專利名稱：純化瘧原蟲(chóng)(plasmodium)和疫苗組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)案涉及真核病原體和寄生蟲(chóng)、尤其瘧原蟲(chóng)子孢子階段寄生蟲(chóng)的純化。更具體來(lái)說(shuō)，其涉及實(shí)質(zhì)上純凈的寄生蟲(chóng)和其制備和使用方法。本申請(qǐng)案還涉及減毒和非減毒的純化子孢子階段瘧原蟲(chóng)寄生蟲(chóng)的疫苗和醫(yī)藥組合物，以及在疫苗和其它制劑中使用所述組合物來(lái)防止瘧疾和其它疾病、治療疾病和在瘧疾疫苗和藥物測(cè)試中作為感染志愿者的方式的方法。
背景技術(shù)：
瘧疾是一種估計(jì)可影響3億到5億人的疾病并且每年殺死100萬(wàn)到300萬(wàn)人。其對(duì)發(fā)展中國(guó)家、尤其是撒哈拉以南非洲的人民還具有巨大經(jīng)濟(jì)影響。惡性瘧原蟲(chóng) (Plasmodium falciparum)占世界上因瘧疾死亡病例的大多數(shù)。世界旅游組織(World Tourist Organization)報(bào)告，在2000年在世界范圍內(nèi)記錄有幾乎7億國(guó)際游客，約900萬(wàn)到訪西非、中非或東非，3700萬(wàn)到訪東南亞，600萬(wàn)到達(dá)南非并且1000萬(wàn)到訪大洋洲。估計(jì)每年有超過(guò)30，000名來(lái)自北美、歐洲和日本的旅客感染瘧疾。在100多年中，每次軍事行動(dòng)，如果發(fā)生瘧疾傳播，美國(guó)部隊(duì)因瘧疾而傷亡的人員都多于戰(zhàn)火而傷亡者。二戰(zhàn)期間估計(jì)因瘧疾死亡12，000, 000人天數(shù)且在越戰(zhàn)期間死亡120萬(wàn)人天數(shù)。瘧原蟲(chóng)寄生蟲(chóng)通過(guò)受感染雌瘧蚊(Anopheles)的叮咬和吸血進(jìn)行傳播，所述瘧蚊從黎明活動(dòng)到黃昏。處于子孢子發(fā)育階段的瘧原蟲(chóng)主要通過(guò)血流從叮咬位點(diǎn)遷移到肝，其在肝細(xì)胞內(nèi)繁殖，在惡性瘧原蟲(chóng)情形下在每個(gè)受感染細(xì)胞中產(chǎn)生約10，000到個(gè)40，000個(gè)子代。所述肝階段寄生蟲(chóng)表達(dá)一些在子孢子階段不表達(dá)的蛋白質(zhì)。在所述階段時(shí)，寄生蟲(chóng)以裂殖子形式重新進(jìn)入血流，從而表達(dá)一些與在子孢子階段和肝早期階段表達(dá)的蛋白質(zhì)不同的蛋白質(zhì)，并且侵入紅細(xì)胞，其中額外繁殖每48小時(shí)將寄生蟲(chóng)數(shù)增加約10到20倍。與在肝中發(fā)育5到10天(其不誘發(fā)瘧疾的任何癥狀或體征)不同，未治療的血液階段感染會(huì)引發(fā)溶血、寒顫、發(fā)熱和虛脫。惡性瘧原蟲(chóng)是引發(fā)人類疾病的最危險(xiǎn)的四個(gè)主要瘧原蟲(chóng)種類 (間日瘧原蟲(chóng)、三日瘧原蟲(chóng)和卵形瘧原蟲(chóng)[諾氏瘧原蟲(chóng)也可引發(fā)人類疾病])，在惡性瘧原蟲(chóng)情形下，所述疾病伴有微循環(huán)血流受到破壞和重要器官(例如腦、腎和肺)代謝變化，如果不緊急治療經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致死亡。針對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)瘧疾的有效疫苗仍為醫(yī)學(xué)的最大挑戰(zhàn)之一。盡管一百多年來(lái)醫(yī)生和科學(xué)家們已花費(fèi)數(shù)億美元進(jìn)行畢生努力研究，并且發(fā)現(xiàn)了許多有前景的實(shí)驗(yàn)疫苗，但是仍然沒(méi)有可減輕人類重大傳染病中任一者的市售疫苗。一代人以前，公共健康倡導(dǎo)采用氯喹(chloroquine)、DDT和媒介控制計(jì)劃，這似乎可在世界范圍內(nèi)降低惡性瘧疾的威脅。有效疫苗的缺乏使這些努力難以奏效，但可持續(xù)控制似乎即將達(dá)成。即將成功的承諾很快就失敗了，并且失敗的原因是多方面的。寄生蟲(chóng)對(duì)可負(fù)擔(dān)的高效抗瘧藥物的抗性越來(lái)越強(qiáng)，媒介控制措施失效，并且在發(fā)展中國(guó)家的病區(qū)，遷移、戰(zhàn)爭(zhēng)和經(jīng)濟(jì)崩潰越來(lái)越常見(jiàn)。因此，惡性瘧原蟲(chóng)瘧疾再度猖獗，每年使至少25億人有患病危險(xiǎn)，使3億到9億人感染，并殺死100萬(wàn)到300萬(wàn)人。在困擾發(fā)展中國(guó)家的許多社會(huì)、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境和政治問(wèn)題中，惡性瘧原蟲(chóng)瘧疾逐漸被視作是這些不公正的根源和殘酷結(jié)果，并且是解決這些復(fù)雜問(wèn)題的巨大障礙。在發(fā)展中國(guó)家，不利用有效疫苗是不可能控制惡性瘧原蟲(chóng)瘧疾的。實(shí)際上，考慮到社會(huì)、政治和經(jīng)濟(jì)現(xiàn)實(shí)，我們相信疫苗可成為可持續(xù)控制計(jì)劃的基本組份，并且在全球根除運(yùn)動(dòng)中將需要疫苗。在過(guò)去的25年期間，大多數(shù)研究致力于識(shí)別寄生蟲(chóng)可賦予免疫力的抗原性亞單位一不幸的是，結(jié)果不太令人滿意。文獻(xiàn)中已闡述了研發(fā)適宜疫苗中的所述努力和伴隨的困難(紐森維戈V.、F.和R. S. (Nussenzweig V.，F(xiàn). and R. S.)，高等免疫學(xué)(Adv. Immunol.)，(1989)45 :283-334 ；霍夫曼 S. L. (Hoffman S. L.)等人，霍夫曼 S. L.編輯，瘧疾疫苗研發(fā)(Malaria Vaccine Development)多免疫應(yīng)答方法(A Multi-Immune Response Approach) (1996)華盛頓哥倫比亞特區(qū)(Washington,D. C.) =ASM出版社，第35到75頁(yè)；霍夫曼S.L.和L.H.米勒(L. H. Miller):霍夫曼S. L.編輯，瘧疾疫苗研發(fā)多免疫應(yīng)答方法 (1996)華盛頓哥倫比亞特區(qū)=ASM出版社，第1到13頁(yè)；愛(ài)潑斯坦J. E. (Epstein, J. Ε.)等人，分子治療學(xué)新見(jiàn)(Curr. Opin. Mol. Ther.) (2007)9 12-24 ；里奇 T. L. (Richie Τ. L.)和 Α.撒羅(A. Saul)，自然(Nature)，(2002)415 :694-701)。人們正不斷努力地制造亞單位瘧疾疫苗。所述嘗試的典型(寶萊迪(Paoletti)等人，U. S. 5，766，597，于1998年6月16日頒布)揭示含有編碼一種或一種以上環(huán)子孢子蛋白的瘧原蟲(chóng)DNA的重組痘病毒，包括稱作NYVAC-PfT的實(shí)施例，其可能用作潛在瘧疾疫苗。 但隨后對(duì)所述構(gòu)成物的測(cè)試結(jié)果令人失望(奧肯豪斯C. F. (Ockenhouse, C. F.)等人，傳染病雜志(J. Infect. Dis.) (1998) 177 :1664-73)。類似地，有人提出另一種候選亞單位環(huán)子孢子疫苗并且將其確定為RTS，S/ AS02A(斯托特 J.A. (Stoute J. A.)等人，傳染病雜志(1998) 178:1139-44)。文獻(xiàn)報(bào)道了所述疫苗在莫桑比克(Mozambique)的一到四歲兒童第一 2b期現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)的結(jié)果(阿朗索 P. L. (Alonso，P. L.)等人柳葉刀(Lancet) (2004) 364 :1411-1420 ；阿朗索 P. L.等人，柳葉刀0005)366 :2012-2018 ；愛(ài)潑斯坦J.E.等人，見(jiàn)上文；里奇T. L.、F.和Α.撒羅，見(jiàn)上文)， 也報(bào)道了另一嬰兒2b期現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)的結(jié)果(阿龐特J. J. (Aponte，J. J.)等人(2007)，柳葉刀 370 :1543-1551 ；倍真 P. (Bejon, P.)等人(2008)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(NEJM) 359 :2521-32 ； 阿布杜拉S(Abdullah，S)等人Q008)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志359 :2533_44。已證實(shí)疫苗具有中等保護(hù)功效。另一方面，在隨后用病原性寄生蟲(chóng)攻擊接受者(最重要的是減毒惡性瘧原蟲(chóng)攻擊人類宿主)時(shí)證實(shí)了完整寄生蟲(chóng)、輻射減毒子孢子(通過(guò)蚊子暴露遞送到人類宿主和通過(guò)靜脈內(nèi)(i. V.)接種遞送到動(dòng)物宿主)在賦予高水平保護(hù)性免疫力中的有效性，這是適宜疫苗研究的早期里程碑(霍夫曼S.L.等人，傳染病雜志000 185:1155-64)。最終，此使得人們致力于探索在將這些早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化成包含消毒減毒子孢子的實(shí)用疫苗方法中面臨的技術(shù)困難(盧克T.C.和S.L.霍夫曼，實(shí)驗(yàn)生物學(xué)雜志(J.ExP. Biol.)， (2003) 206 =3803-3808 ；霍夫曼S. L.和T. C.盧克，美國(guó)專利第7，229，627號(hào)和美國(guó)公開(kāi)案2005/0208078)。其還使人們對(duì)利用減毒子孢子的疫苗使用的興趣普遍增加(梅納德 R. (Menard, R.)，自然 2005)433 :113-114 ；沃特斯 A. P. (Waters, A. P.)等人，科學(xué) (Science) (2005) 307 :528-530 ；威克斯 M. F. (ffykes, M. F.)和 M. F.古德(M. F. Good)，國(guó)外寄生蟲(chóng)學(xué)雜志(Int. J. Parasitol.) (2007)37 :705-712 ；倫尼亞 L. (Renia，L.)等人，疫苗專家評(píng)論(Expert Rev. Vaccines)，(2006) 5 :473-481 ；愛(ài)潑斯坦 J. Ε.等人，見(jiàn)上文)。其它減毒模式也已得到證實(shí)。