專利名稱：一種可控釋放基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖維的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種可控釋放基因藥物的生物降解聚 合物超細(xì)纖維的制備方法。
背景技術(shù)：
核酸物質(zhì)如脫氧核糖核酸(DNA )、核糖核酸(RNA )和反義寡核苷酸(AS0N) 等作為基因治療藥物，在疾病治療和組織工程中顯示出巨大的優(yōu)勢和潛力。但 是，這些核酸物質(zhì)穿透細(xì)胞膜的能力差，同時(shí)容易被核酸酶降解，經(jīng)靜脈注射 入體內(nèi)后，很快從血漿中被清除。因此常將基因藥物先與病毒載體或非病毒載 體結(jié)合形成納米粒子，再通過注射的方式進(jìn)入體內(nèi)。病毒載體由于其免疫原性 和潛在的致病性等安全隱患，正逐漸被非病毒載體所代替。而非病毒載體通過 注射的方式ii7v體內(nèi)后，血漿或血清中的調(diào)理素( opsonin)等易吸附著在非病 毒載體表面，并被巨噬細(xì)胞特異性識(shí)別后吞噬，不利于靶向到單核巨噬系統(tǒng)以 外的耙組織。
目前，延長基因藥物在體內(nèi)的半衰期的有效途徑是用親水性、柔韌性好并 且不帶電的聚合物對與基因藥物結(jié)合的載體進(jìn)行修飾，或是將基因藥物包裹于 可生物降解的高分子材料中制備成納米或微米級(jí)微球后，在表面進(jìn)行親水性修 飾。申請?zhí)?00510023134. 6公布的"脾靶向DNA遞送系統(tǒng)，，中將聚乙二醇、聚 氧乙烯或聚氧乙烯丙烯共聚物與脂溶性高分子嵌段共聚，以水包油包水法、高 溫蒸發(fā)-低溫固化法制備包裹DNA的納米粒。這類方法的不足之處在于l)納 米?；蛭⑶虻闹苽溥^程較為復(fù)雜，基因藥物的包封率低，且基因藥物的結(jié)構(gòu)和 活性受到很大影響；2)釋放過程中均有較大的突釋現(xiàn)象。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種可控釋放基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖維的 制備方法。該方法適應(yīng)性強(qiáng)，工藝簡單、成本低廉、重復(fù)性好。制得的可生物 降解聚合物超細(xì)纖維，可用于腫瘤及增生性疾病的治療、缺損組織的修復(fù)。其 基因藥物的包封率高、結(jié)構(gòu)完整性和生物活性能得到良好保持，可方便的對基因藥物的釋放進(jìn)行控制和調(diào)節(jié)，基因藥物的轉(zhuǎn)染和蛋白表達(dá)能力高。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題，所采用的技術(shù)方案是 一種可控釋放基因藥物的 生物降解聚合物超細(xì)纖維的制備方法，其步驟是
A、 將基因藥物的水相溶液與陽離子聚合物的水相溶液混合得懸浮液，其中 陽離子聚合物中的氮的原子數(shù)與基因藥物中的磷的原子數(shù)的比值大于1;
B、 將可生物降解聚合物與致孔劑溶于其有機(jī)溶劑中形成混合溶液；
C、 將A步的懸浮液分散于B步的混合溶液中形成乳液，再將乳液以靜電紡 絲方法進(jìn)行紡絲、干燥后得到可控釋放基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖維。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
一、 基因藥物的水相溶液與陽離子聚合物的水相溶液混合，帶負(fù)電荷的基 因藥物與帶正電荷的陽離子聚合物通過靜電吸附作用形成復(fù)合粒子懸浮液，再
水型乳液，采用乳液電紡的方式，制備出以復(fù)合粒子為核層、可生物降解聚合 物為殼層的超細(xì)纖維制劑，基因藥物復(fù)合粒子絕大多數(shù)存在于纖維內(nèi)部，在釋 放過程中聚合物殼層可保護(hù)內(nèi)層基因藥物，避免酶、pH環(huán)境等對基因藥物的降 解和失活作用。實(shí)驗(yàn)測試證明，本發(fā)明制得的載基因藥物超細(xì)纖維中所包裹的 基因藥物在整個(gè)釋放過程中均保持完整的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)活性。并且基因藥物的 攜載效率高，實(shí)驗(yàn)測試證明，本發(fā)明制得的載基因藥物超細(xì)纖維的包封率可達(dá) 95%以上。
