專利名稱：：含有脂肪酸酰胺、唑類化合物和視黃醇或視黃酯的護膚組合物的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及含有脂肪酸酰胺、唑類化合物和視黃醇或視黃酯的護膚組合物。視黃醇(維生素A)是一種內(nèi)源性化合物，其天然產(chǎn)生于人體，為正常表皮細胞分化所必需。天然的和合成的維生素A衍生物已廣泛用于治療各種皮膚疾患，并已用作皮膚修復劑或再生劑。視黃酸已被用來治療各種皮膚疾病，例如粉刺、皺紋、牛皮癬、老年斑和變色。參見Vahlquist，A等，J.Invest.Dermatol.，Vol.94，HollandD.B.和Cunliffe，W.J.(1990)第496-498頁；Ellis，C.N.等“PharmacologyofRetinolsinSkin”，Vasel，karger，Vol.3，(1989)，第249-252頁；Lowe，N.J.等，“PharmacologyofRetinolsinSkin”，Vol.3，(1989)，第240-248頁；PCT專利申請WO93/19743。視黃醇和視黃酯如乙酸視黃酯和棕櫚酸視黃酯都比視黃酸易于配制/穩(wěn)定。不幸的是，視黃醇和視黃酯在使皮膚受益方面不如視黃酸。本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)，即將某些視黃醇或視黃酯與脂肪酸酰胺及唑類化合物結合可協(xié)同增加角化細胞增殖并抑制分化。聯(lián)合應用脂肪酸酰胺和唑類化合物及視黃醇或視黃酯的效應類似于視黃酸的效應。這種效應不僅比視黃醇/視黃酯和脂肪酸酰胺或者視黃醇/視黃酯與唑類化合物的效應大，而且這三種成分可彼此協(xié)同而促進視黃酸的反應。因此，脂肪酸酰胺和視黃醇或視黃酯的混合物可模擬視黃酸，但是比視黃酸易于使用。Thornfeldt(美國專利5057501)公開了一種用含有倍半萜化合物和約0.025％至約35％的單脂肪酸、酯或酰胺的組合物治療丘疹鱗屑性和濕疹性疾病的方法。該組合物也可含有類視黃酸；Thornfeldt說明某些類視黃酸s，例如異維生素A酸、全反視黃酸、阿維A(所有這些都是視黃酸的立體形式)以及阿維A酯(三甲氧基苯基視黃酸的酯)已被證實對丘疹鱗屑性疾病有效。PCT申請WO/9325177(ProcterandGamble)公開了局部用于皮膚的組合物，其含有特殊類型的無環(huán)甲酰胺冷凍劑，可包含類視黃酸如視黃酸及其衍生物(例如順式和反式)。PCT申請WO/9403156(RhonePoulenc)公開了含有亞油酸或衍生物作為活性成分的局部用組合物來治療和預防impure皮膚(例如受丘疹、膿包或粉刺影響的皮膚)；該組合物也可含有0.025-0.1重量％的全反視黃酸。歐洲專利申請0388275(PierreFabreCosmetique)公開了用于治療脂溢性皮炎的組合物，其含有烷基甲酰胺和鋅鹽(可以是視黃酸鋅)。Klaus等(美國專利5216148)公開了特殊復合甲酰胺在治療和預防瘤、皮膚病和皮膚老化中的用途。VanScott等(美國專利4380549)和Yu等(美國專利4363815)公開了用羥酸或其酰胺治療粉刺、皮膚干燥、氣皮、鱗狀皮膚。EP582458公開了N，N-(1，4C烷基)月桂酰胺的用途。EP559304公開了含有至少25個碳原子的烴鏈的酰胺用作皮膚光滑劑的用途。Beauquey等(美國專利5308551)公開了含有一種皮膚清洗和調(diào)理組合物，其含有一種8-16C脂肪酸的1-4C烷醇酰胺組分。英國專利說明書1126289(Hoffman-LaRoche)公開了一種儲備維生素制劑，其含有維生素A醇或維生素A酯、乳化劑和選自醇或單羧酸二烷基酰胺(例如N，N-二乙基乙酰胺、N，N-二甲基乙酰胺或N，N-二甲基甲酰胺)的溶劑。早一些提交的歐洲專利申請0742005(Unilever，優(yōu)先權日為1995年5月8日)，1996年11月13日公開(在本申請優(yōu)先權日后)，公開了聯(lián)合使用脂肪酸酰胺和視黃醇或視黃酯。所有上述文獻都沒有提及唑類化合物。含有類視黃酸和唑類化合物的組合物已有描述。