例如，文獻(xiàn)顯示通過(guò)伯氏瘧原蟲(chóng)(Plasmodium berghei)基因變化產(chǎn)生的減毒子孢子可針對(duì)伯氏瘧原蟲(chóng)瘧疾來(lái)保護(hù)小鼠(卡佩(Kappe) 等人，美國(guó)專利7，122，179;穆勒(Mueller)等人，自然Q005)；穆勒等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(PNAS) (2005)；凡代克(van Dijk)等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(2005) 102 :12194-12199)； 沃特斯，美國(guó)專利7, 550，138 ；洛鮑伊(Labaied)等人，感染與免疫(Infect. And Immun.) 0007)。最近，已揭示惡性瘧原蟲(chóng)的子孢子的遺傳減毒(史卡潔克(van Schaijk)等人，公共科學(xué)圖書(shū)館 綜合(PLoS ONE) (2008)3 :e3549)；凡巴斯克爾克(VanBuskirk)等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)。類似地，已闡述瘧原蟲(chóng)的化學(xué)減毒(珀塞爾(Purcell)等人，感染與免疫(Infect. Immun.) (2008)76 :1193-99 ；珀塞爾等人，疫苗(Vaccine) (2008)26 :4880-84)。還闡述了培養(yǎng)子孢子的未純化制劑和誘發(fā)寄生蟲(chóng)分化到無(wú)菌肝階段的其它方法 (卡佩等人，美國(guó)公開(kāi)案2005/0233435)。上文所討論的研究具有某些限制。例如，當(dāng)通過(guò)蚊子叮咬遞送到人類宿主的子孢子產(chǎn)生針對(duì)瘧疾的有效免疫應(yīng)答時(shí)，所述遞送方法明顯不是對(duì)需要抗瘧疾保護(hù)的群體進(jìn)行疫苗接種的實(shí)用方法。小鼠中的其它研究(參見(jiàn)上文)已表明，將減毒子孢子靜脈內(nèi)遞送到小鼠也有效，但相比之下其它遞送方式(例如肌內(nèi))則無(wú)效。然而，如果要將瘧疾疫苗遞送到多個(gè)個(gè)體(包括兒童和老人)，那么靜脈內(nèi)遞送方法也不實(shí)用。靜脈內(nèi)遞送的危險(xiǎn)較大、增加成本，并且患者很可能不會(huì)同意使用這種方法進(jìn)行疫苗接種。因此，業(yè)內(nèi)需要提供有效的瘧疾疫苗，其可提供保護(hù)性免疫力，其中可通過(guò)多種方法投與所述疫苗。考慮到人類疫苗，免疫原的純度和存在或不存在可能具有免疫原性或毒性的非特異性附帶物質(zhì)是先前尚未解決的其它基本問(wèn)題。如上文所論述研究中所用的分離減毒子孢子制劑含有污染物質(zhì)和其它附帶物質(zhì)。業(yè)內(nèi)需要研發(fā)尤其用于人類的基于子孢子的疫苗， 其采用在消毒條件下制備的、無(wú)菌純化子孢子制劑用于疫苗組合物中。當(dāng)通過(guò)非靜脈內(nèi)遞送方法(例如，肌內(nèi)、腹膜腔內(nèi)、皮內(nèi)、表皮、粘膜、粘膜下、經(jīng)皮或皮下)投與所述在消毒條件下制備的純化子孢子制劑時(shí)，所述制劑可能比非純化制劑還更有效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明揭示活的、感染性、實(shí)質(zhì)上純化的子孢子、尤其瘧原蟲(chóng)子孢子(減毒子孢子以及病原性子孢子)的組合物。本發(fā)明還揭示制備活的、感染性、實(shí)質(zhì)上純化的寄生蟲(chóng)的方法和使用實(shí)質(zhì)上純化的減毒子孢子作為疫苗用以防止瘧疾的方法。本發(fā)明還揭示使用純化病原性寄生蟲(chóng)的方法，其可用于評(píng)定抗瘧疾藥物和疫苗的有效性，且可結(jié)合抗瘧疾劑(例如氯喹)用于賦予保護(hù)性免疫力。在實(shí)施例中，提供使用在消毒條件下產(chǎn)生的無(wú)菌、感染性、實(shí)質(zhì)上純化的減毒瘧原蟲(chóng)子孢子來(lái)賦予人類和其它哺乳動(dòng)物宿主以針對(duì)瘧疾的保護(hù)性免疫力的方法。所述方法和組合物可用于賦予針對(duì)由惡性瘧原蟲(chóng)和其它瘧原蟲(chóng)種類引發(fā)的瘧疾的保護(hù)性免疫力，而無(wú)可因使用未純化制劑引起的并發(fā)癥。在實(shí)施例中，提供實(shí)質(zhì)上純化的病原性瘧原蟲(chóng)子孢子的組合物，以及將其作為研究工具用于臨床測(cè)試中和用于預(yù)防性疫苗接種方案中的方法。提供活的、感染性、減毒、實(shí)質(zhì)上純化的子孢子的組合物，以及向人類和其它哺乳動(dòng)物個(gè)體投與的劑量、方案和途徑。在實(shí)施例中，提供賦形劑中的純化瘧原蟲(chóng)寄生蟲(chóng)，尤其處于發(fā)育子孢子階段的寄生蟲(chóng)，所述寄生蟲(chóng)代謝活化、具有感染性并實(shí)質(zhì)上不含污染物質(zhì)。在另一實(shí)施例中，在消毒條件下制備子孢子。在另一實(shí)施例中，將子孢子充分減毒以防止發(fā)育超過(guò)寄生蟲(chóng)生命周期的肝階段(成熟裂殖體階段)。在另一實(shí)施例中，提供在哺乳動(dòng)物和人類宿主中賦予針對(duì)由瘧原蟲(chóng)種類引發(fā)的瘧疾的保護(hù)性免疫力的方法，其包含提供存于賦形劑中且實(shí)質(zhì)上不含附帶物質(zhì)的活的、具有代謝活性、感染性、減毒瘧原蟲(chóng)種類子孢子和投與所述宿主至少一個(gè)劑量的所述子孢子制劑；其中在隨后暴露于所述種類的病原性瘧原蟲(chóng)子孢子后防止出現(xiàn)瘧疾的病理表現(xiàn)并且針對(duì)發(fā)展中的瘧疾保護(hù)宿主。在另-實(shí)施例中，提供通過(guò)以下方式來(lái)純化具有代謝活性、感染性寄生蟲(chóng)、尤其瘧原蟲(chóng)子孢子的方法提供包含子孢子和附帶的非子孢子物質(zhì)的水性純化前制劑，使所述制劑依次通過(guò)一組尺寸排阻過(guò)濾器，所述過(guò)濾器包含a)第一排阻過(guò)濾器，其具有能夠保留大于10微米的附帶物質(zhì)并且允許子孢子通過(guò)的標(biāo)稱孔徑；b)第二排阻過(guò)濾器，其具有能夠保留大于約0. 6微米的附帶物質(zhì)并且允許子孢子通過(guò)的標(biāo)稱孔徑；和C)第三尺寸排阻膜過(guò)濾器，其具有能夠保留大于1. 2微米的實(shí)質(zhì)上所有附帶物質(zhì)并且允許子孢子通過(guò)的精確孔徑。隨后在具有能夠保留子孢子的孔徑的收集過(guò)濾器上收集實(shí)質(zhì)上純化的子孢子，并且隨后從收集過(guò)濾器洗脫純化子孢子制劑并以期望濃度重新懸浮。在另一實(shí)施例中，提供用于測(cè)定瘧疾有關(guān)藥物、疫苗和諸如此類的功效的組合物。 所述組合物包含活的、實(shí)質(zhì)上純化的病原性瘧原蟲(chóng)寄生蟲(chóng)。


圖I-PfSPZ的粗制和純化制劑的顯微照片觀察(活動(dòng)幻。以200X放大攝制顯微照片。圖 Ia-純化前 SGM = 837ng/25, 000 個(gè) PfSPZ (將試樣調(diào)節(jié)到 15x IO6 個(gè) PfSPZ/ml)圖 Ib-純化后 SGM = 0. 23ng/25, 000 個(gè) PfSPZ (將試樣調(diào)節(jié)到 18x IO6 個(gè) PfSPZ/ ml)圖2-PfSPZ的粗制和純化制劑的顯微照片觀察(活動(dòng)6)。以200X放大攝制顯微照片。圖 2a-純化前-SGM= 781ng/25, 000 個(gè)PfSPZ (將試樣調(diào)節(jié)到 17. 78x IO6 個(gè)PfSPZ/ ml)圖沘-純化后-SGM = 0. 65ng/25，000 個(gè) PfSPZ(將試樣調(diào)節(jié)到 16. 71x IO6 個(gè) PfSPZ/ml)圖3-PfLSA-l的階段特異性表達(dá)(惡性瘧原蟲(chóng)子孢子對(duì)3天肝階段寄生蟲(chóng))。圖3a_PfSPZ與抗PfCSP單克隆抗體一起培育。圖北-PfSPZ與抗PfLSA-I多克隆抗體一起培育。圖3c_3天肝階段寄生蟲(chóng)與抗PfLSA-I多克隆抗體一起培育。
具體實(shí)施例方式目前沒(méi)有經(jīng)FDA批準(zhǔn)的瘧疾疫苗。然而，在過(guò)去的30年期間，所公布的結(jié)果已證實(shí)，通過(guò)多于1，000只惡性瘧原蟲(chóng)感染蚊子叮咬來(lái)遞送投與輻射減毒的惡性瘧原蟲(chóng)子孢子，可在大于90%的暴露個(gè)體中提供至少42周的無(wú)菌保護(hù)性免疫力，并且可有效抵抗來(lái)自全世界的多種惡性瘧原蟲(chóng)分離物。盡管這些發(fā)現(xiàn)可能很令人興奮，但由于存在若干技術(shù)困難(包括分離和純化子孢子以及在消毒條件下分離和純化子孢子)，其并未提出疫苗或研發(fā)瘧疾疫苗的明確方法。此外，許多科學(xué)家的工作表明，通過(guò)靜脈內(nèi)投與減毒子孢子僅能在小鼠模型系統(tǒng)中達(dá)成優(yōu)良保護(hù)。由于習(xí)用于人類免疫中的非經(jīng)腸非靜脈內(nèi)投與途徑(例如皮下和肌內(nèi)接種)在所述小鼠模型系統(tǒng)中并不產(chǎn)生足夠保護(hù)性免疫力，所以認(rèn)為不可能研發(fā)用于人類的減毒子孢子疫苗。采用認(rèn)為與惡性瘧原蟲(chóng)引發(fā)的人類瘧疾更為類似的小鼠模型系統(tǒng)已發(fā)現(xiàn)，非經(jīng)腸非靜脈內(nèi)投與子孢子會(huì)產(chǎn)生高水平保護(hù)(美國(guó)公開(kāi)案第 2005/0208078號(hào))。業(yè)內(nèi)也已克服了研發(fā)醫(yī)藥上可接受的減毒活瘧疾疫苗的許多其它技術(shù)困難(尤其是在消毒條件下產(chǎn)生足量的與附帶物質(zhì)分離的子孢子)(尤其參見(jiàn)霍夫曼SL和 TC盧克，US 7，229，627B2，其以引用方式明確并入本文中)。然而，適于常規(guī)用于人類個(gè)體中的疫苗需要實(shí)質(zhì)上純的接種物并且子孢子接種物需要已從產(chǎn)生其的來(lái)源實(shí)質(zhì)上純化的子孢子。本文提供的疫苗組合物包含呈實(shí)質(zhì)上純化形式、實(shí)質(zhì)上不含附帶的(來(lái)源)物質(zhì)(其對(duì)子孢子本身不具有特異性)的瘧原蟲(chóng)子孢子。另外，在本文所提供疫苗組合物的一些實(shí)施例中，疫苗組合物實(shí)質(zhì)上不含污染物質(zhì)、微生物和外源性病原體。本發(fā)明提供實(shí)質(zhì)上純化的子孢子和純化子孢子的方法，以及純化子孢子與賦形劑的組合物。定義術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”意指根據(jù)業(yè)內(nèi)實(shí)踐在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍內(nèi)。本文中作為名詞使用的“添加劑”是添加到子孢子制劑中以有利于制劑保存的化合物或組合物。添加劑可包括冷凍保護(hù)劑(例如DMSO和甘油)、抗氧化劑和諸如此類。本文所用“消毒的”意指不引入其它微生物(例如細(xì)菌、真菌、致病病毒和諸如此類)的可檢測(cè)污染。子孢子制劑的消毒性方法產(chǎn)生無(wú)菌子孢子制劑，其不含任一其它類型的微生物或感染物。使用微生物分析來(lái)監(jiān)測(cè)消毒性方法以評(píng)定存在或不存在污染。其包括 (但不限于)微生物限制測(cè)試(當(dāng)前版美國(guó)藥典(USP)<61>，其以引用方式并入本文中)。本文所用“附帶”物質(zhì)意指寄生蟲(chóng)粗制劑中對(duì)寄生蟲(chóng)本身無(wú)特異性的物質(zhì)。例如， 在子孢子制劑中，附帶物質(zhì)是對(duì)子孢子本身無(wú)特異性的物質(zhì)。附帶物質(zhì)包括對(duì)生長(zhǎng)或產(chǎn)生子孢子的來(lái)源具有特異性的物質(zhì)、尤其生物碎片、更尤其蛋白質(zhì)，所述物質(zhì)與粗制劑中的子孢子分離。制劑中附帶物質(zhì)使制劑稱為“粗”制劑，并且對(duì)于子孢子來(lái)說(shuō)，所述物質(zhì)包括對(duì)發(fā)育出子孢子或已分離出子孢子的基質(zhì)具有特異性的物質(zhì)。對(duì)于從宿主蚊子的唾液腺剝離并分離的子孢子來(lái)說(shuō)，附帶物質(zhì)是宿主物質(zhì)、宿主蛋白、唾液腺物質(zhì)、唾液和諸如此類。附帶物質(zhì)不包括有意添加到制劑中的組份，例如賦形劑、稀釋劑、添加劑和諸如此類。在一些實(shí)施例中，可將已從粗制劑移除的附帶物質(zhì)組份添加回純化制劑，以優(yōu)化對(duì)宿主的子孢子感染性、子孢子免疫原性或子孢子呈遞。并不將所述反添加物質(zhì)視為如本文所定義的附帶物質(zhì)。