同時(shí)，基因藥物以復(fù)合粒子的形式攜載并釋放出來，陽離子聚合物通過靜 電吸附作用與基因藥物分子形成穩(wěn)定的多聚復(fù)合物，不易被核酸酶降解；也使 基因藥物分子由伸展結(jié)構(gòu)壓縮為體積相對較小的壓縮結(jié)構(gòu)，可達(dá)納米級(jí)，易穿 透細(xì)胞膜，顯示出良好的納米尺度效應(yīng)；而且復(fù)合粒子帶正電荷，可與細(xì)胞表 面帶負(fù)電荷的受體結(jié)合，因此能有效地被細(xì)胞內(nèi)吞攝入介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，可顯著 地提高轉(zhuǎn)染效率，提高對細(xì)胞核的靶向性。
二、 本發(fā)明通過在可生物降解聚合物中添加致孔劑聚合物，致孔劑聚合物 在電紡溶劑和水環(huán)境下均具有豐支好的溶解性。纖維制劑在^妄觸水性環(huán)境條件下，
藥物的復(fù)合粒子。因此，可通過采用不同種類、分子量和含量的致孔劑，可在 聚合物殼層中形成不同的釋放通道，控制基因藥物的釋放，以實(shí)現(xiàn)按需控制和調(diào)節(jié)基因藥物的釋放速度。實(shí)驗(yàn)測試證明，在未添加致孔劑的纖維膜中，基因
藥物復(fù)合粒子在15天內(nèi)僅釋放了 16%左右，釋放速度緩慢，藥物不能有效釋放； 在乳酸-聚乙二醇共聚物與致孔劑聚乙二醇以9: 1的比例制備的纖維膜中，基 因藥物復(fù)合粒子在12天釋放了近100%;在聚乳酸-聚乙二醇共聚物與致孔劑聚 乙二醇以2.3:1的比例制備的纖維膜中，基因藥物復(fù)合粒子在7天釋放了近麵。
三、 本發(fā)明制備的基因藥物輸送系統(tǒng)中基因藥物存在于纖維內(nèi)部，釋放是 通過基因藥物的緩慢擴(kuò)散與殼層聚合物的降解完成，因此可顯著降低基因藥物 的早期突釋作用。實(shí)驗(yàn)測試證明，基因藥物的突釋量(12小時(shí)的釋放量)可控 制在10°/。以內(nèi)。
四、 本發(fā)明采用乳液靜電紡絲方法，無需特殊工藝和設(shè)備，其適應(yīng)性強(qiáng)， 工藝簡單、成本低廉、重復(fù)性好。
上述的B步中的致孔劑為聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯 亞胺、明膠中的一種或一種以上的混合物。這些致孔劑均可同時(shí)溶解于水相和 電紡用有機(jī)溶劑，且均具有良好的生物相容性，可用于載基因藥物超細(xì)纖維中。
上述的陽離子聚合物為聚乙烯亞胺、聚賴氨酸、聚組氨酸、殼聚糖、魚精 蛋白中的一種或一種以上的混合物。
上述的陽離子聚合物都是近年來研究最為廣泛的非病毒基因載體，具有價(jià) 格低廉、穩(wěn)定性高、毒性低等優(yōu)點(diǎn)。
上述的基因藥物為DNA、 RNA和ASON中的一種或一種以上的混合物。
基因藥物是疾病治療和誘導(dǎo)組織再生的重要手段。DNA類藥物主要通過轉(zhuǎn)染 細(xì)胞，使細(xì)胞長期穩(wěn)定表達(dá)、分泌某種生物活性物質(zhì)，特異性作用于某類細(xì)胞 或組織上。RNA類基因藥物主要是外源或內(nèi)源性的雙鏈RNA,在核酸酶的作用下 生成小干擾RM,利用RNA干擾技術(shù)能特異性抑制致病基因的表達(dá)，具有高效和 多樣化的特征。反義寡核苷酸是針對特定的靶mRNA(DNA)的序列設(shè)計(jì)合成,通過 與靼DNA或者mRNA結(jié)合形成雙鏈雜交，阻止乾基因的復(fù)制或轉(zhuǎn)錄、在RNA水平 阻止蛋白質(zhì)翻譯和生成。但基因藥物本身不具備靶向功能，同時(shí)穿透細(xì)胞膜的 能力差，在生理環(huán)境中極不穩(wěn)定，而通過本發(fā)明方法與陽離子聚合物形成復(fù)合 粒子并進(jìn)而攜栽于纖維膜上形成高效安全的攜載和釋放體系，可拓展其在疾病 治療和誘導(dǎo)組織再生等方面的應(yīng)用中。