參見如Yusuf等，CA2101101，Cauwenbergh，美國專利5476852和Keyhani，PCT申請WO9505852。但是這些文獻都未提及脂肪酸酰胺。含有唑類化合物和脂肪酸酰胺的組合物也是已知的。但是這些組合物中不包含任何類視黃酸。參見例如WO95/17175；EP0347199；美國專利4867971；以及美國專利5348736。上述文獻都沒有公開基于脂肪酸酰胺、唑類化合物和視黃醇或視黃酯這三種成分協(xié)同組合的皮膚調(diào)理組合物。上述文獻都沒有提到需要一種視黃酸的有效替代物。本發(fā)明包括一種皮膚調(diào)理組合物，其含有(a)0.001％至約10％的視黃醇或視黃酯；(b)0.0001％至約50％的唑類化合物；(c)0.0001％至約50％的脂肪酸酰胺，其中脂肪酸含有至少6個碳原子；以及(d)化妝品用載體。本文所用術語“調(diào)理”是指預防和治療皮膚干燥、光致?lián)p皮膚、皺紋出現(xiàn)、老年斑、老化皮膚，增進角質(zhì)層彈性并改善膚質(zhì)?？捎妹廊莘椒ㄊ褂迷摻M合物以改善皮膚脫屑和表皮增殖及分化。本發(fā)明也包括本發(fā)明組合物在生產(chǎn)用于治療皮膚起皺、干燥、脫落、老化、光致?lián)p傷及治療皮膚病(例如粉刺或牛皮癬)的藥物中的用途。本發(fā)明另外提供了促進皮膚角化細胞增殖和分化的美容方法，該方法包括在皮膚上施用上述本發(fā)明組合物。本發(fā)明產(chǎn)品中脂肪酸酰胺和唑類化合物的存在可顯著改善視黃醇或視黃酯的作用，即脂肪酸酰胺和唑類化合物聯(lián)合施用可顯著增進視黃醇或視黃酯影響細胞增殖和分化的能力。當單獨使用脂肪酸酰胺或唑類化合物時，對改善皮膚沒有或幾乎沒有作用；只有當酰胺和唑類化合物與視黃醇或視黃酯聯(lián)合使用時才會顯著改善皮膚。簡而言之，本發(fā)明是基于(至少部分基于)所發(fā)現(xiàn)的視黃醇或視黃酯、脂肪酸酰胺和唑類化合物之間協(xié)同的相互作用。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實例中，酰胺是C8-C24脂肪酸酰胺，特別優(yōu)選C8-C24脂肪酸的一或二烷醇酰胺，唑類化合物是苯咪丁酮。根據(jù)本發(fā)明，由于在含有視黃醇或視黃酯的組合物中含有有效量的脂肪酸酰胺和唑類化合物，組合物的作用顯著改善?；蛘?，在含有脂肪酸酰胺和唑類化合物的組合物中含有低水平的視黃醇或視黃酯與不含酰胺和唑類化合物的類似制劑的作用相同。除非另外說明，所有的百分數(shù)都是最終組合物的重量百分數(shù)。本發(fā)明組合物最主要的成分是選自視黃醇或視黃酯的化合物。術語“視黃醇”包括視黃醇的以下異構體全反式視黃醇、13-順式視黃醇、11-順式視黃醇、9-順式視黃醇、3，4-二氫視黃醇。優(yōu)選的異構體是全反式視黃醇、13-順式視黃醇、3，4-二氫視黃醇和9-順式視黃醇。最優(yōu)選的是全反式視黃醇，因為其具有廣泛的商用性。視黃酯是視黃醇的酯。術語“視黃醇”如上所定義。適用于本發(fā)明的視黃酯為視黃醇的C1-C30酯、優(yōu)選C2-C20酯、最優(yōu)選C2、C3、和C16酯，因為它們都是更常用。視黃酯的實例包括(但不局限于)棕櫚酸視黃酯、甲酸視黃酯、乙酸視黃酯、丙酸視黃酯、丁酸視黃酯、戊酸視黃酯、異戊酸視黃酯、己酸視黃酯、庚酸視黃酯、辛酸視黃酯、壬酸視黃酯、癸酸視黃酯、十一烷酸視黃酯、十二烷酸視黃酯、十三烷酸視黃酯、十四烷酸視黃酯、十五烷酸視黃酯、十七烷酸視黃酯、硬脂酸視黃酯、異硬脂酸視黃酯、十九烷酸視黃酯、二十烷酸視黃酯、二十二烷酸視黃酯、亞油酸視黃酯、油酸視黃酯、乳酸視黃酯、甘醇酸視黃酯、羥基辛酸視黃酯、羥基十二烷酸視黃酯、酒石酸視黃酯。優(yōu)選用于本發(fā)明的酯選自棕櫚酸視黃酯、乙酸視黃酯和丙酸視黃酯，因為它們都是商業(yè)上最常用的并且最便宜。也優(yōu)選亞油酸視黃酯，因為其具有優(yōu)良的效應。用于本發(fā)明組合物中的視黃醇或視黃酯的量為約0.001％至約10％，優(yōu)選約0.01％至約1％，最優(yōu)選約0.01％至約0.5％。本發(fā)明組合物中另一重要的成分是脂肪酸酰胺。