本文所用“減毒”意指使得活有機(jī)體不能完成其生命周期但不會(huì)將其殺死。有機(jī)體可具有復(fù)制、表達(dá)蛋白和在一些生命周期階段發(fā)育的有限能力，但防止在特定生命周期階段發(fā)育并且不能發(fā)育地進(jìn)展超過(guò)所述階段。對(duì)于本文所揭示減毒瘧原蟲(chóng)寄生蟲(chóng)，即在子孢子階段暴露于輻射的寄生蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，其保留使宿主肝細(xì)胞感染并表達(dá)階段特異性蛋白的能力，但不能發(fā)育超過(guò)肝階段，在肝階段(裂殖子階段)后不能重新進(jìn)入感染宿主的血流，不能引發(fā)瘧疾的疾病病狀。其它減毒瘧原蟲(chóng)種類寄生蟲(chóng)可保留以下能力感染宿主肝細(xì)胞，發(fā)育超過(guò)肝階段，在肝階段(裂殖子階段)后重新進(jìn)入感染宿主的血流，和甚至感染紅細(xì)胞， 但隨后在表現(xiàn)出瘧疾的疾病病狀的階段之前停止發(fā)育。本文所用“賦予保護(hù)性免疫力”是指使群體或宿主(即個(gè)體)能產(chǎn)生免疫應(yīng)答以抵抗由病原體(例如惡性瘧原蟲(chóng))引發(fā)的疾病(例如瘧疾)，從而使得與未治療宿主相比減少宿主中疾病的臨床表現(xiàn)、病狀或癥狀，或使得與未治療群體相比降低群體內(nèi)感染或疾病的臨床表現(xiàn)、病狀或癥狀的出現(xiàn)率。本文所用“污染物”和污染意指外來(lái)微生物或病毒污染或病原性污染，其包括(但不限于)細(xì)菌、病毒、支原體、真菌和諸如此類。消毒性工藝經(jīng)設(shè)計(jì)以防止引入污染并且無(wú)菌制劑不存在污染。污染物也可為非生物或無(wú)機(jī)毒性物質(zhì)。在工藝期間的任一步驟中可能會(huì)偶然或無(wú)意地引入污染物。本文所用“稀釋劑”是于其中制備子孢子和子孢子組合物以達(dá)成期望濃度的介質(zhì)。 稀釋劑可為(例如)生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水或介質(zhì)(例如介質(zhì)199或介質(zhì)E199)(具有鷹氏(Earle' s)平衡鹽的介質(zhì)199)?！百x形劑”意指作為載劑、媒劑或稀釋劑用于醫(yī)藥制劑(例如疫苗)的活性成份的非活性物質(zhì)。本文所用賦形劑是在分離和純化過(guò)程期間添加到制劑中以有助于所述過(guò)程、 最小化非特異性相互作用或吸附和/或提供體積的成份。賦形劑的實(shí)例包括來(lái)自任何來(lái)源的非活性蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白，尤其人類血清白蛋白，所述來(lái)源包括(但不限于)從血液純化，作為重組蛋白來(lái)產(chǎn)生或以合成方式產(chǎn)生。可將從蚊子唾液腺剝離的子孢子置于賦形劑中用于進(jìn)一步處理?？沙鲇谌舾稍?包括在整個(gè)純化過(guò)程期間維持活性、增大穩(wěn)定性或防止分離子孢子的無(wú)意損失)向醫(yī)藥制劑中添加賦形劑。本文所用“免疫應(yīng)答”意指接受者對(duì)引入減毒子孢子的應(yīng)答，其通常特征在于(但不限于)產(chǎn)生抗體和/或T細(xì)胞。通常，免疫應(yīng)答可為細(xì)胞應(yīng)答(例如誘發(fā)或活化對(duì)瘧原蟲(chóng)種類表位具有特異性的CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞)、瘧原蟲(chóng)特異性抗體的增大產(chǎn)生的體液應(yīng)答或細(xì)胞和體液應(yīng)答兩種情況。對(duì)于瘧疾疫苗來(lái)說(shuō)，由包含子孢子的疫苗建立的免疫應(yīng)答包括(但不限于)對(duì)細(xì)胞外子孢子表達(dá)的蛋白質(zhì)或在在寄生蟲(chóng)已進(jìn)入宿主細(xì)胞(尤其肝細(xì)胞和單核細(xì)胞，例如樹(shù)突細(xì)胞)后其它階段寄生蟲(chóng)表達(dá)的蛋白質(zhì)的應(yīng)答和/或?qū)λ黾纳x(chóng)的組份的應(yīng)答。在本發(fā)明中，在隨后由感染性有機(jī)體攻擊時(shí)，免疫應(yīng)答防止病原性寄生蟲(chóng)發(fā)育到弓I發(fā)疾病的無(wú)性紅細(xì)胞階段。如本文所定義“靜脈內(nèi)”意指有意直接引入確定的大血管(例如靜脈)的管腔中。本文所用“代謝活性”意指活的，并且能夠執(zhí)行維持性功能和一些生命周期過(guò)程。 對(duì)于減毒子孢子來(lái)說(shuō)，此術(shù)語(yǔ)包括(但不限于)子孢子能夠在培養(yǎng)物中和活體內(nèi)侵入肝細(xì)胞，可能具有分裂和經(jīng)歷一些發(fā)育階段的有限能力，并且能從頭表達(dá)階段特異性蛋白質(zhì)。如本文所定義“減輕”意指實(shí)質(zhì)上降低或減緩瘧疾的強(qiáng)度、癥狀和/或病狀，其可能在接種后以其它方式表現(xiàn)。本文所定義并且對(duì)于過(guò)濾器的孔徑來(lái)說(shuō)，“標(biāo)稱”意指有效孔徑并且是指表觀孔徑可使球形顆粒通過(guò)過(guò)濾器以使過(guò)濾器排除所述大小的顆粒的90%。如本文所定義“非經(jīng)腸”意指不通過(guò)消化道，而是通過(guò)一些其它途徑引入，例如皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、眼窩內(nèi)、囊內(nèi)、脊柱內(nèi)、胸骨內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)皮和諸如此類。如本文所定義并且在防止瘧疾的上下文中使用的“防止”意指防止瘧疾的大部分、 最多所有病狀和臨床表現(xiàn)進(jìn)行表現(xiàn)。如本文所定義并且對(duì)于子孢子制劑的“純化”意指與附帶物質(zhì)分離或與被視為不期望的物質(zhì)分離。如本文所定義并且對(duì)于子孢子的“無(wú)菌”意指不存在任何污染微生物。借助消毒制備方法獲得子孢子的無(wú)菌制劑。通過(guò)特定分析(包括但不限于無(wú)菌度測(cè)試(Sterility Test)(當(dāng)前版美國(guó)藥典<71>，其以引用方式并入本文中))測(cè)定制劑的無(wú)菌度。對(duì)于子孢子制劑來(lái)說(shuō)的“實(shí)質(zhì)上純化的”意指附帶的污染的量減少到小于 85ng/25, 000個(gè)子孢子或附帶的污染減少至少18倍。滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的任一者即足以使子孢子制劑為“實(shí)質(zhì)上純化的”。如本文所定義“治療性”涉及減少已經(jīng)表現(xiàn)的臨床表現(xiàn)或病狀。本文所用“治療有效量”意指量足以減少個(gè)體中疾病的臨床表現(xiàn)、病狀或癥狀，或量足以降低群體內(nèi)疾病的臨床表現(xiàn)、病狀或癥狀的出現(xiàn)率。本文所用“疫苗”是包含免疫原試劑和醫(yī)藥上可接受的稀釋劑的制劑，可能與賦形劑、佐劑和/或添加劑或保護(hù)劑組合。免疫原可包括全感染物或感染物的分子亞群(由感染物以合成或重組方式產(chǎn)生)。當(dāng)投與個(gè)體疫苗時(shí)，免疫原刺激免疫應(yīng)答，其在隨后用感染物攻擊時(shí)保護(hù)個(gè)體免患疾病或減輕由所述試劑引發(fā)的病狀、癥狀或臨床表現(xiàn)。在注射后給予治療性(治療)疫苗并打算減少或防止疾病進(jìn)展。防止性(預(yù)防性)疫苗打算防止初始感染或降低感染速率或負(fù)荷。用于針對(duì)寄生蟲(chóng)病(例如瘧疾)的疫苗中的試劑可為完全滅活(非活性)寄生蟲(chóng)、減毒活寄生蟲(chóng)(不能完全經(jīng)歷其生命周期)或與寄生蟲(chóng)相關(guān)的純化或人工制造分子(例如，重組蛋白、合成肽、DNA質(zhì)粒和表達(dá)瘧原蟲(chóng)蛋白的重組病毒或細(xì)菌)。 如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員容易地了解，疫苗可包含子孢子以及其它組份(例如賦形劑、稀釋劑、 載劑、防腐劑、佐劑或其它免疫增強(qiáng)劑或其組合)。子孢子的純化瘧原蟲(chóng)種類寄生蟲(chóng)在培養(yǎng)物中在消毒條件下生長(zhǎng)以及在瘧蚊種 (Anopheles-species)岐子宿主、最通常斯氏按岐(Anopheles stephensi)宿主中活體內(nèi)生長(zhǎng)。無(wú)菌培養(yǎng)瘧原蟲(chóng)種類肝階段寄生蟲(chóng)的方法(卡佩等人，美國(guó)公開(kāi)案2005/0233435) 和產(chǎn)生減毒和非減毒瘧原蟲(chóng)種類子孢子的方法、尤其使蚊子中的寄生蟲(chóng)生長(zhǎng)和減毒、并收獲減毒和非減毒子孢子的方法已為業(yè)內(nèi)所知并且已有所闡述(參見(jiàn)霍夫曼和盧克，美國(guó)專利第7，229，627號(hào)、美國(guó)公開(kāi)案第2005/0220822號(hào))。本發(fā)明的純化方面分離子孢子與附帶物質(zhì)(例如蚊子宿主唾液腺物質(zhì))(下文稱為“SGM”)、蚊子特異性物質(zhì)和任何其它非子孢子物質(zhì)或組份，由此獲得含有子孢子的實(shí)質(zhì)上純化的制劑。