專利名稱：利用細菌聚生體生物漂白牛皮紙漿的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境友好的、安全和有效的四階段生物漂白牛皮紙漿的方法，該方法使用保藏號為MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的細菌菌株，使用包含保藏號為MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木質(zhì)素分解性細菌分離株的協(xié)同性混合物的微生物聚生體，本發(fā)明涉及保藏號為MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的細菌菌株，以及制備保藏號為MTCC5096的細菌分離株接種物的方法，進一步涉及制備包含保藏號為MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木質(zhì)素分解性細菌分離株的聚生體的方法，以及用于生物漂白的紙漿懸浮液的制備方法。
背景和現(xiàn)有技術(shù)參考從化學紙漿中去除木質(zhì)素以生產(chǎn)鮮亮甚至是完全白色的成品紙漿的過程稱為“漂白”。因為制漿后殘余木質(zhì)素滯留將賦予紙不合需要的棕黃色所以因美學原因和提高紙品質(zhì)而需漂白。目前牛皮紙漿的漂白使用大量基于氯的化學品。這些化學品的使用產(chǎn)生了含氯有機物，具有高度毒性的后者導致多種健康危害。因此，替代性和具有成本效率的方法即使用微生物和酶提供了一種非常簡單和經(jīng)濟的途徑以減少氯和其他漂白化學品的使用。多種生物的概覽真菌木質(zhì)素是生物圈中最豐富的芳香族聚合物。在所有維管植物細胞壁中均發(fā)現(xiàn)與纖維素和半纖維素聯(lián)合的木質(zhì)素。因木質(zhì)素單元間鍵不能水解，故木質(zhì)素難于化學性或物理性降解。在植物細胞壁中木質(zhì)素環(huán)繞纖維素形成基質(zhì)，后者本身可抗降解。木質(zhì)素生物降解是使用中木材天然解構(gòu)的主要原因，同時在植物病理機制中具有重要地位。另外，木質(zhì)素降解生物和它們的酶的潛在應用變得具有吸引力，因為這些應用可為紙漿和造紙工業(yè)提供環(huán)境友好的技術(shù)。至今只有少部分生物能降解復雜的木質(zhì)素聚合物，其中白腐真菌(white rot fungi)是它們的最佳代表。大部分有關(guān)木質(zhì)素生物降解的研究僅集中于某些真菌如黃孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、綠孢鏈霉菌(Streptomyces viridosporus)、刺芹側(cè)耳(Pleurotus eryngii)、毛栓菌(Trametes trogii)、Fusarium proliferatum(Ragaldo等，1997)等(1)。
引起木材白色腐爛的白腐擔子菌綱真菌是自然界中最有效的木質(zhì)素降解者(Kirk和Farrell，1987；Eriksson等，1990)，并且它們可能也是自然界中木質(zhì)素化組織中碳循環(huán)的主要中介。未見其它純培養(yǎng)微生物如此有效地礦化木質(zhì)素化組織(Krik和Cullen，1998)。它們是一組分類學異質(zhì)的高等真菌，以其利用一組細胞外木質(zhì)素分解酶使木質(zhì)素解聚和礦質(zhì)化的獨特能力為特征。在過去三十年中，對白腐真菌降解木質(zhì)素在涉及生物制漿、生物漂白、制漿工廠廢水處理和土壤除污的生物技術(shù)應用方面進行了深入研究(Akhtar等，1992，1998；Lamar等，1992；Messner和Srebotnik，1994)。
1992年，F(xiàn)rederick Archibald(2)證明真菌雜色栓菌(Trametesversicolor)能在2至5天期間使未漂白的工業(yè)牛皮紙漿基本上脫色和脫木質(zhì)素。
一年以后，同組研究人員表明生物漂白性的培養(yǎng)物上清含有硬木牛皮紙漿(HWKP)生物漂白和脫木質(zhì)素所需的全部成分，但該上清需要經(jīng)常接觸真菌以維持上述活性。因此，不穩(wěn)定的小分子真菌代謝物可能是由真菌更新或替代的生物漂白系統(tǒng)極其重要的成分。由含HWKP的培養(yǎng)物得到的幾乎所有CO2均源自加入的葡萄糖，這表明生物漂白過程中HWKP不是重要的能量來源。培養(yǎng)物中HWKP的存在顯著地增加了培養(yǎng)物中許多酸性代謝物包括草酸、乙醛酸和乙醇酸的生產(chǎn)。
已發(fā)現(xiàn)多用途的子囊菌-曲霉(Aspergilli)也能高效轉(zhuǎn)化廣譜的木質(zhì)素相關(guān)芳香族化合物。研究顯示它們可過量產(chǎn)生高水平的半纖維素分解酶(4)。
Maria Teresa等證實煙管菌BOS55株(Bjerkandera sp.StrainBOS55)是一種能漂白經(jīng)EDTA提取過，經(jīng)桉樹氧脫木質(zhì)素的牛皮紙漿(UKP)且無需錳的白腐真菌。進一步在無錳條件下與不加酸的結(jié)果比較，按1-5mM添加簡單生理性有機酸(如乙醇酸、乙醛酸和草酸等)可刺激二至三倍地提高紙漿亮度和脫木質(zhì)素。刺激作用歸功于MnP和LiP產(chǎn)量的增加以及藜蘆基醇和草酸生理濃度的增高。這些因子可大幅提高過氧化物陰離子自由基的產(chǎn)生，而后者可導致更廣泛的生物漂白(5)。
細菌細菌在木質(zhì)素生物降解中的作用仍處于推測之中。某些研究者已證實細菌混合物(Sundman等，1968)或純培養(yǎng)物(Sorensen，1962)可以木質(zhì)素為碳源生長。Kawakami(1976)以及Odier和Monties(1977)聲稱假單孢菌(Psudomonas spp.)可降解植物木質(zhì)素。Odier和Monties也指出數(shù)種其它細菌菌株在七天時間內(nèi)可利用含葡萄糖的無機物培養(yǎng)基中供給的半數(shù)以上木質(zhì)素。