優(yōu)選地，脂肪酸酰胺含有至少6個碳原子。適當?shù)闹舅岚柡秃筒伙柡汀⒅辨溁蛑ф溨舅?。適當?shù)闹舅醿?yōu)選含有8至24個碳原子，優(yōu)選12至20個碳原子，最優(yōu)選12至18個碳原子，因為長鏈脂肪酸酰胺更適于調(diào)理皮膚。在本發(fā)明最優(yōu)選的實例中，使用必需脂肪酸的酰胺，因為必需脂肪酸可為皮膚提供營養(yǎng)。必需脂肪酸的實例包括(但不局限于)亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、ν亞麻酸、高ν亞麻酸及其混合物。最優(yōu)選亞油酸，因為其也是神經(jīng)酰胺的前體。適用于本發(fā)明的酰胺可以是簡單酰胺(即含有-CONH2基團的酰胺)、N-烷基酰胺、N，N-二烷基酰胺、單烷醇酰胺和二烷醇酰胺。適當?shù)耐榛蛲榇蓟?至30個碳原子，優(yōu)選1至20個碳原子，最優(yōu)選1至8個碳原子。本發(fā)明優(yōu)選的酰胺為單和二烷醇酰胺，特別是必需脂肪酸的酰胺。烷醇酰胺比烷基酰胺更易得。優(yōu)選的脂肪酸酰胺選自亞油酸、棕櫚酸和椰子油的單和二乙醇酰胺。本發(fā)明組合物中酰胺的含量范圍為約0.0001％至約50％，優(yōu)選約0.01％至約10％，最優(yōu)選約0.1％至約5％。本發(fā)明組合物中第三種重要的成分是唑類化合物。用于本發(fā)明的唑類化合物具有如下通式其中R1、R2和R3獨立地選自氫、巰基(SH)、硫羥基或含有1至12個碳原子的烷基、芳基、用1-5個鹵原子取代的芳基、含有氮原子和/或氧原子的雜環(huán)基團以及其混合物。最優(yōu)選苯咪丁酮、米康唑、聯(lián)苯芐唑、益康唑和克霉唑。同樣適用于本發(fā)明的有1，2，4-三唑、辛基三唑、酮康唑、伊曲康唑、氟康唑、特康唑、硫康唑、利阿唑、氯苯硫康唑及其混合物。本發(fā)明組合物中唑類化合物的含量為約0.0001％至約50％，優(yōu)選約0.001％至約10％，最優(yōu)選約0.1％至約5％?；瘖y品用賦形劑本發(fā)明組合物中也可含有化妝品用賦形劑作為稀釋劑、分散劑或載體以使當組合物用于皮膚時組合物中各活性成分易于分散。非水或者除水以外的賦形劑可以包括液體或固體潤膚劑、溶劑、潤濕劑、增稠劑和粉劑。特別優(yōu)選的非水載體為聚二甲基硅氧烷和/或聚二甲基苯基硅氧烷。本發(fā)明的聚硅氧烷可以是25℃下粘度為約10至10,000,000mm2/s(厘沲)范圍內(nèi)的任意聚硅氧烷。特別需要的是低和高粘度聚硅氧烷的混合物。這些聚硅氧烷可從GeneralElectric公司以Vicasil、SE和SF商標獲得，還有DowCorning公司的200和550系列。本發(fā)明組合物中聚硅氧烷的用量占組合物重量的5％至95％，優(yōu)選25％至90％?；瘖y品用賦形劑一般占組合物重量的5％至99.9％，優(yōu)選25％至80％，并且在不含其它化妝品佐劑的情況下使組合物均衡。以賦形劑重量計，賦形劑中優(yōu)選含水量至少為80％，在本發(fā)明組合物中，水優(yōu)選至少占50％，最優(yōu)選占組合物的60～80％(重量)。可選擇的護膚材料和化妝品佐劑可含有油或油性物質(zhì)及乳化劑以形成油包水乳劑或水包油乳劑，其主要取決于所用乳化劑的親水親油平衡值(HLB)的平均值。本發(fā)明組合物優(yōu)選含有防曬劑。防曬劑包括常用于阻擋紫外線的物質(zhì)。化合物實例為PABA、肉桂酸酯和水楊酸酯的衍生物。例如可使用甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基二苯酮(也稱羥苯酮)。甲氧基肉桂酸辛酯和2-羥基-4-甲氧基二苯酮可分別以商標ParsolMCX和Benzophenone-3購得。用于乳劑中的防曬劑的確切含量取決于防止太陽紫外線照射所需的程度。另外一種可優(yōu)選選用的成分選自必需脂肪酸(EFAs)，即形成所有細胞原生質(zhì)膜所必需的脂肪酸，在角化細胞EFA缺乏時會使細胞過度增殖。補充EFA可矯正這種現(xiàn)象。EFAs也可增強表皮脂類的生物合成并提供形成表皮屏障所需的脂類。