作為純化的一方面，子孢子相對(duì)于附帶的污染物質(zhì)(例如SGM)濃縮。此處，使用酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)測(cè)量制劑的純度以量化子孢子粗制劑和純化制劑中存在的附帶的抗原性SGM(下文稱為“SGM-ELISA”)。其它方法(例如但不限于毛細(xì)管電泳、 質(zhì)譜、反相色譜、免疫印跡、光散射和紫外光譜)可類似地適于測(cè)量附帶物質(zhì)。對(duì)于子孢子從除蚊子外的來(lái)源的純化來(lái)說(shuō)，可類似地調(diào)節(jié)與待純化子孢子的粗制劑中附帶物質(zhì)相關(guān)的類似分析(例如ELISA)。適于來(lái)自除蚊子唾液腺外的來(lái)源的附帶物質(zhì)的抗原的所述ELISA 分析的研發(fā)可使用所述領(lǐng)域的技術(shù)人員常見(jiàn)的類似方案。為進(jìn)行闡釋，提供用于附帶的SGM 的雜質(zhì)分析的方案。應(yīng)了解，提供所述方案用于闡釋并且可通過(guò)(例如)放大進(jìn)行修飾，或以其它方式修飾，并且并不打算限制所主張本發(fā)明的范圍。純化方法本文揭示純化活的瘧原蟲(chóng)種類(例如惡性瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)、三日瘧原蟲(chóng)或卵形瘧原蟲(chóng))的方法。所揭示方法采用不同類型并且具有不同孔徑的一系列尺寸排阻過(guò)濾器，其以新穎且不明顯方式組裝。所述方法將附帶物質(zhì)從活的、游走寄生蟲(chóng)的制劑消除。所述方法的一方面在于依序尺寸排阻過(guò)濾器的孔徑并不總是小于其之前的尺寸排阻過(guò)濾器的孔徑。另一方面在于一些過(guò)濾器提供具有標(biāo)稱孔徑的矩陣并且至少一個(gè)過(guò)濾器提供具有精確孔直徑的徑跡蝕刻過(guò)濾器。至少一個(gè)過(guò)濾器具有接近或稍微小于寄生蟲(chóng)的直徑的孔徑。舉例來(lái)說(shuō)，揭示瘧原蟲(chóng)種類子孢子的純化；然而，所屬領(lǐng)域的實(shí)踐人員應(yīng)了解，根據(jù)有機(jī)體的物理大小，調(diào)節(jié)過(guò)濾器孔徑可產(chǎn)生類似純化。例如，惡性瘧原蟲(chóng)子孢子是桿狀， 并且直徑為約0. 8 士0. 2 μ m且長(zhǎng)度為8. 5 士 1. 5 μ m。霍夫曼SL等人，熱帶傳染病CTropical Infectious Disease)，第 2 版，2006，艾斯維爾(Elsevier)，費(fèi)城(Philadelphia)，賓夕法尼亞州，第 1027 頁(yè)；徐 L. H. (Xu，L. H.)等人，1985，動(dòng)物研究(Zoo. Res.)6 :33_6。通常在用于純化的制劑中，剝離150到400只蚊子的唾液腺。子孢子是從唾液腺通過(guò)使其在針和注射器中來(lái)回通過(guò)(研磨)來(lái)釋放，并且籠統(tǒng)地純化這些腺體的子孢子。然而，可在放大制劑中剝離多若干倍的蚊子，在實(shí)施例中最多1，000只蚊子，在另一實(shí)施例中最多5，000只蚊子，在另一實(shí)施例中最多10，000只蚊子。子孢子是從唾液腺通過(guò)研磨釋放并且通過(guò)本文所揭示尺寸排阻過(guò)濾方法純化經(jīng)研磨唾液腺制劑(純化前制劑)。在整個(gè)純化過(guò)程中將子孢子維持于賦形劑中，通常人類血清白蛋白(HSA)維持于具有鷹氏鹽的培養(yǎng)基199(E-199)中。A-用于純化的物質(zhì)制備每次將經(jīng)研磨剝離產(chǎn)物(純化前制劑)一起接收于單個(gè)管中。這是SGM純化前制劑。其代表約100，000到10億個(gè)子孢子、優(yōu)選100萬(wàn)個(gè)子孢子，且更優(yōu)選至少2500萬(wàn)個(gè)子孢子。SGM在純化前制劑中的測(cè)量量通常介于300ng與12，000ng/25, 000個(gè)子孢子之間， 更通常介于400ng與1，100ng/25, 000個(gè)子孢子之間。隨后將純化前制劑用賦形劑稀釋到 10ml。在純化持續(xù)期間將溶液和試樣保持在15°C與30°C之間。B-純化程序使用蠕動(dòng)泵以至少lml/min但不超過(guò)1000ml/min，優(yōu)選至少2ml/min但不超過(guò) 500ml/min的流速，且更優(yōu)選以至少3mL/min且不超過(guò)200mL/min的流速，將稀釋過(guò)的純化前制劑泵送通過(guò)一系列尺寸排阻過(guò)濾器。通過(guò)每一過(guò)濾器的相應(yīng)通量是至少lL/hr/m2但不超過(guò) 2000L/hr/m2，優(yōu)選 3L/hr/m2 到 1500L/hr/m2，且最優(yōu)選至少 125L/hr/m2 但不超過(guò) 250L/ hr/m2。過(guò)濾器通常用醫(yī)藥級(jí)硅酮管串聯(lián)連接。優(yōu)選初始過(guò)濾器(1號(hào)過(guò)濾器)或初始的兩個(gè)過(guò)濾器(1號(hào)和2號(hào)過(guò)濾器)是矩陣過(guò)濾器并且由聚丙烯制得，然而，也可使用尼龍、混合纖維素酯和硼硅酸鹽玻璃或所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的其它物質(zhì)。優(yōu)選倒數(shù)第二個(gè)過(guò)濾器(3號(hào)過(guò)濾器)是膜過(guò)濾器，最優(yōu)選徑跡蝕刻聚碳酸酯過(guò)濾器，但也可使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的具有類似性質(zhì)的其它過(guò)濾器。在消毒程序中，過(guò)濾器是無(wú)菌的。在一個(gè)實(shí)施例中，串聯(lián)連接三個(gè)過(guò)濾器(1號(hào)過(guò)濾器、2號(hào)過(guò)濾器和3號(hào)過(guò)濾器)并且通過(guò)死端式過(guò)濾 (dead end filtration)將子孢子捕獲到4號(hào)過(guò)濾器上?？墒褂闷渌^(guò)濾器。或者，可僅使用一個(gè)或兩個(gè)過(guò)濾器(如下文第59段中所述)，然而使用三個(gè)過(guò)濾器最佳。在一個(gè)實(shí)施例中，1號(hào)過(guò)濾器是標(biāo)稱孔徑為至少約2. 5微米但不超過(guò)30微米，優(yōu)選至少約5微米但不超過(guò)20微米的膜矩陣。在一個(gè)實(shí)施例中，所用過(guò)濾器的標(biāo)稱孔徑為約10微米，過(guò)濾面積為 17.5cm2。(Polygard -CN 奧普特-密理博(Optiscale-Millipore)目錄號(hào) SmHA47HH3)。 在一個(gè)按比例放大的實(shí)施例中，過(guò)濾面積是1800cm2。2號(hào)過(guò)濾器(也為膜矩陣)的標(biāo)稱孔徑為至少約0.3微米但不大于約1.2微米。在一個(gè)實(shí)施例中，孔徑是約0.6微米，且過(guò)濾面積為17. 5cm2。(Polygard -CN奧普特過(guò)濾器-密理博目錄號(hào)SN06A47HH;3)—小于瘧原蟲(chóng)的直徑。在一個(gè)按比例放大的實(shí)施例中，過(guò)濾面積是1800cm2。在一個(gè)實(shí)施例中，3號(hào)過(guò)濾器是具有精確孔隙直徑和一致孔徑的徑跡蝕刻膜過(guò)濾器，并且孔徑為至少1. 2微米但不大于 3微米一大于前一過(guò)濾器的標(biāo)稱孔徑。在一個(gè)實(shí)施例中，所用過(guò)濾器的孔徑為1.2微米，且過(guò)濾面積為11. 3cm2。(埃斯波(Isopore)膜，直徑為47mm_密理博目錄號(hào)RTTP04700)保持在斯文-洛克(Swin-Loc)過(guò)濾器支架(沃特曼(Whatman)目錄號(hào)420400)中。在一個(gè)按比例放大的實(shí)施例中，過(guò)濾面積是127cm2。在配備有埃斯波膜的攪拌式超濾試池(密理博，型號(hào)8200)中利用4號(hào)過(guò)濾器捕獲過(guò)濾物質(zhì)，所述埃斯波膜為90mm直徑且過(guò)濾面積為 28. 7cm2,并且徑跡蝕刻孔徑不超過(guò)0. 8微米，優(yōu)選不超過(guò)0. 6微米，并且優(yōu)選不超過(guò)0. 2微米。在一個(gè)實(shí)施例中，孔徑是0.4微米(密理博目錄號(hào)HTTP09030)。在一個(gè)按比例放大的實(shí)施例中，過(guò)濾面積是162cm2。在另一按比例放大的實(shí)施例中，過(guò)濾面積是63cm2。將系統(tǒng)用介質(zhì)洗滌若干次。當(dāng)攪拌式試池中的滯留物體積達(dá)到約40ml時(shí)，打開(kāi)攪拌式試池容器出口并通過(guò)重力排放，留下約5ml到IOml殘余滯留物，盡管可通過(guò)其它方法(例如由壓縮氣體(例如氮)或機(jī)械裝置(例如活塞)施加壓力)減小滯留物體積，但重力法是優(yōu)選方法。 將所述殘余滯留物以及使用純化介質(zhì)的三次洗滌液總共約35ml收集并轉(zhuǎn)移到通常35ml無(wú)菌橡樹(shù)嶺(Oak Ridge)型離心管或類似離心管(管的大小將根據(jù)制劑的體積變化)中。將在35ml橡樹(shù)嶺型管中的介質(zhì)中的純化子孢子以5，OOOg到25，000g，優(yōu)選以16，300g離心2 分鐘到12分鐘，優(yōu)選5分鐘，從而使子孢子成丸狀。傾析出上清液介質(zhì)。所述步驟另外通過(guò)移除保留于上清液中的更易漂浮的較小物質(zhì)和可溶物質(zhì)來(lái)純化子孢子。
使用3尺寸排阻過(guò)濾器方法，所述程序可使純化子孢子制劑中的附帶物質(zhì)比純化前制劑中的附帶物質(zhì)顯著減少大于200到10，000倍(減少因子)。殘余SGM在無(wú)菌純化子孢子的純化制劑中的量通常小于25ng附帶物質(zhì)/25，000個(gè)子孢子(相對(duì)于SGM的初始量減少97%以上)、優(yōu)選小于15ng/25，000個(gè)子孢子(減少98% )，且更優(yōu)選小于lng/25，000 個(gè)子孢子(99.9%)。本文所述每一純化制劑中的污染SGM通常比初始經(jīng)研磨純化前唾液腺物質(zhì)中的SGM減少數(shù)千倍，每一純化制劑是從純化前唾液腺物質(zhì)衍生得。優(yōu)選地，純化減少因子是至少15倍、更優(yōu)選地，純化因子是至少1，500倍且最優(yōu)選為至少3，500倍。實(shí)例1 中所述10個(gè)活動(dòng)中的減少因子的幾何平均值是1625，在純化過(guò)程期間SGM減少99. 93%。