檢測了自含有高載量廢棄木質(zhì)素的湖水中分離的幾種諾卡氏菌(Nocardia spp.)和假單孢菌(Psudomonas spp.)及一些未鑒定細菌自14C專門標記的松柏醇(DHP)或玉米稈木質(zhì)素脫氫聚合物中釋放14CO2的能力。然而，其中僅有一些細菌可從標記的木質(zhì)素中釋放顯著量的14CO2。受檢測的諾卡氏菌(Nocardia spp.)比假單孢菌及一些未鑒定細菌更具活性(6)。
放線菌是在木質(zhì)纖維素受到降解的土壤和堆肥中發(fā)現(xiàn)的絲狀細菌。一些報告提供了鏈霉菌屬的某些種能降解木質(zhì)素的證據(jù)。其它降解木質(zhì)素的放線菌包括嗜溫熱單胞菌(Thermomonsopora mesophil)、馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)、小單胞菌屬(Micromonospora)，其中鏈霉菌屬(Streptomyces)表現(xiàn)出最高的木質(zhì)素降解能力。在多數(shù)研究中，木質(zhì)素降解酶在含有木質(zhì)纖維素的培養(yǎng)物中以較高水平產(chǎn)生，提示某種誘導機制在發(fā)揮作用。
Ajit Verma等(1994)在研究白蟻和其腸道微生物的共生關(guān)系時得出白蟻糞便和白蟻腸道細菌在聚合物解聚過程中扮演重要角色的結(jié)論。腸道細菌具備更為有效的降解纖維素和半纖維素物質(zhì)的能力。已經(jīng)從白蟻腸道中獲得數(shù)種可水解纖維素和半纖維素的細菌分離株的純培養(yǎng)物。其中一些為節(jié)桿菌屬(Arthrobacter sp.)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)、梭菌屬(Clostridium sp.)、微球菌屬(Micrococcus sp.)、鏈霉菌屬(Streptomycessp.)、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)。從白蟻腸道中只分離到少數(shù)木聚糖分解細菌(藤黃微球菌(Micrococcus luteuns)、銅綠假單胞菌(Psuedomonas aeruginosa))。因為大部分的白蟻腸道為厭氧而木質(zhì)素降解的厭氧性機制未知(7)，故白蟻木質(zhì)素降解問題是神秘的。
Berrocal等(1997)展示固態(tài)發(fā)酵生長的鏈霉菌無細胞濾液能夠溶解多達20％的[14C]木質(zhì)素。發(fā)現(xiàn)兩種酶即胞外過氧化物酶和酚氧化酶(漆酶)的活性與木質(zhì)素的溶解速率和礦化速率相關(guān)(8)。
腐爛木材中存在的通常與真菌聯(lián)合的細菌已成為眾多研究報告的主題。然而。仍不清楚它們在木材成份降解中的確切作用。盡管獲得營養(yǎng)性氮可抑制黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)將合成的14C木質(zhì)素代謝為CO2，但是對于細胞栗褐鏈霉菌(Streptomyces Badius)降解木質(zhì)素而言高水平有機氮是最佳的(9)。
酶是代謝的催化性基石同時酶不僅是生物學界而且也是世界范圍內(nèi)工藝設(shè)計人員/工程師、化學工程師和其他科學領(lǐng)域內(nèi)研究工作者深入研究的焦點。自遠古以來，酶在眾多制造方法如產(chǎn)生酒、乳酪、面包等的方法中扮演重要角色。二十世紀后半葉見證了我們關(guān)于微生物、其代謝產(chǎn)物和酶在眾多基礎(chǔ)研究領(lǐng)域內(nèi)應用和其潛在工業(yè)用途的知識的空前擴張。然而只是在過去二十年中，微生物酶才得以在紙漿和造紙工業(yè)中商業(yè)應用。
在造紙工業(yè)中酶的最常見應用是促進漂白。在1988年至1993年間，至少提交了15項涉及酶處理以促進漂白牛皮紙漿的專利或?qū)＠_。
牛皮紙制漿又稱為硫酸鹽或化學制漿，其使用硫磺從樹木中獲得纖維。牛皮紙制漿對樹的利用率小于50％。樹的其余部分成為淤泥，后者得以焚毀，攤鋪在地表或填埋土地。牛皮紙制漿的一個優(yōu)點是工廠中對化學品可回收再利用。另一個優(yōu)點是牛皮紙纖維異常堅固(“Kraft”德語意為“堅固”)。牛皮紙漿通常為暗色，常以氯化合物漂白。牛皮紙工藝約占美國總紙漿產(chǎn)量的85％，是世界紙制造業(yè)的最大部分。牛皮紙制漿去除木質(zhì)素，溶解和降解半纖維素同時不破壞纖維素。不幸的是在制漿過程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物卡在基質(zhì)中使牛皮紙漿呈褐色。蒸煮消耗了制漿化學品，殘余木聚糖(與共價連接的降解產(chǎn)物一同)沉積在纖維素纖維表面。據(jù)認為發(fā)色團由殘余木質(zhì)素和碳水化合物降解產(chǎn)物組成。因為它們共價連接在紙漿基質(zhì)的碳水化合物分子上而難于提取。制造者使用自然氯(Cl2)和二氧化氯(ClO2)漂白發(fā)色團然后提取紙漿制造白紙。Cl2的成本為每公噸紙漿12至15美元，但因為這導致含氯的芳香族化合物的產(chǎn)生，故使用了替代性漂白劑如O2、ClO2或H2O2。這些漂白劑比Cl2貴數(shù)倍。漂白大幅提升了產(chǎn)品的價值，因此額外的支出是合理的。
氯漂白可導致環(huán)境問題。含氯有機化合物是使用這些化學品的副產(chǎn)物，其中某些有毒、致突變、持久的和生物富集性并在生物系統(tǒng)中導致多種有害干擾(Onysko，1993)。可用的選擇為氧法脫木質(zhì)素、延長的蒸煮和用二氧化氯替代氯，過氧化氫和臭氧。但上述方法大多涉及高額工藝改造資本投入。因此，備選的和有成本效率的方法即應用酶提供了一種非常簡單和經(jīng)濟的途徑以減少氯和其他漂白化學品的使用。
迄今所有基礎(chǔ)性和應用性研究工作僅僅集中于真菌。就粗紙漿的生物漂白而言，由于真菌菌絲引起的結(jié)構(gòu)性障礙而使應用真菌不可行。利用從真菌純化的酶漂白紙漿不經(jīng)濟因為酶純化步驟使工藝昂貴而冗長。因此，需要開發(fā)經(jīng)濟上可行且有效的生物漂白紙漿的方法本發(fā)明目的本發(fā)明主要目的是提供利用經(jīng)四階段過程使用細菌分離株漂白硬木牛皮紙漿的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供文中所述的細菌聚生體，用于安全、經(jīng)濟和有效地漂白硬木牛皮紙漿。