必需脂肪酸優(yōu)選選自亞油酸、ν-亞麻酸、高-ν-亞麻酸、咖倫巴酸、二十碳-(n-6，9，13)-三烯酸、花生四烯酸、ν-亞麻酸、二十碳五烯酸、己烯酸及其混合物。本發(fā)明化妝品組合物中通常會含有潤膚劑。這些潤膚劑的含量為組合物總重量的約0.5％至約50％，優(yōu)選約5％和30％之間。潤膚劑可按照普通化學種類分類為酯、脂肪酸和醇、多元醇和烴。酯可以是單酯或二酯。適用的脂肪酸二酯的實例包括己二酸二丁酯、癸二酸二己酯、dimerate二異丙酯和琥珀酸二辛酯。適用的支鏈脂肪酸酯包括豆蔻酸2-乙基己酯、硬脂酸異丙酯和棕櫚酸異硬脂酯。適用的三元酸酯包括三亞油酸三異丙酯和檸檬酸三月桂酯。適用的直鏈脂肪酸酯包括棕櫚酸月桂酯、乳酸肉豆蔻酯、eurcate油酯和油酸硬脂酯。優(yōu)選的酯包括辛酸/癸酸椰油酯(辛酸椰油酯和癸酸椰油酯的混合物)、十四烷基醚乙酸丙二醇酯、己二酸二異丙酯和辛酸十六烷醇酯。適當?shù)闹敬己退岚?0至20個碳原子的化合物。特別優(yōu)選的化合物是例如十六烷基、十四烷基、棕櫚酸及硬脂醇和硬脂酸。作為潤膚劑的多元醇是直鏈和支鏈烷基多羥基化合物。例如優(yōu)選丙二醇、山梨醇和甘油。也可使用聚合多元醇如聚丙二醇和聚乙二醇。丁二醇和丙二醇也特別優(yōu)選為滲透增進劑。作為潤膚劑的典型烴類是12至30碳原子的烴鏈。具體的實例包括礦物油、凡士林、角鯊烯和異鏈烷烴。本發(fā)明化妝品組合物中其它有效成分有增稠劑。增稠劑的用量通常為組合物重量的0.1至20％，優(yōu)選0.5％至10％。增稠劑的實例有交聯(lián)聚丙烯酸酯物質(zhì)，可從B.F.Goodrich公司以商標Carbopol獲得?？墒褂媚z如占噸膠、角叉菜膠、明膠、刺梧桐樹膠、果膠和刺槐豆膠。在某些條件下，用作聚硅氧烷或潤膚劑的物質(zhì)也可起增稠作用。例如，大于10厘沲的聚硅氧烷膠和硬脂酸甘油酯等酯類物質(zhì)都具有雙重作用。本發(fā)明的化妝品組合物可加有粉劑。這些粉劑包括白堊、滑石粉、漂白土、高嶺土、淀粉、綠粘土、化學改性的硅酸鎂鋁、有機改性的蒙脫土、水合硅酸鋁、煙硅石、琥珀酸辛烯酯淀粉鋁及其混合物。也可將其它少量輔助成分加入該化妝品組合物中。這些成分包括著色劑、遮光劑和香精。這些少量輔助成分的含量為組合物重量的0.001％至20％。組合物的應用本發(fā)明組合物主要是用作人體皮膚表面局部涂敷的產(chǎn)品，特別是作為調(diào)理和使皮膚光滑以及防止或減少皺紋或老化皮膚出現(xiàn)的制劑。在使用時，從適當容器或涂敷器中將少量組合物如1至100毫升涂敷到皮膚暴露區(qū)，如果需要，可用手或手指或適當裝置將其在皮膚上涂開和/或擦入皮膚。產(chǎn)品劑型與包裝本發(fā)明的局部皮膚調(diào)理用組合物可配制成乳液、膏霜或凝膠?？蓪⒔M合物包裝在適合其粘度的適當容器中并由消費者使用。例如，乳液或膏霜可包裝在瓶中或滾珠式涂敷器中，或者拋射劑助推式氣溶膠裝置或者裝有指壓式抽吸器的裝置中。當組合物是膏霜時，其可簡單地裝在不變形的瓶中或擠壓容器中，例如軟管或帶蓋廣口瓶。組合物也可包含在膠囊中，例如美國專利5063507中所述，其在此作為參考。本發(fā)明還提供了一種含有本文所述化妝品用組合物的密閉容器。以下特殊實施例進一步闡明本發(fā)明。材料和方法細胞培養(yǎng)從經(jīng)胰蛋白酶處理的人新生表皮中分離人角化細胞，使其在DulbeccoModificationEagle(DME)HamsF12(1∶1)培養(yǎng)基/10％小牛血清中生長，其中含有照射3T3小鼠成纖維細胞來分化角化細胞集落。細胞在上述條件下生長直至其二次傳代，冷凍備用。將冷凍后的二次傳代角化細胞解凍，置于上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，然后移入以不含血清的MCDB153-培養(yǎng)基為主的角化細胞生長培養(yǎng)基(KGM)中(來自Clonetics公司，SanDiego，CA)，其中含有0.15mMCa；或者移入GIBCO的不含血清的角化細胞培養(yǎng)基(KSFM)中(含有0.09mMCa)。第7天，當80-90％細胞融合時，將其用胰蛋白酶處理并置于不含血清的培養(yǎng)基中以備不同實驗使用。