例如， 一、以攜載基因藥物的靜電紡絲纖維作為組織工程支架應(yīng)用于缺損組織的修復(fù)，不僅可以為細(xì)胞的增殖、分化 提供類似于胞外基質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)，還可以通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞使細(xì)胞分泌生長因 子，持續(xù)誘導(dǎo)周圍細(xì)胞的增殖分化。二、以攜載基因藥物的靜電紡絲纖維通過 埋植方法應(yīng)用于腫瘤及增生性疾病的治療，可以抑制癌基因的表達(dá)。
上述的B步中的可生物降解聚合物為聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚 乳酸-聚乙二醇共聚物、聚乳酸-聚e-己內(nèi)酯共聚物、聚e-己內(nèi)酯、聚磷酸酯、 聚》灰酸酯、聚酸酐的一種或一種以上的混合物。
以上的可生物降解聚合物為現(xiàn)有成熟的可生物降解聚合物，用其制備可生 物降解聚合物纖維工藝簡單、成本低廉、重復(fù)性好、安全性高。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。


圖1是本發(fā)明實(shí)施例一、二、三的方法分別制得的超細(xì)纖維膜的突釋實(shí)驗(yàn) 結(jié)果。圖中橫坐標(biāo)為孵育時(shí)間，縱坐標(biāo)為累積釋放百分比。其中由符號(hào)"□"、
"O"、 "▽"串起的三條曲線分別為實(shí)施例一、二、三制得的超細(xì)纖維的突釋 實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
圖2是本發(fā)明實(shí)施例三、四、五的方法分別制得的超細(xì)纖維膜的釋放持續(xù) 時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。不添加致孔劑聚乙二醇，但其它條件與參數(shù)與實(shí)施例一完全 一樣制得攜載基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖維即脫氧核糖核酸-聚乙烯亞 胺/聚乳酸-聚乙二醇共聚物超細(xì)纖維，縮寫為DNA-PEI/PELA，作為對照實(shí)例。 圖中橫坐標(biāo)為孵育時(shí)間，縱坐標(biāo)為累積釋放百分比。其中由符號(hào)"□，，、 "▽"、 "△，，、 "O"串起的四條曲線分別為對照例、實(shí)施例三、四、五制得的超細(xì)纖
維的釋放持續(xù)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 實(shí)施例一
A、 將聚乙烯亞胺(PEI)溶解于10 mM pH 7. 0的磷酸緩沖液中，用1 M的 鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7. 0得陽離子聚合物聚乙烯亞胺(PEI )的水相溶液，將脫氧 核糖核酸(DNA)的水溶液緩慢滴入聚乙烯亞胺的水相溶液中，混勻后形成懸浮 液，懸浮液含有DNA-PEI復(fù)合粒子，其中陽離子聚合物中的氮的原子數(shù)與基因 藥物中的磷的原子數(shù)之比即氮磷比為3。
B、 將可生物降解的聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)和分子量為2000的聚乙二醇(PEG，。)同時(shí)溶解在氯仿溶液中，得到混合溶液PELA-PEG誦，其中致孔 劑(PEG測)與可生物降解聚合物(PELA)的質(zhì)量比為1:9。
C、將A步的DNA-PEI復(fù)合粒子懸浮液在超聲或高速攪拌下滴入B步的 PELA-PEG扁的氯仿溶液中制成油包水型乳液，通過靜電紡絲加工制得超細(xì)纖維， 室溫下對所收集到的纖維真空千燥2天，得到可控釋放基因藥物的生物降解聚 合物超細(xì)纖維即脫氧核糖核酸-聚乙烯亞胺/聚乙二醇2。。。-聚乳酸-聚乙二醇共聚 物超細(xì)纖維(1/9 ),縮寫為DNA-PEI/PEG畫-PELA (1/9 )。 實(shí)施例二