本發(fā)明的另一個目的是提供本發(fā)明中應用的細菌菌株，用于生物漂白牛皮紙漿。
本發(fā)明的另一個目的是研發(fā)使用本申請的菌株制備接種物的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及環(huán)境友好的、安全和有效的四階段生物漂白牛皮紙漿的方法，該方法使用保藏號為MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的細菌菌株，使用包含保藏號為MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木質(zhì)素分解性細菌分離株的協(xié)同性混合物的微生物聚生體，本發(fā)明涉及保藏號為MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的細菌菌株，以及制備保藏號為MTCC5096的細菌分離株接種物的方法，進一步涉及制備包含保藏號為MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木質(zhì)素分解性細菌分離株的聚生體的方法，以及用于生物漂白的紙漿懸浮液的制備方法。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及環(huán)境友好的、安全和有效的四階段生物漂白牛皮紙漿的方法，該方法使用保藏號為MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的細菌菌株，使用包含保藏號為MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木質(zhì)素分解性細菌分離株的協(xié)同性混合物的微生物聚生體，本發(fā)明涉及保藏號為MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的細菌菌株，以及制備保藏號為MTCC5096的細菌分離株接種物的方法，進一步涉及制備包含保藏號為MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木質(zhì)素分解性細菌分離株的聚生體的方法，以及用于生物漂白的紙漿懸浮液的制備方法。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中使用保藏號為MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的細菌菌株的環(huán)境友好、安全和有效的四階段生物漂白牛皮紙漿的方法，所述的方法包括以下步驟●以具有木聚糖酶活性的細菌菌株MTCC5096的接種物接種紙漿懸液作為第一階段，●在約26-32℃，約100-120轉(zhuǎn)/分下培養(yǎng)已接種的紙漿約15-20小時，●將氫氧化鈉和過氧化氫加入步驟(c)的已接種紙漿進行堿提取作為第二階段，●在約65-70℃溫育大約1.5-2.5小時，●過濾紙漿并以無菌蒸餾水洗滌，●在新鮮的基本鹽培養(yǎng)基中懸浮洗過的紙漿，●以包含保藏號為MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木質(zhì)素分解性細菌菌株的聚生體接種紙漿懸浮液作為第三階段，●在pH約5-9約26-32℃約100-120轉(zhuǎn)/分下溫育步驟(g)的已接種的紙漿約15-20小時，●重復步驟(b)至(e)以堿提取為第四階段而獲得亮度％約17％的紙漿。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中生物漂白的第三階段期間溫度約為30℃。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中生物漂白的第三階段期間pH約為8℃。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中加入20-30mg氫氧化鈉和200-250μl過氧化氫。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中基本鹽培養(yǎng)基(MSM)具有約0.1至1.0％的葡萄糖。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中聚生體諸菌株的比例為1∶1∶1。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中微生物聚生體包含保藏號為MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木質(zhì)素分解性細菌分離株的協(xié)同性混合物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中保藏號為MTCC5096的細菌菌株用于生物漂白紙漿。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中菌株顯示約8％的生物漂白力。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中細菌菌株保藏號為MTCC5094。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中細菌菌株保藏號為MTCC5095。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中細菌菌株保藏號為MTCC5098。