胸苷檢測3H-胸苷結合和角化細胞的增殖通過培養(yǎng)角化細胞結合3H-胸苷來檢測角化細胞增殖。胸苷是DNA單體的四種脫氧核苷之一，DNA是動物王國中遺傳信息的廣泛信息庫。在身體細胞如角化細胞分裂前，進行細胞分裂的細胞的全部染色體組都被復制。這包括細胞大規(guī)模的DNA合成并使兩個子細胞獲得完全相同的遺傳物質(zhì)拷貝。當合成DNA以備細胞分裂的角化細胞培養(yǎng)基中含有3H-胸苷時，標記的核苷就會結合到新合成的DNA中。3H-胸苷結合到細胞群的程度與細胞群合成DNA的速率成正比，因此可指示細胞的增殖。將角化細胞(如上培養(yǎng)的)置于24孔板中，1毫升培養(yǎng)基中的密度為每孔40000個細胞。培養(yǎng)4天或直至60-70％的細胞融合時，更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)基更換24小時后將測試化合物(三份)加到孔中，4小時后每孔中加入1μCi3H-胸苷(每50μl培養(yǎng)基)。將細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時。從細胞中移去培養(yǎng)基，加入10％冰凍三氯乙酸(TCA)，將板在冰上培養(yǎng)30分鐘。用5％TCA將細胞洗滌5次，將其溶于500微升0.1MNaOH中至少1小時(通常過夜)。用0.1MHCl中和制劑；將50微升的細胞制劑用于測定總蛋白質(zhì)含量。通過液閃計數(shù)900微升細胞制劑來測定3H標記的DNA的每分鐘分裂(DPM)。胸苷結合結果以DPM/μg蛋白質(zhì)表示。谷氨酰轉(zhuǎn)移酶測試谷氨酰轉(zhuǎn)移酶測試和角化細胞分化在表皮終末分化過程中，在細胞外周的內(nèi)表面形成一個15nm厚的蛋白質(zhì)層，稱作角質(zhì)層(CE)。CE由許多不同蛋白質(zhì)組成，它們通過形成Nε-(ν-谷氨酸基)賴氨酸異二肽鍵而交聯(lián)在一起，這種肽鍵的形成通過表皮中至少兩種不同的谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(TGases)的作用被催化。在表皮的分化層中都富含TGaseI，特別是在顆粒層中，但在未分化的基礎表皮中沒有。因此，TGaseI是表皮角化細胞分化的有用標識物，高的TGaseI水平表示更加分化的狀態(tài)。基于ELISA的TGaseI測試(使用TGaseI抗體)可用于評價培養(yǎng)的角化細胞的分化狀態(tài)，如下實施例所述。將角化細胞(如上培養(yǎng)的)置于96孔板中，200微升培養(yǎng)基的密度為每孔3000個細胞。培養(yǎng)4天后，將培養(yǎng)基更換為含有測試化合物的培養(yǎng)基(每個試驗6份)。將細胞繼續(xù)培養(yǎng)72小時，然后吸出培養(yǎng)基，將板儲存在-70℃。從冷凍器中移出板，用PBS洗滌細胞。加入100微升滅菌水，通過在-70℃冷凍然后解凍而將細胞冷凍破碎。將細胞于室溫用PBS/3％BSA(洗滌緩沖劑，牛血清白蛋白)培養(yǎng)1小時，然后用新制的等分洗滌緩沖劑漂洗。然后用50微升來自Amersham(小鼠)原代抗體單克隆抗人谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(IgG)(在洗滌緩沖劑中稀釋1∶300)培養(yǎng)細胞1小時，然后在37℃用洗滌緩沖劑漂洗兩次。然后將細胞與50微升第二代抗體(Febfragment，從Amersham得到的過氧化物酶共軛的抗-小鼠IgG，用洗滌緩沖劑稀釋1∶200)一起在37℃培養(yǎng)1小時。用底物溶液(4毫克鄰苯二胺在10毫升0.1M的檸檬酸鹽緩沖液中的3.3微升30％雙氧水，pH5.0)于室溫暗處(鋁箔下)培養(yǎng)5分鐘。加入50微升4N硫酸終止反應。在板閱讀器中讀出樣品在492nm的吸收。在六份樣品中，四份用兩種抗體處理，兩份僅用第二代抗體處理(即，測定與Ab酶共軛的本底結合)。從每一處理所得讀數(shù)減去本底測定TGase水平，測定接觸兩種Ab的各份的平均±s.d.。