本實(shí)施例與實(shí)施例 一相同，所不同的僅僅是添加的致孔劑改為分子量為 4000的聚乙二醇(PEG細(xì))，得到的可控釋放基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖 維為脫氧核糖核酸-聚乙烯亞胺/聚乙二醇鍾-聚乳酸-聚乙二醇共聚物超細(xì)纖維 (1/9 )，縮寫為MA-PEI/PEG備-PELA (1/9 )。 實(shí)施例三
本實(shí)施例與實(shí)施例一相同，所不同的僅僅是添加的致孔劑改為分子量為 6000的聚乙二醇(PEG國)，得到的可控釋放基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖 維為脫氧核糖核酸-聚乙烯亞胺/聚乙二醇國-聚乳酸-聚乙二醇共聚物超細(xì)纖維 (1/9 ),縮寫為DNA—PEI/PEG,-PELA (1/9 )。 實(shí)施例四
本實(shí)施例與實(shí)施例一相同，所不同的僅僅是添加的致孔劑改為分子量為 6000的聚乙二醇(PEG函),且PEG國與聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)的質(zhì)量 比為1:4;得到可控釋;^基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖維為脫氧核糖核酸-聚乙烯亞胺/聚乙二醇畫-聚乳酸-聚乙二醇共聚物超細(xì)纖維(1/4)，縮寫為 DNA-PEI/PEG畫-PELA (1/4)。 實(shí)施例五
本實(shí)施例與實(shí)施例一相同，所不同的僅僅是添加的致孔劑改為分子量為 6000的聚乙二醇(PEG國)，且PEG國與聚乳酸-聚乙二醇共聚物(PELA)的質(zhì)量 比為1: 2. 3。通過靜電紡絲加工制得到的可控釋放基因藥物的生物降解聚合物超 細(xì)纖維為脫氧核糖核酸-聚乙烯亞胺/聚乙二醇畫-聚乳酸-聚乙二醇共聚物超細(xì) 纖維(1/2. 3 )，縮寫為DNA-PEI/PEG畫-PELA (1/2. 3 )。實(shí)施例六
本實(shí)施例與實(shí)施例一相同，所不同的僅僅是B步中是將可生物降解的聚 磷酸酯(PP)與致孔劑聚乙烯醇(PVA)溶解于二甲基亞砜溶液中，得到混合溶 液PP-PVA;其中致孔劑聚乙烯醇與聚磷酸酯的質(zhì)量比為1:9。通過靜電紡絲加
工得到的可控釋放基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖維為脫氧核糖核酸-聚乙 烯亞胺/聚乙烯醇-聚磷酸酯超細(xì)纖維，縮寫DNA-PEI/PVA-PP。
實(shí)施例七
本實(shí)施例與實(shí)施例一相同，所不同的僅僅是基因藥物改為特異性針對小 鼠Par-1基因的siRNA (序列為5，-3， GGGUAGGGCAGUCUAC,tt ， 5，-3， UAAGUAGACUGCCCUACCCtc )，其中陽離子聚合物中的氮的原子數(shù)與基因藥物中的 磷的原子數(shù)之比即氮磷比為5。通過靜電紡絲加工得到的可控釋;^L基因藥物的生 物降解聚合物超細(xì)纖維為核糖核酸-聚乙烯亞胺/聚乙二醇-聚乳酸-聚乙二醇共 聚物超細(xì)纖維，縮寫siRNA-PEI/PEG-PELA。 實(shí)施例八
本實(shí)施例與實(shí)施例一相同，所不同的僅僅是B步中的可生物降解聚合物為 聚乳酸(PLA)，致孔劑為聚乙二醇(PEG)和明膠(gelatin)的質(zhì)量比為1: 1 的混合物。得到的可控釋放基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖維為脫氧核糖核 酸-聚乙蹄亞胺/明膠-聚乙二醇-聚乳酸超細(xì)纖維，縮寫為 DM-PEI / ge 1 a t i n-PEG-PLA。 實(shí)施例九
A、 將聚賴氨酸(PL)溶解于10 mM pH 7. 0的磷酸緩沖液中，用1 M的鹽 酸調(diào)節(jié)pH值至7. 0,將脫氧核糖核酸(DM )的水溶液緩慢滴入PL溶液中，混 勻后得到DM/PL復(fù)合粒子，其中陽離子聚合物中的氮的原子數(shù)與基因藥物中的