又在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中所述制備保藏號為MTCC5096的細菌分離株接種物的方法包括以下步驟●分離細菌菌株，●在含有土壤提取物和營養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上培養(yǎng)細菌分離株，●接種細菌分離株，●培養(yǎng)并在培養(yǎng)物達到所需O.D.(1.00-2.00)后離心獲得的培養(yǎng)物以收獲沉淀，●在pH約6.8約0.03-0.05M的磷酸鹽緩沖液中懸浮沉淀，及●獲得接種物。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中分離株在含有等比例土壤提取物和營養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中將細菌分離株接種于含葡萄糖的基本鹽培養(yǎng)基內(nèi)而后在約28-34℃和100-120轉(zhuǎn)/分下攪拌培養(yǎng)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中在1-4℃下以合適轉(zhuǎn)速優(yōu)選地為8000-12000轉(zhuǎn)/分離心獲得的生長物大約20-30分鐘。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中在合適的緩沖液如磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液中懸浮沉淀。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中涉及如權(quán)利要求5所述的包含保藏號為MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木質(zhì)素分解性細菌分離株的聚生體的制備方法，所述的方法包括步驟●分離細菌菌株，
●分別接種各細菌分離株，在定義的條件下培養(yǎng)和生長并按照光密度值等比例混合它們，及●離心獲得的懸浮液以得到沉淀，●在磷酸鹽緩沖液中懸浮沉淀，及●獲得由三種細菌菌株組成的聚生體。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中在30-35℃約100-120轉(zhuǎn)/分下攪拌細菌分離株而培養(yǎng)16至18小時。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中在30-37℃之間培養(yǎng)細菌分離株16至18小時。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中在1-4℃以合適轉(zhuǎn)速優(yōu)選地為8000-12000轉(zhuǎn)/分下離心獲得的微生物聚生體約20-30分鐘。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中在合適緩沖液如磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液中懸浮沉淀。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中涉及制備用于生物漂白的紙漿懸浮物的方法，所述方法包括以下步驟●在約12-28psi高壓滅菌未漂白的濕紙漿約15-25分鐘，●在無菌條件下以含有0.2％葡萄糖的基本鹽培養(yǎng)基懸浮高壓滅菌的紙漿。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中高壓滅菌7-10％的未漂白紙漿。
地方保藏號和國際保藏號之間的聯(lián)系如下述1.CBTCC/51-03-MTCC 50962.CBTCC/52-03-MTCC 50943.CBTCC/53-03-MTCC 50954.CBTCC/54-03-MTCC 5098細菌特征MTCC 5096革蘭氏陰性，桿菌MTCC5094
革蘭氏陰性，小桿菌MTCC 5095革蘭氏陰性，球菌MTCC5098革蘭氏陰性，長桿菌上述編號可互換運用，然而權(quán)利要求只嚴格限定于國際保藏的細節(jié)。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中本發(fā)明提供了漂白硬木牛皮紙漿的新生物方法。該方法排他性地涉及細菌分離株漂白紙漿的用途。四階段過方法包括在不同階段以細菌分離株兩次接種紙漿然后堿洗。本方法中使用的細菌分離株自位于印度Roorkee的特定地點分離。
與本發(fā)明有關(guān)的細菌分離株保藏于位于印度昌迪加爾的微生物技術(shù)研究所的國際保藏單位(International Depository，Institute of MicrobialTechnology，Chandigarh，India)，這是一個WIPO承認的國際保藏單位，并且在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中在定義的條件下這些細菌分離株表現(xiàn)了顯著的硬木牛皮紙漿漂白能力。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中本發(fā)明中的細菌分離株自位于印度Roorkee的一處木材加工車間分離，在那里鋸末持續(xù)堆積超過10-12年。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中本發(fā)明中的細菌分離株包括降解木聚糖的細菌和木質(zhì)素分解性細菌，因此在分離前對這兩類細菌進行了不同的富集。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中為提高木聚糖降解細菌的產(chǎn)量，將來自上述地點的5克新鮮土壤接種到含100ml土壤提取物、0.2％木聚糖和50μl CandidB(抗真菌)的500ml高壓滅菌燒瓶中。富集燒瓶在30℃120轉(zhuǎn)/分下保持96小時。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中為誘導木質(zhì)素分解性細菌，將來自上述地點的5克新鮮土壤接種到含100ml土壤提取物、0.3％木質(zhì)素、1mM藜蘆醇、1mM愈創(chuàng)木酚和50μl CandidB的500ml燒瓶中。富集燒瓶在30℃120轉(zhuǎn)/分下保持96小時。