DNA檢測處理后細胞所檢測的TGase-1水平可以受細胞數(shù)目影響，即，細胞數(shù)目越多，所檢測的TGase-1的水平越高。將TGase-1的水平標準化為相同孔中細胞的DNA含量，以消除由于細胞數(shù)目不同所帶來的變化。DNA數(shù)量是細胞數(shù)目(包括角化細胞數(shù)目)特別有用的指示物，因為每個細胞實際上都有完全相同的染色體組，因此都具有相同的DNA數(shù)量。這樣，細胞壁的DNA總量與細胞壁的細胞數(shù)目成正比。DNA數(shù)量可用于將TGase數(shù)據(jù)標準化為細胞數(shù)目。將角化細胞置于96孔板中，200微升培養(yǎng)基中的密度為每孔3000個細胞。培養(yǎng)4天后，將培養(yǎng)基更換為含有測試化合物的培養(yǎng)基(每個試驗6份)。將細胞繼續(xù)培養(yǎng)72小時，然后吸出培養(yǎng)基，將板儲存在-70℃至少1.5小時。從冷凍器中移出板，將細胞用冷卻的1∶1乙醇/丙酮溶液固定30分鐘。每孔中加入100微升Hoechst染料(10ug/ml終濃度)，培養(yǎng)15分鐘，蓋好，然后在熒光計中讀數(shù)(ex.360nm，em.460nm)。除去染料溶液，用PBS漂洗孔以備TGase檢測。實施例1視黃酸改變角化細胞分化狀態(tài)比視黃醇更有效A.加入不同濃度視黃酸或視黃醇24小時后測定對結合3H-胸苷/ug可溶蛋白的作用。結果如表1A所示。表1A視黃酸(RA)和視黃醇(ROH)對角化細胞胸苷結合的作用所有測試視黃酸的濃度，即，2.5×10-7M、2.5×10-8和2.5×10-9M都比乙醇對照組及用2.5×10-7M、2.5×10-8和2.5×10-9M視黃醇處理組顯著增加角化細胞的增殖，并且其是劑量依賴方式的。這點與視黃酸比視黃醇對上皮細胞增殖具有更大的刺激作用相一致。B.加入視黃酸和視黃醇后測定對谷氨酰轉(zhuǎn)移酶水平的作用。結果如表1B示。表1B視黃酸(RA)和視黃醇(ROH)對角化細胞谷氨酰轉(zhuǎn)移酶水平的作用所有測試視黃酸的濃度，即，2.5×10-7M、2.5×10-8和2.5×10-9M都比乙醇對照組及用2.5×10-7M、2.5×10-8和2.5×10-9M視黃醇處理組顯著降低角化細胞的分化。視黃酸和視黃醇對谷氨酰轉(zhuǎn)移酶水平的降低是劑量依賴性的。這點與視黃酸比視黃醇對上皮細胞分化具有更大的抑制作用相一致。實施例2亞油酰二乙醇酰胺(亞油酰-DEA)、BIFONAZOLE和視黃醇協(xié)同增加角化細胞的增殖并抑制分化A.加入測試化合物24小時后測定對結合3H-胸苷/ug可溶蛋白的作用并將三個獨立的實驗合并結果標準化為其分別的乙醇對照。結果如表2A所示。表2A視黃醇、BIFONAZOLE和亞油酰-DEA對角化細胞胸苷結合的作用</tables>n＝3*＝相當于2.5×10-9MROH+10-8MLADEA的p值@＝相當于2.5×10-9MROH+10-9M聯(lián)苯芐唑的p值2.5×10-9M的視黃酸與乙醇對照組及2.5×10-9M的視黃醇處理組相比，對角化細胞胸苷結合分別顯著增加了27％和16％。2.5×10-9M的視黃醇+10-8M亞油酰-DEA和2.5×10-9M的視黃醇+10-9M聯(lián)苯芐唑與視黃醇本身相比對角化細胞增殖具有邊緣刺激作用。但是，2.5×10-9M的視黃醇+10-8M亞油酰-DEA+10-9M聯(lián)苯芐唑的聯(lián)合則比乙醇及2.5×10-8M視黃醇處理組對角化細胞增殖分別顯著增加了30％和19％。2.5×10-9M的視黃醇+10-8M亞油酰-DEA+10-9M聯(lián)苯芐唑的聯(lián)合也比2.5×10-9M的視黃醇+10-8M亞油酰-DEA以及2.5×10-9M的視黃醇+10-9M聯(lián)苯芐唑處理組顯著增加角化細胞的增殖。因此，脂肪酸酰胺、bifonazole和視黃醇可協(xié)同將角化細胞的增殖增加至很類似視黃酸刺激作用的水平。B.用測試化合物處理72小時后測定對谷氨酰轉(zhuǎn)移酶1(TG1)水平標準化為細胞DNA含量的作用，如表2b所示。