磷的原子數(shù)之比即氮磷比為1. 35。
B、 將可生物降解的聚乳酸(PLA)與致孔劑聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶解于 氯仿溶液中，得到混合溶液PLA-PVP，其中致孔劑聚乙烯吡咯烷酮與聚乳酸的質(zhì) 量比為1:99。
C、 將A步的DNA/PLL復(fù)合粒子的懸浮液在超聲或高速攪拌下滴入B步的 PLA-PVP的氯仿溶液中制成油包水型乳液，通過靜電紡絲方法進(jìn)行紡絲得到超細(xì) 纖維，室溫下對所收集到的纖維真空干燥2天，得到可控釋方丈基因藥物的生物
8降解聚合物超細(xì)纖維即脫氧核糖核酸-聚賴氨酸/聚乙烯吡咯烷酮-聚乳酸超細(xì)
纖維，縮寫為DNA-PL/PVP-PLA。 實(shí)施例十
A、 將聚組氨酸(PH)溶解于10 mM pH 7. 0的磷酸緩沖液中，用1 M的鹽 酸調(diào)節(jié)pH值至7.0,將脫氧核糖核酸(DNA )的水溶液緩慢滴入PH溶液中，混 勻后得到DM-PH復(fù)合粒子，其中陽離子聚合物中的氮的原子數(shù)與基因藥物中的 磷的原子數(shù)之比即氮磷比為1. 35。
B、 將可生物降解的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)與致孔劑聚乙烯亞胺 (PEI)溶解于氯仿溶液中，得到混合溶液PLGA-PEI,其中致孔劑聚乙烯吡咯烷
酮與聚乳酸的質(zhì)量比為1: 1。
C、 將A步的DNA-PH復(fù)合粒子的懸浮液在超聲或高速攪拌下滴入B步的 PLGA-PEI的氯仿溶液中制成油包水型乳液，通過靜電紡絲方法進(jìn)行紡絲得到超 細(xì)纖維，室溫下對所收集到的纖維真空干燥2天，得到可控釋iiL基因藥物的生 物降解聚合物超細(xì)纖維即脫氧核糖核酸-聚組氨酸/聚乙烯亞胺-聚乳酸-聚乙醇 酸共聚物超細(xì)纖維，縮寫為DNA-PH/PEI-PLGA。
實(shí)施例十一
A、 將殼聚糖(Chitosan)溶解于1%醋酸溶液中，用0. 01 M的NaOH調(diào)節(jié) pH值至5. 5;將DNA溶解于30 mM的^2304溶液中。將殼聚糖溶液與DNA溶液 均在55。C水浴中分別預(yù)熱10分鐘后，等體積混合，再在渦旋震蕩器上振蕩30 秒，室溫放置30分鐘，得到DNA-Chitosan復(fù)合粒子懸浮液，其中陽離子聚合 物中的氮的原子數(shù)與基因藥物中的磷的原子數(shù)之比即氮磷比為5。
B、 將可生物降解的聚乳酸-聚s-己內(nèi)酯共聚物(PCLA)與致孔劑聚乙二醇 (PEG)溶解于氯仿溶液中，得到混合溶液PCLA-PEG。其中致孔劑聚乙烯吡咯烷
酮與聚乳酸的質(zhì)量比為1:9。
C、 將A步的DM-Chitosan復(fù)合粒子的懸浮液在超聲或高速攪拌下滴入B 步的PCLA-PEG的氯仿溶液中制成油包水型乳液，通過靜電紡絲方法進(jìn)行紡絲得 到超細(xì)纖維，室溫下對所收集到的纖維真空千燥2天，得到可控釋^L基因藥物 的生物降解聚合物超細(xì)纖維即脫氧核糖核酸-殼聚糖/聚乙二醇-聚乳酸-聚s -己內(nèi)酯共聚物超細(xì)纖維，縮寫為DNA-Chitosan/PEG-PCLA。實(shí)施例十二
A、 將魚精蛋白(protamine )溶解于10 mM pH 7. 0的磷酸緩沖液中，用1 M 的鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7. 0,將脫氧核糖核酸(DNA)的水溶液緩慢滴入魚精蛋白溶 液中，混勻后得到DNA-protamine復(fù)合粒子，其中陽離子聚合物中的氮的原子 數(shù)與基因藥物中的磷的原子數(shù)之比即氮磷比為5。
B、 將可生物降解的聚s-己內(nèi)酯(PCL)與致孔劑聚乙二醇(PEG)溶解于 氯仿溶液中，得到混合溶液PCL -PEG。其中致孔劑聚乙烯吡咯烷酮與聚乳酸的 質(zhì)量比為1: 9。