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中為制備土壤提取物，取1Kg土壤并在50℃干燥2小時。將400g干燥的土壤溶解于960ml單蒸水中并在15lbs下高壓滅菌1小時。高壓滅菌后，在5000轉(zhuǎn)/分下離心樣品10分鐘。收集上清(提取物)并貯存在滅菌瓶內(nèi)以制備富集燒瓶和進一步應用。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中富集的土壤樣本在0.85％的鹽水中系列稀釋。取各稀釋度下的100μl稀釋液涂布在含有土壤提取物、50％營養(yǎng)瓊脂和0.2％木聚糖的培養(yǎng)皿上以分離木聚糖降解細菌，或涂布在含有土壤提取物、50％營養(yǎng)瓊脂和0.2％木質(zhì)素的培養(yǎng)皿上以分離木質(zhì)素分解性細菌。如此獲得的培養(yǎng)皿在30±2℃下倒置培養(yǎng)24-96小時。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中根據(jù)菌落形態(tài)和顏色，共挑選60個分離株以檢測它們漂白硬木紙漿的能力。挑單獨分離的菌落在含有相同培養(yǎng)基的新鮮培養(yǎng)皿上劃線。重復上述步驟直至獲得純菌落。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中在MSM和0.7％木聚糖中120轉(zhuǎn)/分/37℃下對不同分離株進行培養(yǎng)以篩選分泌細胞外木聚糖酶的分離培養(yǎng)物。每隔24小時進行木聚糖酶分析。為測定β-木聚糖酶活性，將200μl分離株培養(yǎng)物和800μl 0.7％(重量/體積)木聚糖混合并在55℃下溫育10分鐘。加1.5ml 3，5-二硝基水楊酸終止反應并充分混合溶液后沸水浴中加熱15分鐘。作為對照，溫育800μl木聚糖、冷卻后加入200μl磷酸鹽緩沖液和1.5ml 3，5-二硝基水楊酸以校正底物溶液中的還原性糖。最初溶液和對照溶液中還原性糖的等價物以D-木糖為標準在540nm(Miller等1996)處測量光密度得以測定。每單位β-木聚糖酶活性定義為在給定條件下每分鐘產(chǎn)生1μmol還原性糖的酶量。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中為了檢測經(jīng)分離細菌的木質(zhì)素分解活性，在30ml試管內(nèi)加入10ml 0.4％木質(zhì)素并接種單種細菌分離株。3天后，觀察到木質(zhì)素脫色。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中在四階段內(nèi)用分離的細菌漂白硬木牛皮紙漿。第一階段使用分泌木聚糖酶的細菌分離株而第二階段涉及堿洗滌。第三階段包括使用木質(zhì)素分解性細菌，然后第四階段用堿提取。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，其中未漂白的硬木牛皮紙漿取自印度世紀造紙廠。在250ml無菌燒瓶中以100ml高壓滅菌的含0.3％葡萄糖的基本鹽培養(yǎng)基(MSM)溶解7g濕的高壓滅菌紙漿。按1∶5比例接種1.00O.D.的木聚糖酶陽性細菌分離株。在28℃/120轉(zhuǎn)/分下保持上述的漂白燒瓶20小時。20小時培養(yǎng)后，加30mg氫氧化鈉(NaOH)和250μl過氧化氫(H2O2)并在70℃下燒瓶保持2小時。紙漿以簡單沃特曼紙過濾并在無菌條件下以100ml含0.3％葡萄糖的新鮮MSM再次懸浮。按1∶5比例加入包含三種木質(zhì)素分解性細菌的聚生體并在30℃/120轉(zhuǎn)/分下保持20小時。加入30mg氫氧化鈉(NaOH)和250μl過氧化氫(H2O2)再次進行堿提取后續(xù)70℃下2小時溫育。過濾紙漿并在100ml新鮮的三次蒸餾水中懸浮。對不含細菌的對照燒瓶進行同樣的試驗過程。
本發(fā)明進一步提供四階段方法以利用自特定地點分離的細菌漂白硬木牛皮紙漿，該方法包括a)在如培養(yǎng)基、溫度、pH、碳源等定義的諸條件下培養(yǎng)自特定地點分離的所述細菌；b)在漂白過程的不同階段維持細菌培養(yǎng)物的密度。用100ml具有1％葡萄糖的MSM在250ml燒瓶中生長培養(yǎng)物。培養(yǎng)物燒瓶在30℃/120轉(zhuǎn)/分下培養(yǎng)16-18小時以達到O.D.等于1.00；c)在達到所需的O.D.(1.00)后離心得到的培養(yǎng)物以獲得沉淀；d)在20ml 0.05M pH 6.8的PO4-3緩沖液中溶解上述沉淀；e)在具有0.3％葡萄糖的MSM中制備紙漿。在含100ml基本鹽培養(yǎng)基的250ml燒瓶中溶解7g新鮮未漂白的紙漿；f)以(d)中形成的木糖酶特異性細菌沉淀接種紙漿并在28℃/120轉(zhuǎn)/分下培養(yǎng)燒瓶20小時；g)加入30mg氫氧化鈉(NaOH)和250μl過氧化氫(H2O2)至(f)中提到的燒瓶并在70℃下培養(yǎng)2小時；h)洗滌并用簡單沃特曼紙過濾紙漿；
i)以100ml新鮮的含0.3％葡萄糖和1mM藜蘆醇的MSM懸浮洗滌過的紙漿；j)以(b)、(c)和(d)中制備的含三種木質(zhì)素分解性細菌的聚生體接種并在30℃/120轉(zhuǎn)/分下培養(yǎng)20小時；k)加入30mg氫氧化鈉和250μl過氧化氫至(f)中提到的燒瓶并如(g)中一樣70℃下培養(yǎng)2小時；l)洗滌并用簡單沃特曼紙過濾紙漿；m)在50℃下干燥紙漿5小時并測定亮度。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，細菌從位于印度Roorkee特定的鋸末地點分離。分離涉及所述的用于分泌木聚糖酶的細菌和木質(zhì)素分解性細菌的富集和不同培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，如上所述的細菌分離株在具有1％葡萄糖的基本鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并在30℃/120轉(zhuǎn)/分下監(jiān)測生長16-18小時以達到所需的O.D.