例如，從實(shí)例1 (表2)中所示剝離蚊子唾液腺分離的純化子孢子制劑含有0. 19ng 到1. Olng范圍的SGM/25，000個(gè)子孢子并且附帶的SGM的減少百分比在99. 91%到99. 97% 范圍內(nèi)。或者，下文第59段中所述方法提供具有不超過(guò)85ng SGM/25，000個(gè)子孢子制劑 (附帶的SGM物質(zhì)減少95%)并且認(rèn)為其實(shí)質(zhì)上純化的。表2中10個(gè)生產(chǎn)活動(dòng)(使用3尺寸排阻過(guò)濾器)的純化制劑中的SGM的幾何平均值是0. 51ng SGM/25, 000個(gè)子孢子，95% 置信區(qū)間為0. 34ng到0. 67ng SGM/25, 000個(gè)子孢子。在一替代實(shí)施例中，從上文第56段中所述過(guò)濾器組除去3號(hào)過(guò)濾器并且使用2尺寸排阻過(guò)濾器方法(1號(hào)中間過(guò)濾器和2號(hào)中間過(guò)濾器)。如上文第56段中所述捕獲子孢子。在所述實(shí)施例的一實(shí)例中，如所述裝載并純化l，555ng/25，000個(gè)子孢子的粗制劑(減去3號(hào)過(guò)濾器)。在收集(在0. 4微米或0. 45微米過(guò)濾器上)并重新懸浮后，純化制劑含有84ng/25，000個(gè)子孢子。此處，減少因子大于18倍并且移除94. 6% SGM污染。認(rèn)為所述制劑為實(shí)質(zhì)上純化的。純化子孢子的產(chǎn)率范圍為起始制劑中的30%到100%子孢子數(shù)，通常介于50%與 70%之間。所述方法有效減少粗子孢子制劑中的污染。隨后保存子孢子。在實(shí)施例中，冷藏保存子孢子(麗芙J.L. (Leef J. L.)等人，世界衛(wèi)生組織通告(Bull WHO) 57(增刊1) (1979)87-91 ；奧吉Α. U.，F(xiàn). (Orjih Α. U.，F(xiàn).)和紐森維戈RS，美國(guó)熱帶病與衛(wèi)生學(xué)雜志 (Am. J. TroP. Med. Hyg.) (1980) 29 (3) :343-7)。在實(shí)施例中，通過(guò)凍干保存子孢子。在實(shí)施例中，通過(guò)冷藏保存子孢子。其它保存方法為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所知。減毒已知誘發(fā)瘧原蟲(chóng)子孢子減毒的若干方式。所述方式包括可遺傳的遺傳改變、基因突變、輻射暴露和于致突變化學(xué)物質(zhì)中暴露、于代謝抑制化學(xué)物質(zhì)中暴露和于環(huán)境條件 (例如高或低溫或壓力)中暴露。已揭示通過(guò)輻射暴露誘發(fā)子孢子減毒的方法(例如，參見(jiàn)霍夫曼和盧克，美國(guó)專利第7，229，627號(hào)、美國(guó)公開(kāi)案第2005/0220822號(hào))并且以引用方式并入本文中?？蓪⒆渔咦訙p毒至少I(mǎi)OOGy但不超過(guò)lOOOGy，優(yōu)選地120到200Gy，并且最優(yōu)選地約150Gy。本文所揭示疫苗的瘧原蟲(chóng)寄生蟲(chóng)的減毒允許子孢子階段寄生蟲(chóng)保留代謝活性、感染性和侵入肝細(xì)胞的能力(效力)；同時(shí)確保寄生蟲(chóng)不會(huì)發(fā)育到完全成熟的肝裂殖體階段，不會(huì)重新進(jìn)入宿主血流、侵入紅細(xì)胞或達(dá)到可引發(fā)疾病的發(fā)育階段(安全性)。所述領(lǐng)域的技術(shù)人員可以常規(guī)方式確定寄生蟲(chóng)的發(fā)育階段并且視需要調(diào)節(jié)減毒。肝細(xì)胞瘧原蟲(chóng)感染的生物學(xué)為活體外分析提供證實(shí)效力和安全的機(jī)會(huì)。通常，子孢子主要通過(guò)血流、但可能通過(guò)淋巴系統(tǒng)從蚊子叮咬位點(diǎn)遷移到肝。在肝中，其在肝細(xì)胞內(nèi)繁殖，在惡性瘧原蟲(chóng)情形下每個(gè)感染細(xì)胞產(chǎn)生約10，000至40，000個(gè)子代(裂殖子)。所述肝階段寄生蟲(chóng)表達(dá)在子孢子中或在稍后發(fā)育階段不表達(dá)的多種蛋白質(zhì)。在肝中發(fā)育到裂殖子階段后，其從肝細(xì)胞釋放并重新進(jìn)入血流，從而表達(dá)與在子孢子階段和肝早期階段表達(dá)的蛋白質(zhì)不同的一組不同階段特異性蛋白質(zhì)，并且侵入紅細(xì)胞，其中額外繁殖每48小時(shí)使寄生蟲(chóng)數(shù)增加約10到20倍。與在肝中發(fā)育5到10天(其不誘發(fā)疾病的任何癥狀或體征)不同，未經(jīng)治療的血液階段感染會(huì)引發(fā)溶血、寒顫、發(fā)熱和虛脫和瘧疾的許多其它癥狀和體征。
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效力分析可通過(guò)使用免疫熒光分析(IFA)測(cè)量人類肝細(xì)胞培養(yǎng)物中的惡性瘧原蟲(chóng)肝階段抗原-1 (PfLSA-I)的表達(dá)來(lái)評(píng)定純化輻射-減毒惡性瘧原蟲(chóng)子孢子的感染效力水平。 PfLSA-I是一種子孢子不表達(dá)，但惡性瘧原蟲(chóng)寄生蟲(chóng)(減毒和野生型)在順利侵入肝細(xì)胞后表達(dá)的蛋白質(zhì)(圖幻。PfLSA-I的表達(dá)指示減毒子孢子具有代謝活性。在感染前約對(duì)士6小時(shí)，以1 1比率使用杜貝克氏改良鷹氏培養(yǎng)基 (Dulbecco ‘ s modified Eagle ‘ s medium)與補(bǔ)充有 10 % 胎牛血清和 2 % 青霉素 (penicillin)/ 鏈霉素(streptomycin)溶液的 F-12 海姆氏(Ham' s)混合物(HC-04 生長(zhǎng)培養(yǎng)基)來(lái)接種人類肝細(xì)胞(細(xì)胞系HC-04[1F9]，參見(jiàn)帕拉楚日J(rèn). (PraChumsri，J.)和 N.伊馬闊(N. Yimamnuaychok),U. S. 7，015，036)。將細(xì)胞以 4. OX IO4 個(gè)細(xì)胞 /0. 3ml/ 孔的濃度接種到涂布有巢蛋白-IV型膠原-層粘連蛋白(Entactin Collagen-IV Laminin,ECL) (阿普斯特(Upstate)的8孔來(lái)博泰克普諾克斯(Lab Tek Permanox) (NUNC)腔室載玻片中， 并在37 士 1 °C、5 % C02和80 %相對(duì)濕度下培育。在接種后M 士 6小時(shí)，單層鋪滿達(dá)到>80 % 時(shí)，從每一孔中抽吸出培養(yǎng)物上清液，更換0. 3ml新鮮HC-04生長(zhǎng)培養(yǎng)基并放回培育箱中。將減毒惡性瘧原蟲(chóng)子孢子用HC-04生長(zhǎng)培養(yǎng)基稀釋到500個(gè)子孢子/ μ 1的濃度。在抽吸300 μ 1培養(yǎng)基后，隨后向每一孔中添加50 μ 1稀釋寄生蟲(chóng)試樣，使每一孔中含有2. 5X IO4個(gè)細(xì)胞，從而感染HC-04細(xì)胞。將經(jīng)感染肝細(xì)胞培育3士0. 5小時(shí)，通過(guò)緩慢抽吸上清液用HC-04生長(zhǎng)培養(yǎng)基洗滌三次，并用0. 3ml新鮮培養(yǎng)基/孔來(lái)培養(yǎng)。每天觀察培養(yǎng)物中存在污染的任何跡象，共觀察三天。在不存在污染時(shí)，每天從個(gè)別孔抽吸出培養(yǎng)物上清液并更換0. 3ml新鮮HC-04生長(zhǎng)培養(yǎng)基并放回培育箱中。在感染后72士6小時(shí)，以顯微鏡觀察培養(yǎng)物中可能的污染。在不存在污染時(shí)，將培養(yǎng)物用0.3ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS) 洗滌三次，于室溫下用0. 3ml冷甲醇(存儲(chǔ)于-20°C下)固定，使用0. 3ml PBS再洗滌三次并存儲(chǔ)在0. 3ml冷甲醇中。載玻片可在2°C到8°C下的冰箱中存儲(chǔ)最長(zhǎng)72小時(shí)，直到使用作為一級(jí)抗體的抗PfLSA-I多克隆兔血清和經(jīng)阿萊克薩熒光-488 (Alexa fluor-488)標(biāo)記的抗兔二級(jí)抗體對(duì)其進(jìn)行免疫熒光染色。從經(jīng)染色載玻片移除塑料腔室和墊片。使用韋可塔謝爾德(Vectashield)封固劑(媒介)封固載玻片并用蓋玻片覆蓋。通過(guò)使用具有相位差的落射熒光顯微鏡對(duì)每孔中所有表達(dá)PfLSA-I的寄生蟲(chóng)進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)載玻片(圖3)。 如果制劑在任何步驟中都沒(méi)有污染并且發(fā)熒光的寄生蟲(chóng)數(shù)量是至少200/孔，則認(rèn)為子孢子有效。疫苗組合物已提供包含減毒和病原性兩種活的瘧原蟲(chóng)子孢子的醫(yī)藥組合物和在疫苗和藥物測(cè)試中使用所述組合物作為防止性疫苗組合物來(lái)防止疾病的方法和作為病原性攻擊組合物來(lái)感染志愿者的方法(尤其參見(jiàn)霍夫曼USSN US2005/022082》。已考慮不同種類的減毒子孢子用于疫苗中。所述子孢子包括通過(guò)不同方法(包括可遺傳的遺傳改變、基因突變、輻射暴露和化學(xué)暴露)減毒的子孢子。已闡述針對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)(史卡潔克等人，公共科學(xué)圖書(shū)館 綜合0008)3 :e3549)以及鼠類特異性瘧原蟲(chóng)種類(卡佩等人，美國(guó)專利7，122，179 ；凡代克等人，美國(guó)科學(xué)院院報(bào)(2005) 102 :12194-12199，洛鮑伊等人，感染與免疫(2007)75 3758)通過(guò)寄生蟲(chóng)的直接遺傳操作產(chǎn)生的不同減毒分離物。在實(shí)施例中，通過(guò)于、輻射中暴露達(dá)成人類特異性瘧原蟲(chóng)的輻射減毒。(霍夫曼S.L.等人.0002) 185:1155-1164)。本文所提供純化方法打算純化完全感染的子孢子以及減毒子孢子。在實(shí)施例中，可對(duì)減毒瘧原蟲(chóng)子孢子進(jìn)行遺傳操作以含有其它瘧原蟲(chóng)種類或其它病原性有機(jī)體的外源性基因，其可在感染之前、期間或之后表達(dá)。還涵蓋包含純化病原性子孢子的接種方法。例如，可將病原性子孢子投與同時(shí)用有效抗無(wú)性紅細(xì)胞階段寄生蟲(chóng)的抗瘧疾藥(例如氯喹)治療的個(gè)體，或投與隨后用有效抗無(wú)性紅細(xì)胞階段寄生蟲(chóng)的抗瘧疾藥治療的個(gè)體，由此防止由活體內(nèi)寄生蟲(chóng)引發(fā)的病狀，同時(shí)允許寄生蟲(chóng)刺激保護(hù)性免疫力應(yīng)答。羅斯頓博格M. (Roestenberg,M.)等人Q009)新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志 361 =468-478 ；彭波 DJ. (Pombo, DJ.)等人(2002)柳葉刀 360 :610_617。無(wú)菌的純化病原性子孢子也可用于攻擊方案，以在對(duì)預(yù)先用疫苗和疫苗方法治療的志愿者進(jìn)行的攻擊研究中評(píng)定這些疫苗和疫苗接種方法的有效性。類似地，在評(píng)定化學(xué)預(yù)防性藥物和治療劑的有效性的研究中，純化病原性子孢子可用于產(chǎn)生瘧疾的癥狀、體征或病狀。