C、 將A步的DNA-protamine復(fù)合粒子的懸浮液在超聲或高速攪拌下滴入B 步的PCL -PEG的氯仿溶液中制成油包水型乳液，通過靜電紡絲方法進(jìn)行紡絲得 到超細(xì)纖維，室溫下對所收集到的纖維真空干燥2天，得到可控釋力iL基因藥物 的生物降解聚合物超細(xì)纖維即脫氧核糖核酸-魚精蛋白/聚乙二醇-聚s-己內(nèi)酯 超細(xì)纖維，縮寫為DNA-protamine/PEG-PCL。
實(shí)施例十三
A、 將聚乙烯亞胺(PEI )溶解于10 raM pH 7. 0的磷酸緩沖液中，用1 M的 鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7. 0，將含有原癌基因c-myc的反義寡核苷酸c-myc AS0N (序 列5，-AAC GTT GAG GGG CAT-3，)的水溶液緩慢滴入PEI溶液中，混勻后得到 ASON-PEI復(fù)合粒子懸浮液。其中陽離子聚合物中的氮的原子數(shù)與基因藥物中的 磷的原子數(shù)之比即氮磷比為5。
B、 將可生物降解的聚碳酸酯(PC)與致孔劑明膠(gelatin)溶解于六氟 異丙醇溶液，得到混合溶液PC-gelatin。其中致孔劑明膠與聚碳酸酯的質(zhì)量比 為1:9。
C、 將A步的AS0N-PEI復(fù)合粒子懸浮液在超聲或高速攪拌下滴入B步的 PC-gelatin的氯仿溶液中制成油包水型乳液，通過靜電紡絲方法進(jìn)4亍紡絲得到 超細(xì)纖維，室溫下對所收集到的纖維真空干燥2天，得到可控釋放基因藥物的 生物降解聚合物超細(xì)纖維即反義寡核苷酸-聚乙烯亞胺/明膠-聚碳酸酯超細(xì)纖 維，縮寫為AS0N-PEI/gelatin-PC。
實(shí)施例十四
A、將聚乙烯亞胺(PEI)溶解于10 raM PH 7. 0的磷酸緩沖液中，用1 M的 鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7. 0,將含有可表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的脫氧核糖核
10酸(pcDNA3. 1 / hVEGF165)與c-myb基因的反義寡核苷酸c-myb AS0N (序列5'-GTGTCG GGG TCT CCG GGC-3，)的水溶液緩慢滴入PEI溶液中，混勻后得到DM-ASON-PEI復(fù)合粒子懸浮液。其中陽離子聚合物中的氮的原子數(shù)與基因藥物中的磷的原子數(shù)之比即氮磷比為5。
B、 將可生物降解的聚乳酸(PLA)和聚酸酐(PA)的1: 1混合物與致孔劑聚乙二醇(PEG)溶解于氯仿溶液中得到混合溶液PLA-PA-PEG。其中致孔劑聚乙二醇與可生物降解聚合物(混合物)的質(zhì)量比為1:9。
C、 將A步的DNA-ASON-PEI復(fù)合粒子懸浮液在超聲或高速攪拌下滴入B步的PLA-PA-PEG的氯仿溶液中制成油包水型乳液，進(jìn)行高壓靜電紡絲加工制得超細(xì)纖維，室溫下對所收集到的纖維真空干燥2天，得到可控釋^L基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖維即脫氧核糖核酸-反義寡核苷酸-聚乙烯亞胺/聚乙二醇-聚乳酸-聚酸酐超細(xì)纖維，縮寫為NA-ASON-PEI/PEG-PLA-PA。
本發(fā)明方法中陽離子聚合物和基因藥物的比例不局限于以上實(shí)施例中的比例，只要陽離子聚合物中帶正電荷的氨基數(shù)多于基因藥物中帶負(fù)電荷的磷酸根數(shù)使二者能夠通過靜電吸附形成復(fù)合粒子，并使復(fù)合粒子表面有剩余的正電荷，
從而能進(jìn)入表面帶負(fù)電荷的細(xì)胞即可。也即只要陽離子聚合物中的氮原子數(shù)與基因藥物中的磷原子數(shù)的比值大于1即可。
本發(fā)明方法中的基因藥物與可降解聚合物之間的比例也無特殊要求，只要基因藥物的量足以產(chǎn)生療效且不致于產(chǎn)生毒性即可。其數(shù)值能夠根據(jù)現(xiàn)有基因藥物的使用量確定。
由于可生物降解聚合物可溶解于絕大多數(shù)的有機(jī)溶劑，能夠溶解致孔劑的溶劑均能溶解可生物降解聚合物。因此，本發(fā)明方法B步中的溶劑不局限于以上實(shí)施例中所使用的溶劑，只要是能夠溶解所選致孔劑的有機(jī)溶劑均可。