表2B視黃醇、聯(lián)苯芐唑和亞油酰-MEA對角化細胞TGase的作用2.5×10-8M的視黃酸非常有效地抑制角化細胞TG1水平至13％對照水平。2.5×10-8M的視黃醇及10-8MLAMEA+10-8M聯(lián)苯芐唑都對角化細胞TG1水平?jīng)]有抑制作用。但是，2.5×10-8M的視黃醇+10-8MLAMEA+10-8M聯(lián)苯芐唑則可抑制角化細胞TG1至42％的對照水平。因此，脂肪酸酰胺和聯(lián)苯芐唑可協(xié)同抑制角化細胞分化，與視黃酸的作用類似。實施例3亞油酰-DEA、苯咪丁酮和視黃醇協(xié)同增加角化細胞的增殖并抑制分化A.測定亞油酰-DEA、苯咪丁酮和視黃醇對結合3H-胸苷的作用。結果如表3A所示。表3A視黃醇、苯咪丁酮和亞油酰-DEA對角化細胞胸苷結合的作用n＝3*＝相當于2.5×10-8MROH+10-8MLADEA的p值@＝相當于2.5×10-8MROH+10-9M苯咪丁酮的p值2.5×10-7M的視黃酸與乙醇對照組及2.5×10-8M的視黃醇處理組相比，對角化細胞胸苷結合分別顯著增加了30％和28％。2.5×10-8M的視黃醇+10-8M亞油酰-DEA和2.5×10-8M的視黃醇+10-9M苯咪丁酮與對照組及視黃醇本身相比對角化細胞增殖具有顯著刺激作用。但是，2.5×10-8M的視黃醇+10-8M亞油酰-DEA+10-9M苯咪丁酮的聯(lián)合則比乙醇及2.5×10-8M視黃醇處理組對角化細胞增殖分別顯著增加了29％和27％。2.5×10-8M的視黃醇+10-8M亞油酰-DEA+10-9M苯咪丁酮的聯(lián)合與2.5×10-8M的視黃醇+10-8M亞油酰-DEA以及2.5×10-8M的視黃醇+10-9M苯咪丁酮處理組相比對角化細胞增殖分別顯著增加了17％和20％。因此，亞油酰-DEA和苯咪丁酮可協(xié)同將角化細胞的增殖增加至很類似視黃酸刺激作用的水平。B.用測試化合物處理72小時后測定對標準化為細胞DNA含量的谷氨酰轉(zhuǎn)移酶1(TG1)水平的作用，如表3b所示。表3B視黃醇、苯咪丁酮和亞油酰-DEA對角化細胞TGase水平的作用n＝62.5×10-7M的視黃酸非常有效地抑制角化細胞TG1水平至29％對照水平，而更稀釋的2.5×10-9M視黃酸不那么有效，但是仍可抑制TG1水平至55％。2.5×10-9M的視黃醇，2.5×10-9M視黃醇+10-8MLADEA以及2.5×10-9M視黃醇+10-8M苯咪丁酮都對角化細胞TG1水平?jīng)]有抑制作用。但是，2.5×10-9M的視黃醇+10-8MLADEA+10-8M苯咪丁酮則可抑制角化細胞TG1至83％的對照水平。這種抑制作用顯著高于對照、單獨的ROH、ROH+LADEA和ROH+苯咪丁酮，這表明ROH、LADEA和苯咪丁酮這三種成分可協(xié)同抑制角化細胞TG1水平。當苯咪丁酮濃度增加10倍時，即2.5×10-9M的視黃醇+10-8MLADEA+10-7M苯咪丁酮，則這一作用還會增加，該聯(lián)合可抑制TG1水平至72％對照。因此，視黃醇、脂肪酸酰胺和苯咪丁酮可協(xié)同抑制角化細胞分化，與視黃酸的作用類似。實施例4克霉唑、亞油酰-MEA(“LAMEA”)和視黃醇協(xié)同增加角化細胞的增殖測定加入測試化合物24小時后對結合3H-胸苷/ug可溶蛋白的作用，結果如表4所示標準化為對照。表4視黃醇、亞油酰-MEA和克霉唑?qū)腔毎剀战Y合的作用n＝3*＝相當于2.5×10-8MROH+10-8MLADEA的p值@＝相當于2.5×10-8MROH+10-8M克霉唑的p值2.5×10-9M的視黃酸與乙醇對照組及2.5×10-9M的視黃醇處理組相比，對角化細胞胸苷結合分別顯著增加了28％和15％。2.5×10-9M的視黃醇+10-8M亞油酰-MEA和2.5×10-9M的視黃醇+10-8M克霉唑與對照組相比對角化細胞增殖都有刺激作用，但是這種作用沒有視黃醇本身大。但是，2.5×10-9M的視黃醇+10-8M亞油酰-MEA+10-8M克霉唑的聯(lián)合則比乙醇對照組及2.5×10-8M視黃醇處理組對角化細胞增殖分別顯著增加了29％和16％。