專利名稱：從阿魏(FERULA)屬植物中制備ferutinine的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及阿魏(/^"/a s/7/ )的植物提取物以及從所述提取物中分離 ferutinine的方法。
背景技術：
大量阿魏屬植物含有具有雌激素活性的 s烯，還稱為植物雌激素，即調(diào) 節(jié)激素功能的物質(zhì)，對合成激素在治療經(jīng)前期綜合征和與絕經(jīng)及衰老有關的
紊亂中的用途而言顯然是有效的選擇。某些種類的阿魏(尸mi/")提取物在古 代:f皮用作避孕藥和用于治療陽萎和絕經(jīng)期紊亂。近來，已經(jīng)公開(WO 0230438)阿魏(/^ / fl^i/o幼V/" ￡.)的醇提取物作為抗癌藥。
阿魏屬植物中含量最豐富的化合物是jaeschkenadiol (II)衍生物，
胡蘿卜烷酯是已知的化合物，例如在Phytochemistry，第"巻，n。3,第 597-623頁，1994中公開。式(I)中，R為直鏈或支鏈的飽和或不飽和脂肪族酰 基，或者是任選被取代的芳香族g。 R^團的實例有異戊^、當歸5it&、
特別是具有通式(I)的胡蘿卜烷酯，
笨甲i^、對羥基千基、藜蘆?；蛉夤瘐；?。
來源于阿魏(Fmi/" w/;)的胡蘿卜烷酯是類似于SERMs (選擇性雌激素 受體調(diào)節(jié)劑)的雌激素調(diào)節(jié)劑；其中，ferutinine(Ia)呈現(xiàn)出顯著的雌激素活
性，而其它的胡蘿卜烷酯則具有相當弱的活性。<formula>formula see original document page 4</formula>
具體而言，ferutinine是雌激素受體a激動劑(ERa)及雌激素受體(3激動劑 /拮抗劑(ERp)。還已經(jīng)證明ferutinine與雌激素受體的結合力比他莫昔芬高。
因此，有必要得到富含ferutinine的提取物或者對從含有femtinine前體 的植物材料中提取ferutinine純品進行優(yōu)化。
從文獻(J. Org. Chem. USSR (Engl. Transl.); EN; 28; 10; 1992; 1666-1673)中獲知下迷方法該方法包括^f吏胡蘿卜烷酯全提取物水解產(chǎn)生 jaeschkenadiol粗品，隨后用適宜被保護的對羥基苯甲酸、例如用對乙酰氧 基苯曱酸使jaeschkenadiol重新酯化。但是，此方法的產(chǎn)率相當?shù)?約45%)， 這主要是由于竟爭性酯交換反應而造成的。
發(fā)明詳述
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)使用對新戊酰lL^苯甲酸作為酯化劑可以避免導致低轉(zhuǎn)化產(chǎn) 率的竟爭性反應。
因此，本發(fā)明的目的是制備ferutinine (Ia)的方法，
(,a)
該方法包括以下步驟
a) 從阿魏(/^"/"5/，/0中提取胡蘿卜烷酯；
b) 使胡蘿卜烷酯堿水解，產(chǎn)生jaeschkenadiol(II);
c)用對新戊酰氧基苯曱酸(III)使jaeschkenadiol (II)酯化,
產(chǎn)生對新戊?；鵩erutinine (IV);
<formula>formula see original document page 5</formula>d) 4吏對新戊酰基ferutinine (IV)7jC解為ferutinine。
"胡蘿卜烷酯"表示如上定義的通式(i)化合物；所述的酯可通過如下方
法得到用常規(guī)的方法、例如通過用低級醇提取的方法，提取阿魏(/^,"/ 5/7/7)、優(yōu)選大阿魏CFd/to cww附wi/s)及赫蒙阿魏(Fww/fi Ae/7W0W/S)的才艮莖或 地上部分。從含有1:1比例的ferutinine和jaeschkenadiol苯甲酸酯(通過色語 法不易分離)的赫蒙阿對艮莖開始，ferutinine純品可通過如下方法分離用 曱醇提糾艮，用5。/。KOH處理提取物，用脂肪烴、醚、酯或氯化溶劑^^提皂 化提取物。
或者，胡蘿卜烷酯可通過于35至65'C、優(yōu)選45'C的溫度和200至260bar (即2 x 104至2.6 x 1()4千帕斯卡)、優(yōu)選245bar (即2.45 x 104千帕斯卡)的壓力下 用超臨界C02萃取而得到。分離器內(nèi)(或多個分離器內(nèi))的溫度為25至45X:， 壓力為約50bar(即5000千帕斯卡)。在這些實驗條件下，膠狀材料(使所需化 合物回收困難)不被提取。殘余物可根據(jù)實施例所報道的方法直接進行皂化。
根據(jù)上文所述的方法，其中胡蘿卜烷酯從大阿魏中提取.