以下實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明方法可以調(diào)控可生物降解聚合物超細(xì)纖維為載體的基因藥物輸送系統(tǒng)的突釋量、釋放速度、釋放持續(xù)時(shí)間等特征。
一、超細(xì)纖維中致孔劑聚合物的分子量調(diào)控基因藥物突釋量的實(shí)驗(yàn)
選取pEGFP-N2質(zhì)粒作為具體的脫氧核糖核酸使用實(shí)施例一、二、三的方法分別制得DM-PEI/PEG2。。。-PELA ( 1/9 ) 、 DNA-PEI/PEG權(quán)-PELA ( 1/9 )和DNA-PEI/PEG幽-PELA (1/9)超細(xì)纖維，以這些纖維進(jìn)行突釋實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法將50mg纖維浸沒于5mL 10mM pH7. 4的磷酸緩沖液中，置于3rC恒溫振蕩器中。12小時(shí)后移取緩沖液，加入肝素解離復(fù)合粒子，用紫外分光光度計(jì)在260nm處測量吸收值，測定緩沖液中基因含量。
釋放結(jié)果見圖l，其中由符號(hào)"□"、"〇，，、"▽"串起的三條曲線分別為實(shí)施例一、二、三制得的超細(xì)纖維的突釋實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
從圖1可以看出實(shí)施例一的DNA-PEI/PEG2。。。-PELA (1/9)超細(xì)纖維在12小時(shí)內(nèi)的突釋量僅為8. 82 ± 1. 11%;實(shí)施例二的DNA-PEI/PEG濯-PELA (1/9)超細(xì)纖維在12小時(shí)內(nèi)的突釋量僅為 16. 5 ± 1.14%;實(shí)施例三的DNA-PEI/PEG,-PELA ( 1/9 )超細(xì)纖維在12小時(shí)內(nèi)的突釋量僅為24. 2 ± 2. 2%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明通過致孔劑聚合物的分子量越大超細(xì)纖維的基因藥物突釋量越大，因此可以選用不同分子量的致孔劑可以調(diào)節(jié)與控制超細(xì)纖維的攜栽的基因藥物的突釋量。
二、纖維制劑中致孔劑聚合物的含量調(diào)控基因藥物的的釋放速度和釋放持續(xù)時(shí)間試驗(yàn)
選取pEGFP-N2質(zhì)粒作為具體的脫氧核糖核酸4吏用實(shí)施例三、四、五中的方法分別制得DNA-PEI/PEG薩-PELA (1/9)、 DNA-PEI/PEG畫-PELA ( 1/4 )和DNA-PEI/PEG,-PELA (1/2. 3)超細(xì)纖維；同時(shí)，不添加致孔劑聚乙二醇，但其它條件與參數(shù)與實(shí)施例 一完全一樣制得攜載基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖維即脫氧核糖核酸-聚乙烯亞胺/聚乳酸-聚乙二醇共聚物超細(xì)纖維，縮寫為DM-PEI/PELA的超細(xì)纖維，作為對照實(shí)例。以這些纖維進(jìn)行釋放持續(xù)時(shí)間實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法分別將50mg超細(xì)纖維浸沒于5mL 10mM pH7. 4的磷酸緩沖液中，置于37。C恒溫振蕩器中。每天移取緩沖液，加入肝素解離復(fù)合粒子，用紫外分光光度計(jì)在260nm處測量吸收值，測定緩沖液中基因含量，最終確定纖維所包裹
基因完全釋放所需的時(shí)間。
釋放結(jié)果見圖2，其中由符號(hào)"□，，、 "▽"、 "△，，、"〇"串起的四條曲線分別為對照例、實(shí)施例三、四、五制得的超細(xì)纖維的釋放持續(xù)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