在本發(fā)明的另一個實施方案中，離心細菌培養(yǎng)物并在20ml 0.05M，pH6.8的PO4-3緩沖液中懸浮以制備用于漂白研究的接種物。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，木聚糖酶按已知方法(Miller等，1960)分析。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，在具有0.3％葡萄糖的MSM中制備紙漿。在具有100ml MSM的250ml燒瓶中溶解7-10克新鮮未漂白紙漿。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，以木聚糖酶特異性的細菌沉淀接種紙漿并在28℃/120轉(zhuǎn)/分下維持燒瓶20小時。
在本發(fā)明實施方案中，向燒瓶中加入20-30mg氫氧化鈉和200-250μl過氧化氫并在70℃下溫育2小時。
在本發(fā)明的另一實施方案中，用簡單沃特曼濾紙進行紙漿的洗滌和過濾，并將紙漿轉(zhuǎn)移到100ml含0.3％葡萄糖和1mM藜蘆醇的新鮮MSM中。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，加入包含三種細菌分離株的木質(zhì)素分解性聚生體并在30℃/100-120轉(zhuǎn)/分下保持燒瓶2小時。
在本發(fā)明的另一實施方案中，向燒瓶中加入20-30mg氫氧化鈉和200-250μl過氧化氫并在70℃下溫育2小時。
在本發(fā)明的進一步實施方案中，用簡單沃特曼濾紙進行紙漿的洗滌和過濾并且在50℃下干燥紙漿5小時。
實施例1在100ml含1％葡萄糖的MSM中接種一環(huán)來自瓊脂平板的名為CBTCC/51-03的細菌分離株。在搖床培養(yǎng)箱內(nèi)以100至120轉(zhuǎn)/分30℃培養(yǎng)16-24小時。培養(yǎng)后，在650nm處測量光密度。通過稀釋或濃縮細菌懸浮液以維持培養(yǎng)物光密度至1.00。在4℃下以10,000轉(zhuǎn)/分離心培養(yǎng)物30分鐘。沉淀在20ml 0.05M，pH6.8的磷酸鹽緩沖液中溶解。
在100ml含0.2％葡萄糖的MSM中溶解10g高壓滅菌的濕紙漿而制備硬木紙漿懸浮液。將如上制備的細菌沉淀1ml接種于紙漿中并在35℃時以100轉(zhuǎn)/分培育燒瓶15小時。由于不適宜的溫度和細菌接種物量少未觀察到紙漿顯著變白。
實施例2在100ml含1％葡萄糖的MSM中接種一環(huán)來自瓊脂平板上的名為CBTCC/51-03的細菌分離株。在搖床培養(yǎng)箱內(nèi)以100至120轉(zhuǎn)/分30℃溫育16-24小時。溫育后，在650nm處測量光密度。通過稀釋或濃縮細菌懸浮液以維持培養(yǎng)物光密度至1.00。在4℃下以10,000轉(zhuǎn)/分離心培養(yǎng)物30分鐘。沉淀在20ml 0.05M，pH6.8的磷酸鹽緩沖液中溶解。
在100ml含0.2％葡萄糖的MSM中溶解7g高壓滅菌的濕紙漿而制備硬木紙漿懸浮液。將如上制備的細菌沉淀10ml接種于紙漿中并在35℃時以100轉(zhuǎn)/分培育燒瓶15小時。由于不適宜的溫度和細菌接種物量少未在觀察到紙漿顯著變白。
實施例3400ml MSM中接種一環(huán)來自瓊脂平板上的名為CBTCC/51-03的細菌分離株培養(yǎng)物。在搖床培養(yǎng)箱內(nèi)以100至120轉(zhuǎn)/分30℃溫育16-24小時。溫育后，在650nm處測量光密度。通過稀釋或濃縮細菌懸浮液以維持培養(yǎng)物光密度至1.00。在4℃下以10,000轉(zhuǎn)/分離心培養(yǎng)物30分鐘。沉淀在80ml0.05M，pH6.8的磷酸鹽緩沖液中溶解。
分別在100ml含0.2％葡萄糖的MSM中溶解7g高壓滅菌的濕紙漿而制備四個燒瓶的紙漿懸浮液。每個燒瓶內(nèi)接種如上制備的細菌接種物20ml。第一個燒瓶在22℃溫育而第二個燒瓶在28℃溫育。第三個燒瓶在34℃且第四個燒瓶在40℃下溫育。對所有燒瓶的紙漿在NaOH和H2O2存在時于70℃下溫育2小時進行堿提取。在28℃下保持的燒瓶與其它燒瓶相比更亮(8％)(表1)表1運用不同細菌的生物漂白方法中溫度的優(yōu)化
實施例4漂白實驗按四個步驟進行。以一環(huán)來自瓊脂平板上的名為CBTCC/51-03的細菌分離株生長物接種400ml MSM制備第一接種物。其次分別培養(yǎng)具有150ml各自接種了一環(huán)CBTCC/52-03、CBTCC/53-03、CBTCC/54-03的生長物的MSM的三個燒瓶得以制備第二接種物。全部燒瓶在搖床培養(yǎng)箱內(nèi)以100至120轉(zhuǎn)/分30℃培養(yǎng)16-24小時。培養(yǎng)后，在650nm處測定光密度。通過稀釋或濃縮細菌懸浮液以維持培養(yǎng)物光密度至1.00。第一培養(yǎng)物單獨離心而將為制備第二接種物的三種培養(yǎng)物等量混合后共同離心。第一培養(yǎng)物的沉淀在80ml 0.05M，pH6.8的磷酸鹽緩沖液中溶解而三種合并培養(yǎng)物的沉淀在90ml 0.05M，pH6.8的磷酸鹽緩沖液中溶解。