根據(jù)上文所述的方法，其中胡蘿卜烷酯從赫蒙阿魏中提取。
根據(jù)上文所述的方法，其中胡蘿卜烷酯用超臨界二氧化碳在35至65。C的 溫度M x 104至2.6 x 104千帕斯卡的壓力下提取。
根據(jù)上文所述的方法，其中溫度為45"C。
才艮據(jù)上文所述的方法，其中分離在25至45 €的溫度及4500至5500千帕斯 卡的壓力下進行。
根據(jù)上文所述的方法，其中步驟c)和d)依次進行而無需回收對新戊?；?ferutiniiic (IV)。
將jaeschkenadiol用對新戊酰ltJ^苯甲酸酯化，在相同反應溶劑中用堿、 優(yōu)選伯胺、更優(yōu)選乙二胺處理，產(chǎn)生ferutinine純品。4艮據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu) 選實施方案，步驟c)和d)可方便地依次進行而無需回收中間體對新戊?；?ferutinine。
本發(fā)明的另 一個目的是ferutinine、對新戊?；鵩erutinine以及阿魏 (Fer"/fl印p)提取物、優(yōu)選大阿魏和赫蒙阿魏提取物的美容和皮膚病學用途。
當應用于皮膚時，ferutinine和阿魏(7^w/as/^)提取物令人驚訝地被證 明能夠增加膠原的生物合成，并且能夠起滋補、營養(yǎng)及保濕的作用，由此產(chǎn) 生緊致性(firmness)及彈性。此外，它們還可減少皮脂分泌，并且在控制多
毛癥和面部男性化方面發(fā)揮著顯著的作用。因此，含有ferutinine或阿魏
0Fw"to w/;)提取物的組合物在美容或皮膚病學領域中可用于治療淺表或深 皺紋或者其它不美觀的方面以及用于治療多種痤疳及皮脂溢形式。
Ferutinine及阿魏(/^w/fl印/;)提取物可以與常規(guī)賦形劑混合配制成乳奮 劑、凝膠劑及洗劑的形式，所述賦形劑例如^Remington，sPharmaceutical Sciences Handbook, XVII ed.， Mack出版社，N.Y" U.S.A.中所述的那些，優(yōu)選 在大豆卵磷脂或磷脂、例如月桂酰磷脂酰^A肉豆蔻酰磷脂酰^(它們 可摻入7jC/油和油/水型乳劑或者透皮硬骨劑中)的存在下配制。
以下實施例更為詳細地解釋了本發(fā)明。 實施例
實施例l -從赫蒙阿魏根中分離jaeschkenadiol
將250g研細的赫蒙阿魏根(粒徑分布2mm)用l升MeOH滲濾提取。用 溶劑浸漬兩天并滲濾后，重復操作(4xl升)，得到112.28曱醇提取物(45%)。 通過TLC(石油St/乙酸乙酯8/2, femtinineRf: 0.14)監(jiān)測藥物是否提取完 全。
將甲醇提取物用513mllO。/oKOH甲醇溶液回流。l小時后，TLC分析(石 油醚-乙酸乙酯8/2， ferutinine Rf: 0.14; Rf jaeschkenadiol: 0.31)表明>^應 完全。冷卻后，反應混合物用水(500ml)稀釋，用石油醚提取(4x500ml)。所 合并的石油醚相用鹽水洗滌，干燥，蒸發(fā)。所得的半晶質(zhì)殘余物用冷石油醚 (水箱溫度)洗滌，得到7.5gjaeschkenadiol結晶。母液通過色譜法(50g硅膠， 石油醚-乙酸乙酯95:5)純化，得到a-沒藥醇(870mg)、 a-沒藥醇與 j aesehkenadiol的混合物以;5Lj aeschkenadiol純品(結晶后得3.4g)。 jaeschkenadiol和a-沒藥醇的混合物用母液匯集，進行色譜法(50g硅膠，石油 醚-乙酸乙酯95:5)，得到l,95gjaeschkenadiol結晶(總產(chǎn)量12.85g， 5.1%),
該化合物具有以下理化性質(zhì)及光譜特性
IR光i昝(KBr， cm-1): 3339， 2965， 2卯5， 2875， 1470， 1375,1047， 968, 858 質(zhì)譜(C丄)
M++l-H20=221; M++12H2O=203
NMR光傳(300MHZ， CDC13) 5 : H9 5.43m， H2 3.9m， H14 1,78s， H15
1.00s, H12 0.95d J 4.98， H13 0.91d J 5.13。
實施例2 -從大阿魏根中分離jaeschkenadiol