最出乎意料的是，2.5×10-9M的視黃醇+10-8M亞油酰-MEA+10-8M克霉唑的聯(lián)合也比2.5×10-9M的視黃醇+10-8M亞油酰-MEA以及2.5×10-9M的視黃醇+10-8M克霉唑處理組對角化細胞增殖分別顯著增加了21％和17％。因此，視黃醇、亞油酰-MEA和克霉唑可協(xié)同將角化細胞的增殖增加至很類似視黃酸刺激作用的水平。實施例1-4說明了視黃酸以劑量依賴方式增加皮膚角化細胞胸苷的結合并降低谷氨酰轉(zhuǎn)移酶I的水平。換句話說，視黃酸可增加角化細胞增殖并降低角化細胞分化。在實施例1-4中，視黃酸用作陽性對照和參考化合物，與其它分析化合物相比較。在抑制角化細胞分化方面，視黃醇明顯不如視黃酸有效，在增加角化細胞增殖方面則完全無效。但是，實施例1-4中意外的結果是視黃醇通過將其或視黃酯與脂肪酸酰胺和唑類化合物聯(lián)合后對培養(yǎng)后角化細胞的作用可增加至接近視黃酸的水平，盡管唑類化合物和脂肪酸酰胺單獨的作用很小。上述這些結果表明，脂肪酸酰胺和唑類化合物聯(lián)合可與視黃醇或視黃酯協(xié)同增加角化細胞增殖并降低角化細胞分化，模擬視黃酸的作用。本項研究的意外結果是，視黃醇通過將其與脂肪酸酰胺和唑類化合物聯(lián)合后對培養(yǎng)后角化細胞的作用可增加至接近視黃酸作用的水平。該作用不僅比視黃醇+脂肪酸酰胺或者視黃醇+唑類化合物的作用大，而且這三種成分可彼此協(xié)同促進視黃酸樣反應。實施例6-11描述了本發(fā)明的局部用組合物。該組合物可按常規(guī)方法制備。其適用于美容。該組合物特別適用于起皺、粗糙、干燥、起皮、老化和/或紫外線損傷的皮膚以改善皮膚外觀和質(zhì)感，也適用于健康皮膚以防止或延緩膚質(zhì)惡化。實施例6本實施例描述了本發(fā)明組合物的高內(nèi)相油包水乳劑。*Brij92是聚氫乙烯(2)油基醚實施例7本實施例說明了本發(fā)明組合物的水包油膏霜。</tables>*Brij56是十六烷醇POE(10)Alfol16RD是十六烷醇實施例8本實施例說明了本發(fā)明組合物的醇性乳液。</tables>實施例9本實施例說明了含有本發(fā)明組合物的另一醇性乳劑實施例10本實施例說明了本發(fā)明組合物的防曬霜實施例11本實施例說明了本發(fā)明的非水皮膚護理組合物。</tables>1分子量至少為50000且在25℃的粘度至少為10000厘沲的二甲基聚硅氧烷聚合物，來自GEC2環(huán)二甲基硅氧烷五聚物，來自DowCorning公司。3二甲基硅氧烷四聚物，來自DowCorning公司。權利要求1.皮膚調(diào)理組合物，含有(a)0.001％至約10％的視黃醇或視黃酯；(b)0.0001％至約50％的唑類化合物；(c)0.0001％至約50％的脂肪酸酰胺；以及(d)化妝品用載體。2.權利要求1的組合物，其中脂肪酸含有12至18個碳原子。3.權利要求1或2任一權利要求的組合物，其中酰胺選自N-烷醇酰胺、N，N-二烷醇酰胺及其混合物。4.權利要求1-3任一權利要求的組合物，其中視黃酯選自亞油酸視黃酯、棕櫚酸視黃酯、乙酸視黃酯、丙酸視黃酯及其混合物。5.權利要求1-3任一權利要求的組合物，其中組分(a)是視黃醇。6.權利要求1-5任一權利要求的組合物，其中唑類化合物選自苯咪丁酮、咪康唑、聯(lián)苯芐唑、克霉唑、益康唑。7.調(diào)理皮膚的美容方法，該方法包括在皮膚表面局部涂敷權利要求1-6任一權利要求的組合物。8.用于治療起皺紋、干燥、粗糙、起皮、老化或光致?lián)p傷皮膚的美容方法，包括在皮膚上涂敷權利要求1-6任一權利要求的組合物。9.模擬視黃酸對皮膚作用的美容方法，該方法包括在皮膚上涂敷權利要求1-6任一權利要求的組合物。全文摘要脂肪酸酰胺和唑類化合物以及視黃醇或視黃酯聯(lián)合可協(xié)同增加角化細胞增殖并協(xié)同抑制角化細胞分化。視黃醇或視黃酯與視黃酸酰胺和唑類化合物聯(lián)合的作用類似于用視黃酸治療。文檔編號A61Q19/00GK1169854SQ9711297公開日1998年1月14日申請日期1997年4月25日優(yōu)先權日1996年4月25日發(fā)明者S·P·格蘭格,A·V·羅林斯,I·R·斯各特申請人:尤尼利弗公司