由于包含無(wú)菌純化子孢子的組合物和疫苗減少或消除附帶物質(zhì)或污染會(huì)引發(fā)不需要的免疫應(yīng)答、外來(lái)病原感染或其它意外結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)，所以已經(jīng)純化的無(wú)菌活病原性子孢子、以及已經(jīng)純化的無(wú)菌減毒活子孢子通常比其非無(wú)菌、未純化對(duì)等部分更有用。通常通過(guò)非經(jīng)腸和本文所述其它途徑投與包含純化減毒活瘧原蟲(chóng)種類子孢子的疫苗。所述疫苗用于防止或減輕瘧疾的嚴(yán)重性、其表現(xiàn)、癥狀或其病狀。在實(shí)施例中，包含在消毒條件下制備的減毒純化子孢子的組合物和疫苗在先前未暴露于引發(fā)瘧疾的病原體中或經(jīng)暴露但未完全受保護(hù)的人類和其它哺乳動(dòng)物個(gè)體中提供部分、增強(qiáng)或完全保護(hù)。所述組合物和疫苗可類似地用于減少因可引發(fā)瘧疾的寄生蟲(chóng)(包括瘧原蟲(chóng)種類，例如惡性瘧原蟲(chóng)或間日瘧原蟲(chóng)和諸如此類)而發(fā)生可引發(fā)疾病的感染的機(jī)會(huì)，并且減少在受感染時(shí)生病的機(jī)會(huì)，減輕在受感染時(shí)疾病(例如發(fā)熱)的嚴(yán)重性，降低寄生蟲(chóng)在受感染人員中的濃度，或降低暴露于瘧疾寄生蟲(chóng)中的群體中因瘧疾所致的死亡率。 在許多情形下，與未免疫個(gè)體相比，即使部分保護(hù)經(jīng)免疫個(gè)體或延遲經(jīng)免疫個(gè)體被寄生蟲(chóng)感染或因感染而患病的時(shí)間也是有益的。類似地，在約30%群體中產(chǎn)生所述益處中的任一種的疫苗治療策略都可對(duì)社區(qū)衛(wèi)生和居住在所述社區(qū)中的個(gè)體健康產(chǎn)生顯著影響。在包含病原性子孢子的其它實(shí)施例中，所揭示組合物可用于證實(shí)疫苗、瘧疾治療藥物和瘧疾的其它治療和防止措施的功效。提供防止個(gè)體中的瘧疾的方法。所述方法包含投與個(gè)體在消毒條件下制備并且包含可有效防止瘧疾的量的實(shí)質(zhì)上純化的減毒活瘧原蟲(chóng)子孢子的疫苗。根據(jù)所述方法投與疫苗的個(gè)體可為易于感染瘧疾寄生蟲(chóng)的任一人類或其它哺乳動(dòng)物。對(duì)于所述方法來(lái)說(shuō)，投與可通過(guò)消化道(例如經(jīng)口)來(lái)進(jìn)行，或者投與可為非經(jīng)腸投與，包括但不限于經(jīng)粘膜、鼻內(nèi)、表皮、皮膚、肌內(nèi)、皮下、皮內(nèi)、粘膜下、靜脈內(nèi)和諸如此類投與。此外，投與可通過(guò)連續(xù)輸注或單次或多次濃注以及由微型針調(diào)介的遞送來(lái)進(jìn)行。熟練的從業(yè)人員通過(guò)評(píng)價(jià)與瘧疾感染相關(guān)的臨床或病理表現(xiàn)(例如溫度升高、頭痛、疲勞、昏迷或寄生紅細(xì)胞的百分比)可容易地確認(rèn)瘧疾的防止和/或治療。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法，在投與包含純化減毒活瘧原蟲(chóng)子孢子的疫苗后，個(gè)體中瘧疾的臨床體征、癥狀或病理表現(xiàn)顯示改良或不存在。可使用業(yè)內(nèi)已知的方法確定疫苗和免疫原的有效且最佳劑量范圍。根據(jù)本文所揭示的例示分析提供關(guān)于達(dá)成抗瘧疾效應(yīng)的適當(dāng)劑量的指南。更具體來(lái)說(shuō)，可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員外推本文和所引用參考文獻(xiàn)中闡述的免疫類型的結(jié)果以提供測(cè)試接種計(jì)劃表。 用不同劑量以計(jì)劃間隔接種志愿者個(gè)體并且評(píng)價(jià)在隨后用感染性寄生蟲(chóng)攻擊時(shí)測(cè)試血樣抵抗瘧疾的水平。可使用所述結(jié)果分離哺乳動(dòng)物(尤其人類)個(gè)體的有效免疫的最佳免疫劑量和投藥方案(計(jì)劃表)。有效賦予保護(hù)性免疫力的劑量是以1到6次投與的投藥方案投與5，000到400，000個(gè)純化減毒子孢子、更尤其劑量為以至少2次投與的投藥方案投與15，000到270，000個(gè)純化減毒子孢子，且最尤其劑量為以3或4次投與的投藥方案投與 25，000到150，000個(gè)純化減毒子孢子。可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試測(cè)量個(gè)體中的免疫應(yīng)答，所述測(cè)試包括但不限于評(píng)定體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，包括但不限于測(cè)量抗原特異性或寄生蟲(chóng)階段特異性應(yīng)答；通過(guò)業(yè)內(nèi)已知的方式直接量測(cè)周邊血液淋巴細(xì)胞；天然殺傷細(xì)胞細(xì)胞毒性分析(普羅文西(ftxwinciali) 等人，(1992)免疫學(xué)方法雜志(J. Immunol. Meth. )155 :19- )、細(xì)胞增殖分析(弗倫懷德(Vollenweider)等人(1992)免疫學(xué)方法雜志149 :133-135)、免疫細(xì)胞和亞群的免疫分析(萊夫勒(Loeffler)等人，(1992)細(xì)胞計(jì)量術(shù)(Cytom.) 13 169-174 ；雷沃替尼(Rivoltini)等人，(1992)癌癥免疫與免疫治療(Can. Immunol. Immunother.) 34 241-251)；和細(xì)胞調(diào)介的免疫力的皮膚測(cè)試(Chang等人.(199 癌癥研究(Cancer Res.) 53 1043-1050)。已闡述測(cè)量免疫系統(tǒng)強(qiáng)度的各種方法和分析，例如，科林根 (Coligan)等人(編輯)(2000)當(dāng)前免疫學(xué)方案)(Current Protocols in Immunology), 第1卷，威利父子公司(Wiley&Sons)。所提供疫苗包含實(shí)質(zhì)上不含附帶物質(zhì)的純化減毒活瘧原蟲(chóng)子孢子的消毒和非消毒組合物，和具有醫(yī)藥上可接受的稀釋劑、賦形劑或載劑的組合物。在隨后用感染性寄生蟲(chóng)攻擊時(shí)，這些疫苗可有效防止或減輕瘧疾。調(diào)配醫(yī)藥組合物和疫苗的方法已為所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知(例如，參見(jiàn)雷明頓(Remington)，藥學(xué)技術(shù)與實(shí)踐(The Science andPractice of Pharmacy)，第 21 版，亨特利臣(Hendrickson)編輯(USIP :2005))。本發(fā)明涵蓋在消毒條件下制備或以其它方式制備且包含純化的減毒或非減毒活瘧原蟲(chóng)子孢子以及適當(dāng)稀釋劑和緩沖劑的疫苗組合物。稀釋劑(通常為磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)或生理鹽水(NQ)具有不同緩沖容量pH和離子強(qiáng)度。所述組合物還可包括賦形劑， 例如血清白蛋白，尤其人類血清白蛋白。血清白蛋白可從天然來(lái)源(例如人類血液)純化得或通過(guò)重組DNA或合成技術(shù)產(chǎn)生。所述組合物還可包括添加劑，例如抗氧化劑(例如抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)和/或防腐劑或低溫保存劑。還可向聚合化合物(例如聚乳酸、聚乙醇酸等)的微粒制劑或脂質(zhì)體中引入所述物質(zhì)。(例如，參見(jiàn)雷明頓藥物科學(xué)(Remington' s Pharmaceutical Sciences)，第 18 版(1990)，馬克出版公司(Mack Publishing Co·)，伊斯頓，賓夕法尼亞州，18042，第1435到1712頁(yè)，其以引用方式并入本文中)。為測(cè)定疫苗的有效量，普通熟練從業(yè)人員通過(guò)考慮接受者的治療背景、年齡和一般健康狀況將能夠確認(rèn)適當(dāng)劑量。所選劑量取決于期望治療效果、投與途徑和期望治療持續(xù)時(shí)間?？捎伤鶎兕I(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)適當(dāng)人類臨床試驗(yàn)確認(rèn)用于測(cè)定劑量量的實(shí)驗(yàn)，其中評(píng)價(jià)不同投藥方案激發(fā)抵抗瘧疾的能力。所揭示疫苗和使用這些疫苗的揭示方法可以單一組份形式用于疫苗方案中，每一組份又包含待分開(kāi)投與個(gè)體的離散疫苗。方案可包括依次用減毒瘧原蟲(chóng)種類子孢子和其它類型的瘧原蟲(chóng)疫苗免疫，即所謂的初免-加強(qiáng)策略。所述策略可包括減毒子孢子作為初免和瘧原蟲(chóng)相關(guān)重組蛋白質(zhì)或佐劑中的蛋白質(zhì)作為加強(qiáng)，或反之亦然。所述策略還可包括表達(dá)瘧原蟲(chóng)相關(guān)蛋白質(zhì)的瘧原蟲(chóng)相關(guān)DNA疫苗或重組病毒(例如腺病毒)作為初免和純化減毒子孢子疫苗作為加強(qiáng)，或反之亦然。其還可包括用減毒瘧原蟲(chóng)種類子孢子和某種形式的紅細(xì)胞內(nèi)階段寄生蟲(chóng)(包括滅活的和活的減毒寄生蟲(chóng))依次或混合免疫。包含單獨(dú)組份的疫苗復(fù)合物可稱作疫苗方案、初免/加強(qiáng)方案、組份疫苗、包含單獨(dú)疫苗組份的組份疫苗試劑盒或組份疫苗包裝。例如，疫苗復(fù)合物可包含作為組份且包含純化、消毒、減毒活子孢子的疫苗。復(fù)合物可另外包含一種或一種以上重組或合成亞單位疫苗組份，其包括但不限于重組蛋白、合成多肽、編碼這些要素本身或功能上納入重組病毒、重組細(xì)菌或重組寄生蟲(chóng)中的DNA。疫苗組份還可包括細(xì)胞外發(fā)育到肝早期階段的消毒減毒無(wú)菌子孢子。已闡述來(lái)自世界不同地方西非、東非、東南亞等的惡性瘧原蟲(chóng)品系。利用一種品系的減毒子孢子免疫的志愿者呈現(xiàn)可抵抗其它品系(霍夫曼S.L.等人Q002)傳染病雜志 (J. Inf. Dis.)，185 :1155-1164)。在一實(shí)施例中，在子孢子組合物或疫苗調(diào)配物中組合瘧原蟲(chóng)種類的多個(gè)分離物和/或品系。已知若干瘧原蟲(chóng)種類可在人類中引發(fā)瘧疾，主要為惡性瘧原蟲(chóng)和間日瘧原蟲(chóng)。其它瘧原蟲(chóng)種類也會(huì)引發(fā)瘧疾，包括三日瘧原蟲(chóng)和卵形瘧原蟲(chóng)。已知諾氏瘧原蟲(chóng)也可引發(fā)人類疾病。在一實(shí)施例中，在疫苗調(diào)配物中組合兩種或兩種以上瘧原蟲(chóng)種類。