10.加100μL的抗生物素蛋白鏈菌素-PE(StAv-PE)結(jié)合混合物；25℃，52rad/s(500rpm)下?lián)u動(dòng)10分鐘；11.用離心機(jī)在2250g下離心樣品2分鐘，輕彈并移去溶液；12.用100μL的PBS-BSA洗滌小珠；25℃，52rad/s(500rpm)下?lián)u動(dòng)2分鐘；13.用離心機(jī)在2250g下離心樣品2分鐘，輕彈并移去溶液；14.加100μL的第二結(jié)合物(anti-StAv和nGtIgG)；25℃，52rad/s(500rpm)下?lián)u動(dòng)10分鐘；15.用離心機(jī)在2250g下離心樣品2分鐘，輕彈并移去溶液；16.用100μL的PBS-BSA洗滌小珠；25℃，52rad/s(500rpm)下?lián)u動(dòng)2分鐘；17.用離心機(jī)在2250g下離心樣品2分鐘，輕彈并移去溶液；18.加入100μL的第三結(jié)合物(StAv-PE)；25℃，52rad/s(500rpm)下?lián)u動(dòng)10分鐘；19.用離心機(jī)在2250g下離心樣品2分鐘，輕彈并移去溶液；20.用100μL的PBS-BSA洗滌小珠；25℃，52rad/s(500rpm)下?lián)u動(dòng)10分鐘；21.用離心機(jī)在2250g下離心樣品2分鐘，輕彈并移去溶液；22.用65μL PBS-BSA再懸浮，并在Bioplex上讀數(shù)并且
23.在bioplex上運(yùn)行之前充分搖動(dòng)板。
實(shí)施例2寡核苷酸檢測(cè)中的信號(hào)的擴(kuò)增來自基于雜交的寡核苷酸檢測(cè)的信號(hào)的擴(kuò)增依照本文所述進(jìn)行。表1圖示說明了一種對(duì)在不同雜交時(shí)間下的特定的cRNA序列(和對(duì)照物M13)和對(duì)不同樣品參數(shù)(其中低、中和高指來自一種生物樣品的分別的雌二醇水平)的滴定檢測(cè)。倍數(shù)變化的計(jì)算基于樣品輸出對(duì)載體輸出的比率。與本領(lǐng)域已知的方法相比，本發(fā)明提供至少約100倍的信號(hào)擴(kuò)增。
表1對(duì)特定寡核苷酸的滴定檢測(cè)<p>利用T7和SP6引物對(duì)pGKETO2克隆的測(cè)序，確證了僅在73、114和119三個(gè)密碼子中各有一個(gè)堿基與發(fā)表的X86782序列不同的序列。這些核苷酸置換可以在獨(dú)立的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中重復(fù)，因此代表所用雨生紅球藻192.80菌株中的核苷酸序列。
該克隆被用于雨生紅球藻酮酶的表達(dá)。如實(shí)施例3所述進(jìn)行大腸桿菌菌株的轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)和類胡蘿卜素譜的分析。
表1比較了細(xì)菌產(chǎn)生的類胡蘿卜素量表1比較使用兩種不同酮酶---念珠藻屬PCC7120NOST酮酶(實(shí)施例1)和雨生紅球藻酮酶(實(shí)施例4)---的細(xì)菌酮類胡蘿卜素合成。類胡蘿卜素的量以ng/ml培養(yǎng)液表示。
實(shí)施例5擴(kuò)增編碼點(diǎn)形念珠藻ATCC 29133來源的NP196酮酶完整一級(jí)序列的DNA通過PCR方法，從點(diǎn)形念珠藻ATCC 29133(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心菌株)擴(kuò)增編碼點(diǎn)形念珠藻ATCC 29133 NP196酮酶的DNA。
為了從點(diǎn)形念珠藻ATCC 29133懸浮培養(yǎng)物中制備基因組DNA，離心收集細(xì)胞，在液氮中冷凍，并在研缽中碾磨成粉，所述懸浮培養(yǎng)物在25℃、連續(xù)光照及恒定振蕩(150rpm)下于BG 11培養(yǎng)基(1.5g/l NaNO3、0.04g/lK2PO4×3H2O、0.075g/l MgSO4×H2O、0.036g/l CaCl2×2H2O、0.006g/l檸檬酸、0.006g/l檸檬酸鐵銨、0.001g/l EDTA二鈉鎂、0.04g/l Na2CO3、1ml痕量金屬混合物A5+Co(2.86g/l H3BO3、1.81g/l MnCl2×4H2O、0.222g/lZnSO4×7H2O、0.39g/l NaMoO4×2H2O、0.079g/l CuSO4×5H2O、0.0494g/1Co(NO3)2×6H2O))中生長(zhǎng)1周。
表6I型糖尿病縱向分析各簇表示來自I型糖尿病的單一個(gè)體的縱向尿沉積物樣品
參考文獻(xiàn)本說明書中提及的所有專利和公布指示了本發(fā)明相關(guān)的本領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。所有專利和公布均以相同的程度引入本文以供參考，就如同每個(gè)公布均被特別地和個(gè)別地指出以引入本文以供參考一樣。
因此，所有引用文獻(xiàn)的相關(guān)部分均引入本文以供參考；任何文獻(xiàn)的引用不可解釋為是對(duì)其作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)的認(rèn)可。