將每100ml含0.2％的MSM溶解7g濕紙漿而制備八個紙漿燒瓶。前四個燒瓶接種20ml第一“—細菌名—”的接種物。所有燒瓶在28℃/120轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)20小時。20小時培養(yǎng)后，每個燒瓶中加入30mg NaOH和250μl H2O2并在70℃溫育2小時。用簡單沃特曼濾紙過濾紙漿并于無菌條件下在四個具有100ml新鮮含0.2％葡萄糖的MSM的燒瓶內(nèi)重新懸浮。向每個燒瓶中加入20ml含三種木質(zhì)素分解性細菌的第二接種物(聚生體)。所有燒瓶在35℃/120轉(zhuǎn)/分下溫育20小時。加入30mg NaOH和250μl H2O2再次進行堿提取并于70℃溫育2小時。過濾紙漿并以100ml新鮮的三次蒸餾水懸浮。對沒有細菌的對照燒瓶進行同樣的實驗。最后，測試的紙漿燒瓶中觀察到10-11％亮度(表2)。
表2漂白實驗中單種細菌和三種細菌聚生體的聯(lián)合效應。
實施例5為觀察pH和溫度對生物漂白試驗的影響，在16個100ml紙漿燒瓶中制備第一接種物。對第二接種物而言，同樣在16個燒瓶中制備了三種細菌的聚生物。接種物按上述實施例中提到的方法制備。
在每100ml具有0.2％的MSM中溶解7g濕紙漿共制備16個紙漿燒瓶。前四個燒瓶接種名為CBTCC/51-03的細菌分離株的第一培養(yǎng)物20ml。燒瓶在28℃/120轉(zhuǎn)/分下溫育20小時。20小時溫育后，燒瓶中加入30mgNaOH和250μl H2O2并在70℃下保持2小時。紙漿以簡單沃特曼濾紙過濾并在無菌條件下于四份100ml新鮮的含0.2％葡萄糖的MSM中重新懸浮。向燒瓶中加入20ml含三種木質(zhì)素分解性細菌的第二接種物(聚生體)。為觀察溫度的影響，紙漿燒瓶分別在27℃、30℃、33℃和37℃振搖(120轉(zhuǎn)/分鐘)條件下培養(yǎng)20小時。然后向燒瓶中加入30mg NaOH和250μlH2O2再次堿提取并在70℃下溫育2小時。過濾紙漿并以100ml新鮮的三次蒸餾水懸浮。對沒有細菌的對照燒瓶進行同樣的實驗。最后，在30℃時觀察到更明顯的亮度(表3)。
為觀察pH對生物漂白試驗的影響，用不同緩沖液將紙漿燒瓶的pH分別調(diào)節(jié)到pH5、pH7和pH9。pH調(diào)節(jié)后，向這些燒瓶接種名為CBTCC/51-03的細菌分離株的第一培養(yǎng)物20ml。燒瓶在28℃/120轉(zhuǎn)/分下培養(yǎng)20小時。20小時培養(yǎng)后，加入30mg NaOH和250μl H2O2并將燒瓶在70℃保持2小時。紙漿用簡單沃特曼濾紙過濾并在四份100ml新鮮的具有不同pH即pH5、7、8和9的MSM中再次懸浮。向每個燒瓶中加入20ml含三種木質(zhì)素分解性細菌的第二接種物(聚生體)。所有燒瓶在30℃/120轉(zhuǎn)/分下保持20小時。加入30mg NaOH和250μl H2O2再次堿提取并在70℃下溫育2小時。過濾紙漿并在100ml新鮮的三次蒸餾水中懸浮。對沒有細菌的對照燒瓶進行同樣的實驗。最后，在pH8觀察到紙漿亮度為15％(表4)。
表3漂白實驗第三階段的溫度優(yōu)化
表4漂白實驗時pH的優(yōu)化本發(fā)明的主要優(yōu)點1.所研發(fā)的四階段生物漂白方法替代了紙漿和造紙廠中氯和二氧化氯的使用。因此，不產(chǎn)生有毒的含氯有機物如二氧芑、聯(lián)苯等。
2.當制備的細菌懸浮液和聚生體協(xié)同性作用時，它們?nèi)∠思垵{廠化學漂白的CD階段。
3.與化學漂白相比，所研發(fā)方法高度經(jīng)濟。
4.因為無含氯的污染物產(chǎn)生，故所研發(fā)的生物漂白方法是環(huán)境安全的。
5.就技術(shù)、可行性和應用性而言所研發(fā)的方法具有高度競爭力。
權(quán)利要求
1.使用保藏號為MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的細菌菌株進行環(huán)境友好、安全和有效的四階段生物漂白牛皮紙漿的方法，所述方法包括以下步驟a.以具有木聚糖酶活性的細菌菌株MTCC5096的接種物接種紙漿懸液作為第一階段，b.在約26-32℃以約100-120轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)已接種紙漿約15-20小時，c.將氫氧化鈉和過氧化氫加入步驟(c)的已接種紙漿進行堿提取作為第二階段，d.在約65-70℃溫育大約1.5-2.5小時，e.過濾紙漿并以無菌蒸餾水洗滌，f.在新鮮的基本鹽培養(yǎng)基中懸浮洗過的紙漿，g.以包含保藏號為MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木質(zhì)素分解性細菌菌株的聚生體接種紙漿懸浮液作為第三階段，h.步驟(g)的已接種紙漿在pH約為5-9，溫度約為26-32℃，以約100-120轉(zhuǎn)/分鐘溫育約15-20小時，i.重復步驟(b)至(e)以堿提取作為第四階段獲得亮度％約17％的紙漿。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中生物漂白的第三階段溫度為約30℃。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中生物漂白的第三階段pH為約8℃。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中加入20-30mg氫氧化鈉和200-250μl過氧化氫。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中基本鹽培養(yǎng)基(MSM)具有約0.1％至1.0％的葡萄糖。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中聚生體的諸菌株比例為1∶1∶1。