在又一些實(shí)施例中，疫苗方案的單獨(dú)組份可衍生自不同物種，例如一些劑量來(lái)自惡性瘧原蟲(chóng)并且其它劑量來(lái)自間日瘧原蟲(chóng)。在另一實(shí)施例中，子孢子可為轉(zhuǎn)基因或重組寄生蟲(chóng)，即包括并且表達(dá)DNA序列或基因的寄生蟲(chóng)，所述DNA序列或基因?qū)衅涞募纳x(chóng)種類的來(lái)說(shuō)是外來(lái)物，本文中稱作轉(zhuǎn)基因。(例如，參見(jiàn)弗蘭克-法雅(Franke-Fayard)等人，分子與生化寄生蟲(chóng)學(xué)(Molec. and Biochem-Parasitol. )2004在完整生命周期中以高水平組成性表現(xiàn)GFP的伯氏瘧原蟲(chóng)基準(zhǔn)線(A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle. ) 137 :23-33 ；溫格尼克 K. (ffengelnik, K.)等人·歐洲分子生物學(xué)學(xué)會(huì)雜志(ΕΜΒ0 J.) 1999，惡性瘧原蟲(chóng)TRAP 的A域和凝血酶敏感蛋白相關(guān)基元參與蚊子唾液腺的侵入過(guò)程(The Α-domain and the thrombospondin-related motif of Plasmodium falciparum TRAP are implicated in the invasion process of mosquito salivary glands. )，18 :5195_5204)。所屬領(lǐng)域白勺技術(shù)人員應(yīng)了解，可根據(jù)本文所揭示方法以與產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因寄生蟲(chóng)的母體寄生蟲(chóng)相同的方式和相同程度純化轉(zhuǎn)基因寄生蟲(chóng)(即含有轉(zhuǎn)基因的寄生蟲(chóng))。最近公布的結(jié)果報(bào)告，嚙齒動(dòng)物瘧疾系統(tǒng)中的跨物種保護(hù)作用已顯示對(duì)發(fā)生于人類瘧疾系統(tǒng)中的情況具有高程度的可預(yù)測(cè)性(賽達(dá)各M. (Sedegah，M.)等人Q007)寄生蟲(chóng)免疫學(xué)(Parasite Immunol.) 29 :559-565)。這表明，包含惡性瘧原蟲(chóng)的疫苗組合物可提供針對(duì)間日瘧原蟲(chóng)和/或其它人類瘧原蟲(chóng)種類的保護(hù)性免疫力。醫(yī)藥組合物可在室溫和諸如此類條件下保存、冷凍保存、凍干、噴霧干燥、冷藏或熱穩(wěn)定化。上述說(shuō)明和以下實(shí)例二者僅具有例示性和說(shuō)明性，并非對(duì)所主張的本發(fā)明的限制。此外，本發(fā)明并不限于所述的特定實(shí)施例，因此當(dāng)然可變化。此外，由于本發(fā)明的范圍僅受其權(quán)利要求書(shū)的限制，故用于闡述特定實(shí)施例的術(shù)語(yǔ)并不打算具有限制性。除非另有定義，否則本文所用全部科技術(shù)語(yǔ)的含義是本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的含義。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)了解，與本文所述的方法和物質(zhì)類似或等效的任何方法和物質(zhì)也可用于實(shí)踐或測(cè)試本發(fā)明。此外，本文所提及的所有專利、專利申請(qǐng)案和出版物都以引用方式并入本文中。除非上下文另外明確指出，否則本文中和附帶的權(quán)利要求書(shū)中所用的單數(shù)形式 “一”、“或”和“所述”包括復(fù)數(shù)形式的指示物。因此，例如，提及“減毒子孢子疫苗”包括多種所述子孢子，并且提及“所述試劑”包括提及所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的一種或一種以上試劑和其等效物等。此外，在生命周期中具有代謝活性、存活但減毒的且能夠?qū)е炉懠驳呐R床表現(xiàn)和病狀的子孢子可不同地稱為減毒子孢子、活的減毒子孢子和具有代謝活性的活的減毒子孢子。說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中所列的數(shù)字參數(shù)為可隨本發(fā)明的期望性質(zhì)而變化的近似值。在最低限度上且并非試圖限制權(quán)利要求書(shū)范圍的均等論(doctrine of equivalent) 的應(yīng)用，每一數(shù)字參數(shù)均應(yīng)至少根據(jù)所報(bào)告的有效數(shù)位的數(shù)字，通過(guò)應(yīng)用普通舍入技術(shù)來(lái)解釋。盡管如此，仍然應(yīng)盡可能精確地報(bào)告具體實(shí)例中所列的數(shù)值。然而，從實(shí)驗(yàn)測(cè)量獲得的任一數(shù)值固有地包含來(lái)自其實(shí)驗(yàn)測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差的一定誤差。借助于上述教示內(nèi)容可對(duì)本發(fā)明實(shí)施多種修改和改變。因此，應(yīng)理解，可在附帶的權(quán)利要求書(shū)內(nèi)以不同于所闡述具體內(nèi)容的方式來(lái)實(shí)踐本發(fā)明。以下實(shí)例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。其僅對(duì)本發(fā)明具有闡釋性并且揭示本發(fā)明某些實(shí)施例的各種有益性質(zhì)。所述實(shí)例不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。實(shí)例實(shí)例1-附帶的SGM測(cè)定-ELISA可通過(guò)所提供方法純化任何瘧原蟲(chóng)種類的子孢子。本文所提供實(shí)例闡述惡性瘧原蟲(chóng)子孢子(PfSPZ)的純化。然而，其它實(shí)施例采用間日瘧原蟲(chóng)、卵形瘧原蟲(chóng)、三日瘧原蟲(chóng)和/ 或諾氏瘧原蟲(chóng)。又一些實(shí)施例采用所述寄生蟲(chóng)的混合物。又一些實(shí)施例采用每一種類的減毒子孢子。又一些實(shí)施例采用減毒子孢子，其包括并表達(dá)對(duì)所述寄生蟲(chóng)為外來(lái)物的DNA序列或基因A-抗SGM兔抗血清的制備i)從蚊子提取唾液腺為產(chǎn)生針對(duì)蚊子唾液腺的兔抗血清，通過(guò)將10到14日齡養(yǎng)蟲(chóng)室飼養(yǎng)的斯氏按蚊置于4°C冰箱約5分鐘而將其固定。將固定化蚊子簡(jiǎn)單地置于含有70%乙醇的皮氏培養(yǎng)皿 (Petri dish)中并且隨后轉(zhuǎn)移到含有IX磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的皮氏培養(yǎng)皿中。從每只蚊子手動(dòng)剝離一對(duì)唾液腺，置于顯微鏡載玻片上的IX PBS中，并轉(zhuǎn)移到含有20 μ 1到30 μ 1 IX PBS的1. 7ml透明無(wú)菌微管(愛(ài)思進(jìn)科技公司(Axygen Scientific Inc.)，CA)中。以每日計(jì)，剝離約100只蚊子并將30 μ 1 PBS中的100對(duì)唾液腺置于-70°C下的冷凍機(jī)中。在已針對(duì)一種免疫獲得足夠唾液腺時(shí)，從冷凍機(jī)移除小瓶，解凍到室溫并匯集。ii)唾液腺處理對(duì)于初次接種來(lái)說(shuō)，從1，000只蚊子剝離唾液腺并在-70°C下存儲(chǔ)。在接種當(dāng)天，通過(guò)三個(gè)額外冷凍-解凍循環(huán)使用干冰/乙醇浴并在室溫下解凍來(lái)對(duì)試樣進(jìn)行解凍，匯集并解離。使唾液腺在最終體積為600 μ 1的IX PBS中重構(gòu)成并且用孟他奈德(Montanide) ISA 720(SEPPIC公司費(fèi)爾菲爾德，紐澤西州)乳化。對(duì)于所有隨后免疫來(lái)說(shuō)，從500只蚊子剝離唾液腺并每日在-70°C下存儲(chǔ)。在接種當(dāng)天，將試樣解凍，匯集并用研棒(肯特(Kontes)EFM88A)均質(zhì)化。用添加到池中的100 μ 1 PBS沖洗研棒。將試樣重構(gòu)成到600 μ 1 PBS的最終體積并在重構(gòu)成后在30分鐘內(nèi)乳化。iii)唾液腺乳化獲得2ml玻璃小瓶(兩個(gè)小瓶用于佐劑對(duì)照；兩個(gè)小瓶用于佐劑中的唾液腺)。通過(guò)5微米過(guò)濾用注射器提取750 μ 1孟他奈德ISA 720佐劑。將700 μ 1過(guò)濾佐劑注射到每一玻璃小瓶中。向?qū)φ招∑恐刑砑?00 μ 1 PBS并且向?qū)嶒?yàn)小瓶中添加300 μ 1存于PBS中的唾液腺。用橡膠塞塞住小瓶。進(jìn)一步用鋁密封蓋蓋住每一小瓶并且用壓接機(jī)壓所述密封。 將小瓶置于渦流墊的小孔中，膠帶向下，并渦旋30分鐘。iv)乳液和接種量對(duì)于初次免疫來(lái)說(shuō)，使用兩個(gè)玻璃小瓶乳化來(lái)自1，000只蚊子的抗原(各自含有 Ι,ΟΟΟμ 1 300 700體積比的唾液腺/PBS 孟他奈德佐劑)，從而產(chǎn)生總體積為2ml的乳液。對(duì)于隨后免疫來(lái)說(shuō)，類似地在總體積2，000 μ 1中乳化來(lái)自500只蚊子的抗原。因此， 在隨后免疫中注射乳液體積與初次接種物相同但濃度為一半的抗原。所有免疫中的對(duì)照兔接受含有300 700體積比的PBS 佐劑的2ml乳液。在1小時(shí)乳化內(nèi)將所有乳液接種到兔中。實(shí)驗(yàn)兔接受在8個(gè)位點(diǎn)處皮下注射的2，000 μ 1唾液腺佐劑(以體積計(jì)比率為 300 700)乳液，每個(gè)位點(diǎn)注射250 μ 1。對(duì)照兔接受在8個(gè)位點(diǎn)處皮下注射的2，000 μ 1 PBS 佐劑(以體積計(jì)比率為300 700)乳液，每個(gè)位點(diǎn)注射250 μ 1。ν)兔免疫計(jì)劃表表1提供用于產(chǎn)生本文所提供實(shí)例中所用多克隆抗體的免疫計(jì)劃表。關(guān)于多克隆抗體制備方法，所述計(jì)劃表并不打算具有限制性，而是僅提供作為本文所用抗體的實(shí)例和揭示內(nèi)容。
權(quán)利要求