將250g研細的大阿魏根(粒徑分布2mm)用l升MeOH滲濾提取。用溶 劑浸漬兩天并滲濾后，重復^Mt(4xl升)；曱醇提_取物濃縮至相當于研細根 的重量的體積，向拔^取物中加入10。/。KOH(10ml)。將堿性溶液回流2小時， 然后冷卻，用200ml正己烷反fe次。通過TLC(石油Si/乙酸乙酯8/2)監(jiān)測藥 物是否提取完全。
所合并的己烷相用鹽水洗滌，干燥，蒸發(fā)。所得的半晶質(zhì)殘余物用冷石 油醚(水箱溫度)洗滌，得到3.5gjaeschkenadiol結晶。才艮據(jù)實施例l將母液純 化。產(chǎn)量0.8gjaeschkenadio1，與實施例l的產(chǎn)物具有相同的理化性質(zhì)。
實施例3 -從大阿魏地上部分分離jaeschkenadiol
將lkg研細的大阿魏地上部分用二氧化碳于45"C;^245bar(即2.45《104 千帕斯卡)下在超臨界氣體萃取用裝置中提取。分離器內(nèi)(或多個分離器內(nèi)) 的溫度為25至45匸，壓力為約50bar(即5000千帕斯卡)。在這些條件下，膠 狀材料(使所需化合物回收困難)不^L提取.將僅含有親脂性化合物和水的殘 余物按照實施例1和2中所報道的方法用曱醇溶解并用堿處理，使 jaeschkenadiol酯水解。純化后，得到5.1g化合物純品，與實施例l的產(chǎn)物具 有相同特性。
實施例4-對新戊酰氧基苯甲酸的合成
將4-羥基苯甲酸(114.5g， 829mmol)在攪拌下溶解于吡咬(l.lS升)中，在水 浴上冷卻至T〈5。C 。向所得溶液中加入4-二曱氨基吡咬(DMAP， 0.3當量， 248.8mmo1，30.4g)及新戊酰氯(3當量,2.487mol，300g，293.6ml)。溶液溫熱至 室溫，在攪拌下放置2小時，然后加入水(2,29升)(放熱反應將溶液在冰浴 中冷卻)，在攪拌下另外放置3小時。
將溶液倒入分液漏斗中，用CH2C12 (3 x 750ml)萃取。所合并的二氯甲 烷相用2M H2S04 (4 x 750ml)和飽和NaCl溶液(1 x 1150ml)洗滌，然后經(jīng) Na2S04 (60g)干燥。
將溶液通過紙過濾器過濾，真空蒸發(fā)溶劑，得到殘余物，將該殘余物用 石油醚于30-50。研磨(3x400ml),抽濾，在靜態(tài)干燥器中于45。C真空干燥15 小時。得到130.5g具有以下光語特性的產(chǎn)物。
IR光i普(KBr， cm"): 3680， 2978， 2361， 1753， 1686， 1603， 1427， 1289， 1204， 1163,1103。
質(zhì)謙(C.I.): M++1-223
NMR光鐠(300MHZ， D誦DMSO) 5 H3=7 8.00 d J=8.48， H4=6 7.23 d J=8.55， CH3 1.34 s。
實施例S-由jaeschkenadiol合成femtinine
將jaeschkenadiol (lOOg， 419.5mmol)在攪拌下于室溫溶解于CH2Cl2 (600ml)中。向所得溶液中加入對新戊酰氧基苯甲酸(1.4當量，587.3mmo1， 130.5g)^J)MAP (0.3當量，125.9mmo1， 15.4g)。溶液在攪拌下放置10分鐘， 使試劑溶解完全，然后加入N,N，-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC， 1.8當量， 755.1mmo1， 155.8g)。 2小時后反應完全。
溶液濃縮至2體積(200ml),用5體積CH3CN(500ml)稀釋，然后濾除二環(huán) 己基脲沉淀，用另外5體積CH3CN(2x250ml)洗滌。將所合并的有擬目倒入 分液漏斗中，用10% w/v Na2C03 (2 x 250ml)和NaCl飽和溶液(1 x 250ml)萃 取，然后經(jīng)Na2SO4(100g)干燥。濾除Na2S04，溶劑真空蒸發(fā)，產(chǎn)生360g具 有以下光譜特性的化合物(IV):