7.微生物聚生體，其包含保藏號為MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木質(zhì)素分解性細菌分離株的協(xié)同性混合物。
8.保藏號為MTCC5096的細菌菌株，其用于生物漂白紙漿。
9.如權(quán)利要求8所述的菌株，其中所述菌株顯示約8％的生物漂白能力。
10.保藏號為MTCC5094的細菌菌株。
11.保藏號為MTCC5095的細菌菌株。
12.保藏號為MTCC5098的細菌菌株。
13.制備保藏號為MTCC5096的細菌分離株接種物的方法，所述方法包括以下步驟a.分離細菌菌株，b.在含有土壤提取物和營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)細菌分離株，c.接種細菌分離株，d.培養(yǎng)并在培養(yǎng)物達到所需O.D.(1.00-2.00)后離心獲得的培養(yǎng)物收獲沉淀，e.在約0.03-0.05M pH約6.8的磷酸鹽緩沖液中懸浮沉淀，及f.獲得接種物。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中在含有等比例的土壤提取物和營養(yǎng)培養(yǎng)基的培養(yǎng)基上培養(yǎng)細菌分離株。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中細菌分離株接種于含葡萄糖的基本鹽培養(yǎng)基中并在28-34℃ 100-120轉(zhuǎn)/分的攪拌下進行培養(yǎng)。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中獲得的生長物在1-4℃時以合適的轉(zhuǎn)速優(yōu)選地為8000-12000轉(zhuǎn)/分離心大約20-30分鐘。
17.如權(quán)利要求13所述的方法，其中沉淀在合適的緩沖液如磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液中懸浮。
18.包含保藏號為MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木質(zhì)素分解性細菌分離株的聚生體的制備方法，所述方法包括以下步驟a)分離細菌菌株，b)分別接種各細菌分離株，在定義的條件下培養(yǎng)和生長并按照光密度值以大致等比例混合培養(yǎng)物，及c)離心獲得的懸浮液以得到沉淀，d)在磷酸鹽緩沖液中懸浮沉淀，e)獲得由三種細菌菌株組成的聚生體。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中細菌分離株的培養(yǎng)為在30-35℃約100-120轉(zhuǎn)/分下攪拌16至18小時。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中細菌分離株的培養(yǎng)為在30℃-37℃溫度之間進行16至18小時。
21.如權(quán)利要求18所述的方法，其中獲得的微生物聚生體在1-4℃時以合適的轉(zhuǎn)速優(yōu)選地為8000-12000轉(zhuǎn)/分離心大約20-30分鐘。
22.如權(quán)利要求18所述的方法，其中沉淀在合適的緩沖液如磷酸鹽緩沖液或Tris緩沖液中懸浮。
23.用于生物漂白的紙漿懸浮液的制備方法，所述方法包括以下步驟a)在約12-28psi高壓滅菌未漂白濕紙漿約15-25分鐘，b)以含0.2％葡萄糖的基本鹽培養(yǎng)基在無菌條件下懸浮高壓滅菌的紙漿。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中高壓滅菌7-10％的未漂白紙漿。
全文摘要
本發(fā)明涉及環(huán)境友好的、安全和有效的四階段生物漂白牛皮紙漿的方法，該方法使用保藏號為MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的細菌菌株，使用包含保藏號為MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木質(zhì)素分解性細菌分離株的協(xié)同性混合物的微生物聚生體，本發(fā)明涉及保藏號為MTCC5096、MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的細菌菌株，以及制備保藏號為MTCC5096的細菌分離株接種物的方法，進一步涉及制備包含保藏號為MTCC5094、MTCC5095和MTCC5098的木質(zhì)素分解性細菌分離株的聚生體的方法，以及用于生物漂白的紙漿懸浮液的制備方法。
文檔編號D21C5/00GK1771366SQ200380110308
公開日2006年5月10日 申請日期2003年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月21日
發(fā)明者R·庫馬爾, A·庫馬爾 申請人:科學與工業(yè)研究委員會