1.一種實(shí)質(zhì)上純化的瘧原蟲(chóng)(Plasmodium)種類寄生蟲(chóng)制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述寄生蟲(chóng)具有代謝活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制劑，其中所述寄生蟲(chóng)是感染性子孢子。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制劑，其另外包含賦形劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑，其中所述瘧原蟲(chóng)種類是惡性瘧原蟲(chóng)(P.falciparum)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑，其中所述賦形劑包含人類血清白蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑，其中所述子孢子是從蚊子純化得到。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制劑，其中所述子孢子是從唾液腺物質(zhì)的純化前制劑純化得到。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑，其中所述子孢子經(jīng)充分減毒，以使得所述寄生蟲(chóng)在感染宿主后不會(huì)引發(fā)瘧疾的病狀。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑，其中所述子孢子含有一個(gè)或一個(gè)以上轉(zhuǎn)基因。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制劑，其中所述子孢子的種類是惡性瘧原蟲(chóng)。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制劑，其包含小于15納克附帶物質(zhì)/25，000個(gè)子孢子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制劑，其包含小于1納克附帶物質(zhì)/25，000個(gè)子孢子。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制劑，其包含小于0.12納克附帶物質(zhì)/25，000個(gè)子孢子。
15.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，其中至少98%的附帶物質(zhì)已從所述純化前物質(zhì)移除。
16.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，其中至少99.9%的附帶物質(zhì)已從所述純化前物質(zhì)移除。
17.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制劑，其中至少99.97%的附帶物質(zhì)已從所述純化前物質(zhì)移除。
18.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制劑，其中所述減毒是通過(guò)引入可遺傳的遺傳改變或基因突變，或通過(guò)輻射暴露、化學(xué)暴露或環(huán)境暴露來(lái)實(shí)現(xiàn)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的制劑，其中所述減毒是通過(guò)輻射暴露來(lái)實(shí)現(xiàn)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的制劑，其中所述輻射暴露是至少I(mǎi)OOGy但不超過(guò)IOOOGy的輻射。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的制劑，其中所述暴露是150Gy。
22.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制劑，其是在消毒且無(wú)污染的條件下制得。
23.一種賦予人類或其它哺乳動(dòng)物宿主針對(duì)由瘧原蟲(chóng)種類寄生蟲(chóng)誘發(fā)的瘧疾的保護(hù)性免疫力的方法，所述方法包含投與至少一個(gè)劑量的實(shí)質(zhì)上純化的所述瘧原蟲(chóng)屬種類的代謝活性減毒子孢子制劑，其中在隨后暴露于所述瘧原蟲(chóng)種類病原性寄生蟲(chóng)后將防止所述宿主出現(xiàn)所述瘧疾的病理表現(xiàn)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述制劑另外包含賦形劑。
25.根據(jù)權(quán)利要求M所述的方法，其中所述賦形劑包含人類血清白蛋白。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其包含投與至少兩個(gè)劑量的所述制劑。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其包含投與三個(gè)或三個(gè)以上劑量的所述制劑。
28.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述減毒是通過(guò)引入可遺傳的遺傳改變或基因突變，或通過(guò)輻射暴露、化學(xué)暴露或環(huán)境暴露來(lái)實(shí)現(xiàn)。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其中所述減毒是通過(guò)輻射暴露來(lái)實(shí)現(xiàn)。
30.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述瘧原蟲(chóng)種類是惡性瘧原蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)(P. vivax)、卵形瘧原蟲(chóng)(P. ovale)、諾氏瘧原蟲(chóng)(P. knowlesi)或三日瘧原蟲(chóng) (P. malariae)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述種類是惡性瘧原蟲(chóng)。
32.—種純化代謝活性瘧原蟲(chóng)子孢子的方法，所述方法包含(a)提供包含子孢子和附帶的非子孢子物質(zhì)的水性純化前制劑；(b)使所述子孢子制劑依序通過(guò)一組尺寸排阻過(guò)濾器，其包含(i)第一排阻過(guò)濾器，其具有能夠保留大于10微米的附帶物質(zhì)但允許所述子孢子通過(guò)的孔徑；( )第二排阻過(guò)濾器，其具有能夠保留大于約1.2微米的附帶物質(zhì)但允許所述子孢子通過(guò)的孔徑；和(iii)第三膜過(guò)濾器，其具有能夠使1. 2微米或更小的物質(zhì)通過(guò)并且允許所述子孢子通過(guò)的孔徑；(c)在具有能夠保留所述子孢子的孔徑的收集過(guò)濾器上收集實(shí)質(zhì)上純化的子孢子；和(d)從所述收集過(guò)濾器移出所收集的實(shí)質(zhì)上純化的子孢子，由此產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上不含附帶的非子孢子物質(zhì)的純化的子孢子制劑。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中在系統(tǒng)中依序連接所述第一、第二和第三過(guò)濾器，其中所述子孢子以一定通量通過(guò)所述過(guò)濾器。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述系統(tǒng)具有至少3L/hr/m2但不超過(guò)1500L/ hr/m2的通量。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述通量為至少125L/hr/m2但不超過(guò)250L/hr/m 2。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述第一排阻過(guò)濾器具有10微米的標(biāo)稱孔徑。
37.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述第二排阻過(guò)濾器具有0.6微米的標(biāo)稱孔徑。
38.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述第三過(guò)濾器具有1.2微米的孔徑。
39.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述收集過(guò)濾器具有0.4微米的孔徑。
40.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述純化子孢子制劑中附帶的非子孢子物質(zhì)的量小于15納克/25，000個(gè)子孢子。
41.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述純化子孢子制劑中附帶的非子孢子物質(zhì)的量小于1納克/25，000個(gè)子孢子。
42.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述純化子孢子制劑中的所述附帶的非子孢子物質(zhì)小于0. 12納克/25，000個(gè)子孢子。
43.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中已移除所述純化前制劑中至少98%的附帶物質(zhì)。
44.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中移除所述純化前制劑中至少99.9%的附帶物質(zhì)。
45.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中移除所述純化前制劑中至少99.97%的附帶物質(zhì)。
46.一種賦予人類或其它哺乳動(dòng)物宿主針對(duì)由瘧原蟲(chóng)種類寄生蟲(chóng)誘發(fā)的瘧疾的保護(hù)性免疫力的方法，所述方法包含投與抗瘧疾劑的方案，同時(shí)投與至少一個(gè)劑量的實(shí)質(zhì)上純化的所述瘧原蟲(chóng)種類病原性子孢子制劑，其中在隨后暴露于所述瘧原蟲(chóng)種類病原性寄生蟲(chóng)后將防止所述宿主出現(xiàn)所述瘧疾的病理表現(xiàn)。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述抗瘧疾劑是氯喹(chloroquine)。
全文摘要
本發(fā)明揭示實(shí)質(zhì)上純化的瘧原蟲(chóng)(Plasmodium)子孢子和與附帶的非子孢子物質(zhì)實(shí)質(zhì)上分離的瘧原蟲(chóng)子孢子制劑，其中所述瘧原蟲(chóng)子孢子制劑的純度水平提高。本發(fā)明還提供包含純化的瘧原蟲(chóng)子孢子的疫苗和醫(yī)藥組合物。本發(fā)明還提供純化瘧原蟲(chóng)子孢子制劑的方法。
文檔編號(hào)A61K39/015GK102292103SQ201080004734
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2010年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月16日
發(fā)明者B·金·李·辛, 斯蒂芬·L·霍夫曼, 李明林, 理查德·E·斯塔福德 申請(qǐng)人:薩那里亞有限公司