專利美國(guó)專利6,203,989美國(guó)專利申請(qǐng)2001/0041335美國(guó)專利申請(qǐng)2002/0034753出版物Bhalgat，M.K.，Haugland，R.P.，Pollack，J.S.，Swan，S.，Haugland，R.P.“Green-and red-fluorescent nanospheres for thedetection of cell surface receptors by flow cytometry”，J.Immunolog.Methods 21957-68，1998Dunbar，S.A.，Zee，C.A.V.，Oliver，K.G.，Karem，K.L.，Jacobsen，J.W.“Quantitative，multiplexed detection ofbacterial pathogensDNA and protein applications of the LuminexLabMAPTMsystem”，J.Microbiolog.Meth.53245-252，2003Lindmo，T.，Bormer，O.，Ugelstad，J.，和Nustad，K.“Immunometric assay by flow cytometry using mixtures of twoparticle types of different affinity”，J.Immunolog.Methods126183-189，1990McHugh，T.M.，Miner，R.C.，Logan，L.H.，和Stites，D.P.“Simultaneous Detection of Antibodies to Cytomegalovirus andHerpes Simplex Virus by using flow cytometry and a microsphere-based fluorescence immunoassay”，J.Clin.Microbiol.26(1)1957-1961，1988Spycher，M.O.，Spycher-Burger，M.，Spath，P.J.，和Burckhardt，J.J.“Human serum induced opsonization ofimmunoglobin G-coated polystyrene microspheres with complementcomponents C3 and C4 as measured by flow cytometry”，J.Immunolog.Methods 14583-92，1991Yang，L.，Tran，D.K.，Wang，X.“BADGE，BeadsArray for theDetection ofGeneExpression，a High-Throughput DiagnosticBioassay”，Genome Research 111888-1898，2001雖然本發(fā)明和它的優(yōu)點(diǎn)已得到詳細(xì)的描述，但應(yīng)當(dāng)理解的是，如附加的權(quán)利要求書中所闡釋的那樣，在不背離本發(fā)明定義的精神和范圍的情況下，可以進(jìn)行各種更改、取代和修正。此外，本發(fā)明應(yīng)用的范圍并不規(guī)定受限于本說明書中描述的具體實(shí)施方案的過程、機(jī)器、制造、組合物、手段、方法和步驟。作為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，從本發(fā)明的公開內(nèi)容將容易地了解到，現(xiàn)有的或以后將被發(fā)展的、與本文所述的相應(yīng)的實(shí)施方案實(shí)現(xiàn)現(xiàn)本質(zhì)上相同的功能或達(dá)到本質(zhì)上相同的結(jié)果的過程、機(jī)械、制造、組合物、手段、方法或步驟，可以依照本發(fā)明得到利用。因此，有意識(shí)地在附加的權(quán)利要求書中包括屬于它們范圍內(nèi)的這些過程、機(jī)器、制造、組合物、手段、方法或步驟。
盡管已用具體實(shí)施方案來說明和描述了本發(fā)明，但對(duì)于本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員顯而易見的是，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可作出許多其它的變化和修改。因此，有意識(shí)地在附加的權(quán)利要求書中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。
權(quán)利要求
1.一種擴(kuò)增用于檢測(cè)多核苷酸的信號(hào)的方法，特征在于所述方法包括以下步驟(a)提供至少一種連接到至少一種預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸的微球體；(b)雜交標(biāo)記的靶多核苷酸到所述寡核苷酸以形成寡核苷酸/靶多核苷酸復(fù)合物，其中所述復(fù)合物包含通過受體與所述標(biāo)記的結(jié)合可檢測(cè)的信號(hào)；和(c)為所述受體提供標(biāo)記的配體，其中當(dāng)所述配體結(jié)合所述受體時(shí)，所述信號(hào)被擴(kuò)增。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸用一種算法進(jìn)行選擇。