從圖2可以看出未添加致孔劑的對照例中的DM-PEI/PELA超細(xì)纖維的釋放速度緩慢，15天的累積釋^L量在16%左右；而添加了致孔劑聚乙二醇的纖維中，隨著聚乙二醇量的增加釋放速度顯著加快，其中實(shí)施例三的DNA-PEI/PEG麵-PELA (1/9)纖維在12天內(nèi)釋放了近100%,實(shí)施例四的DNA-PEI/PEG畫-PELA (1/4)纖維在11天內(nèi)釋放了近100°/。，實(shí)施例五的DNA-PEI/PEG6。。。-PELA (1/2. 3 )纖維的在7天內(nèi)釋放了近100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，
通過改變致孔劑聚合物加入量可以調(diào)節(jié)控制基因藥物的釋放速度和釋放持續(xù)時(shí)間。
權(quán)利要求
1、一種可控釋放基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖維的制備方法，其步驟是A、將基因藥物的水相溶液與陽離子聚合物的水相溶液混合得懸浮液，其中陽離子聚合物中的氮的原子數(shù)與基因藥物中的磷的原子數(shù)的比值大于1；B、將可生物降解聚合物和致孔劑溶于其有機(jī)溶劑中形成混合溶液；C、將A步的懸浮液分散于B步的混合溶液中形成乳液，再將乳液以靜電紡絲方法進(jìn)行紡絲、干燥后得到可控釋放基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖維。
2、 如權(quán)利要求1所述的一種可控釋方丈基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖維 的制備方法，其特征在于所述B步中的致孔劑為聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙 烯吡咯烷酮、聚乙烯亞胺、明膠中的一種或一種以上的混合物，致孔劑與可生 物降解聚合物的質(zhì)量比為1: 99 ~1。
3、 如權(quán)利要求1所述的一種可控釋^L基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖維 的制備方法，其特征在于所述的A步中的陽離子聚合物為聚乙烯亞胺、聚賴 氨酸、聚組氨酸、殼聚糖、魚精蛋白中的一種或一種以上的混合物。
4、 如權(quán)利要求1所述的一種可控釋放基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖維 的制備方法，其特征在于所述A步中的基因藥物為脫氧核糖核酸、核糖核酸 和反義寡核苷酸中的 一種或一種以上的混合物。
5、 如權(quán)利要求1所述的一種可控釋放基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖維 的制備方法，其特征在于所述B步中的可生物降解聚合物為聚乳酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚乳酸-聚乙二醇共聚物、聚乳酸-聚s-己內(nèi)酯共聚物、聚s -己內(nèi)酯、聚磷酸酯、聚碳酸酯、聚酸酐的一種或一種以上的混合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可控釋放基因藥物的生物降解聚合物超細(xì)纖維的制備方法，其作法是先制成基因藥物/陽離子聚合物復(fù)合粒子的懸浮液，再將懸浮液分散于可生物降解聚合物與致孔劑聚合物的有機(jī)溶液中制備成乳液，將乳液通過高壓靜電紡絲的方法制備出攜載基因藥物的超細(xì)纖維。該法制得的超細(xì)纖維，基因藥物主要存在于纖維內(nèi)部、可生物降解聚合物以殼的形式包裹基因藥物復(fù)合粒子構(gòu)成核殼結(jié)構(gòu)纖維。該方法工藝簡單、成本低廉、重復(fù)性好，通過致孔劑聚合物的分子量和含量可以調(diào)控超細(xì)纖維制劑中基因突釋量、釋放速度、持續(xù)釋放時(shí)間等特征。
文檔編號(hào)D01F6/94GK101538745SQ20091005902
公開日2009年9月23日 申請日期2009年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月22日
發(fā)明者何淑慧, 周紹兵, 李孝紅, 曄 楊, 均 王, 龍 程 申請人:西南交通大學(xué)