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述算法利用以下選擇標(biāo)準(zhǔn)中的至少一種(a)選擇至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中所述被選擇的至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸具有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)值的可接受的相關(guān)性檢驗(yàn)值；(b)選擇至少一種完全匹配的和略錯(cuò)配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸對(duì)，其中在一對(duì)內(nèi)，所述被選擇的至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸減去所述錯(cuò)配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸具有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)值的可接受的相關(guān)性檢驗(yàn)值；(c)從不同的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸中選擇至少一對(duì)預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中在所述至少一對(duì)預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸中的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸中的信號(hào)比率具有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)比率的可接受的相關(guān)性；和(d)選擇至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中所述完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸具有可接受的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。
4.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸被進(jìn)一步定義為通過以下步驟被選擇提供特征在于包含至少一種靶多核苷酸的樣品；使所述樣品經(jīng)受寡核苷酸陣列，其中雜交所述靶多核苷酸到所述陣列中的至少一個(gè)寡核苷酸上提供可檢測(cè)的雜交指紋；和從所述指紋中鑒定至少一種最佳的寡核苷酸。
5.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸被進(jìn)一步定義為通過以下步驟被選擇提供特征在于包含多個(gè)靶多核苷酸的樣品，所述靶多核苷酸定義為來自一個(gè)以上基因的RNA多核苷酸；使所述樣品經(jīng)受寡核苷酸陣列，其中雜交一個(gè)以上不同RNA多核苷酸到所述陣列中的各自的寡核苷酸上提供一個(gè)以上基因的可檢測(cè)的雜交指紋；和從所述指紋中鑒定至少一種對(duì)于所述一個(gè)以上基因最佳的寡核苷酸。
6.如權(quán)利要求4或5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述鑒定步驟利用一種算法來鑒定所述寡核苷酸。
7.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述算法鑒定與所述靶多核苷酸的至少一部分具有完全互補(bǔ)性的寡核苷酸。
8.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述靶多核苷酸被包含在多個(gè)RNA多核苷酸中，并且所述多個(gè)多核苷酸的濃度為1μg至10μg。
9.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述配體包含抗體。
10.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述靶多核苷酸的標(biāo)記和/或所述配體的標(biāo)記選自熒光標(biāo)記、酶標(biāo)記、化學(xué)標(biāo)記、金標(biāo)記以及它們的混合物。
11.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述靶多核苷酸的標(biāo)記和所述配體的標(biāo)記完全相同。
12.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述微球體被包括在多個(gè)微球體中，并且所述靶多核苷酸被包括在多個(gè)RNA多核苷酸中。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述多個(gè)RNA多核苷酸被包含在包含mRNA的樣品中，所述方法被進(jìn)一步定義為一種用以提供mRNA表達(dá)譜信息的方法。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中在所述多個(gè)微球體中的所述至少一個(gè)微球體包含與所述多個(gè)微球體中的另一個(gè)微球體包含的寡核苷酸不同的寡核苷酸。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中在所述多個(gè)微球體中的至少一個(gè)微球體包含一個(gè)以上不完全相同的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，所述寡核苷酸與相同RNA多核苷酸具有序列互補(bǔ)性。
16.一種組合物，特征在于該組合物包含多個(gè)微球體，每個(gè)微球體連接到至少一個(gè)預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸被雜交到標(biāo)記的RNA多核苷酸上，形成寡核苷酸/標(biāo)記的RNA多核苷酸雜交復(fù)合物，并且其中所述復(fù)合物通過受體與所述標(biāo)記的結(jié)合包含可檢測(cè)的信號(hào)，所述信號(hào)通過所述受體的標(biāo)記的配體的結(jié)合而被擴(kuò)增。
17.如權(quán)利要求16所述的組合物，其中在所述多個(gè)微球體中的至少一個(gè)微球體包含與所述多個(gè)微球體中的另一個(gè)微球體包含的寡核苷酸不同的寡核苷酸。
18.如權(quán)利要求16或17中任一項(xiàng)所述的組合物，其中在所述多個(gè)微球體中的至少一個(gè)微球體包含一個(gè)以上不完全相同的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，所述寡核苷酸各自與相同RNA多核苷酸具有序列互補(bǔ)性。
19.一種最優(yōu)化基于寡核苷酸雜交的檢測(cè)法的方法，特征在于所述方法包括以下步驟提供包含至少一種靶多核苷酸的樣品；使所述樣品經(jīng)受寡核苷酸陣列，其中雜交所述靶多核苷酸到所述陣列中的至少一種寡核苷酸上提供可檢測(cè)的雜交指紋；從所述指紋中鑒定至少一種最佳的寡核苷酸，其中所述鑒定步驟利用被以下選擇標(biāo)準(zhǔn)中至少一種所定義的算法(a)選擇至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中所述被選擇的至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸具有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)值的可接受的相關(guān)性檢驗(yàn)值；(b)選擇至少一種完全匹配的和略錯(cuò)配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸對(duì)，其中在一對(duì)內(nèi)，所述被選擇的至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸減去所述錯(cuò)配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸具有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)基因表達(dá)值的可接受的相關(guān)性檢驗(yàn)值；(c)從不同的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸中選擇至少一對(duì)預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中在所述至少一對(duì)預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸中的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸中的信號(hào)比率具有對(duì)標(biāo)準(zhǔn)信號(hào)比率的可接受的相關(guān)性；和(d)選擇至少一種完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸，其中所述完全匹配的預(yù)優(yōu)化的寡核苷酸具有可接受的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差；和使所述最佳的寡核苷酸經(jīng)受基于寡核苷酸雜交的檢測(cè)法。
全文摘要
本發(fā)明涉及來自基于雜交的寡核苷酸檢測(cè)法的信號(hào)的擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，小珠包含一種來自樣品的雜交到標(biāo)記的多核苷酸上的寡核苷酸，并且由其復(fù)合物產(chǎn)生的信號(hào)通過作用于所述標(biāo)記的受體的標(biāo)記的抗體而被擴(kuò)增。在具體的實(shí)施方案中，所述檢測(cè)法提供基因表達(dá)的信息。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1863926SQ200480028811
公開日2006年11月15日 申請(qǐng)日期2004年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月24日
發(fā)明者S·M·托羅塔里, M·L·杰普, K·D·尤林, B·D·里查德森, J·P·蒂耶曼, J·M·納吉夫 申請(qǐng)人:寶潔公司