3H N證(300 MHZ, CDC13》S 8.09 (在J=9.0 Hz， H3，-H5')， 7,20 (d， J=8,7 Hzs H2f-H6,)， 5,60 (brt,河.7 Hz, H9), 5,35 (td， J,.4-2.9 Hz, H6)， 2*58 (dd， J-13,i-m,9他》 H7b)， 2.34 (dd, 1-2.3 Hz, H7a)， 2.07 (m， HIO)， 2.04 (d， J=2.7 Ha H5)， 1.97 (d, J,.7 Hz， H2a), 1.89 (m， Hll), 1,86 (s, Hi4)， 1.63 (m， H2b)， 1,57 (m， H3a)， 1.41 (s， C(C,)， 1.30 (tn, H3b)， U4 (s， H15)' G.99沐=6,9 Hz， H12), (d,Hz， H13),
將化合物(IV)在攪拌下于室溫溶解于2升CH2Cl2中。向所得溶液中加入 乙二胺(10當量，280ml)。 3小時后反應完全。溶液冷卻至O'C，倒入分液漏斗
中，用0X:的3MH2SO4(2x750ml，放熱M)及飽和NaCl溶液(1 x 500ml)洗 滌。有^M目經(jīng)Na2SO4(100g)干燥，過濾，蒸發(fā)至干。將殘余物(230g)裝到用 5.8升己烷乙酸乙酯=9:1的混合物平衡的>^柱(2.51(§)上，用70升相同混合 物'決脫。匯集含有產(chǎn)物的級分，真空蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)物在靜態(tài)干燥器中于45t: 干燥24小時。
得到139g (92.4%)具有以下光譜特性的產(chǎn)物
IR光i普(KBr， cm1): 3410， 1686， 1655， 1608， 1593,1560， 1279， 1165， 1099
771。
質(zhì)謙(C丄)M++l-H20=341
NMR光i昝(200MHZ， CDC13): 5 H3，=7， 7.94 d J=8, 4，=6， 6.88 d J=8, H9 5.56 m， H2 5.23 dt J=ll， H14 1.80 brs, H15 1.10 s， H13 0.94 d J=6.5, H12 0.82d J=6.5。
實施例6-赫蒙阿魏提取物的制備
將lkg赫蒙阿魏整林植物用5體積丙酮提^3次。將所合并的丙酮提取物 濃縮至相當于開始生物量重量的0.5份，用2份水稀釋。在己烷的存在下，用 稀KOH在劇烈攪拌下調(diào)節(jié)水溶液pH至7.8。棄去己烷相，^M目酸化至pH5， 用正己烷反提。含有ferutinine的己烷相濃縮至干，產(chǎn)生"g含有約35。/。 ferutinine的提取物。
實施例7 -用于治療淺表皺紋的含有ferutinine的制劑 將ferutinine摻入具有以下組分的乳骨劑中
Ferutiniiic0.20g
卡波姆934 (卡波普934 P-Goodrich)0.60g
丙二醇3.00g
咪峻啉基脲0.30g
Kathon CG0.05g
EDTA二鈉0.10g
PEG-5大豆甾醇(Genero1122 E5-Henkel)2.00g
辛基十二烷醇(Eutanol G-Henkel)4.00g
麥芽油 4.00g
珪油350cps 0.50g
石更脂酸甘油酯(Cutine GMS-Henkel) 7.00g
聚山梨酯60 (Tween 60-ICI) 5.00g
生育酚 0.20g
抗壞血酸棕櫚酸酯 O.lOg
10% NaOH溶液 2.00g
香料(186909-Dragoco) 0.20g 純化水 至100.00g
實施例8 -含有赫蒙阿魏純提取物的制劑，所迷提取物含30。/。 ferutinine及 20% jaeschkenadiol苯甲酸酯
赫蒙阿魏提取物0.5g
卡波姆934 (卡波普934 P-Goodrich)0.60g
丙二醇
咪峻啉基脲0.30g
Kathon CG0.05g
EDTA二鈉O.lOg
PEG-5大豆甾醇(Generol 122 E5-Henkel)2.00g
辛基十二烷醇(Eutanol G-Henkel)4.00g
麥芽油4.00g
珪油350cps0.50g
硬脂酸甘油酯(Cutine GMS-Henkel)7.00g
聚山梨酯60 (Tween 60-ICI)5.00g
生育酚0.20g
抗壞血酸棕櫚酸酯O.lOg
10。/。NaOH溶液2.00g
香料(186909-Dragoco)0.20g
純化水至100.00g
實施例9-含有ferutiniiie的^J^劑
Ferutiiiine 0.30g
咪唑啉基脲 0.30g
尼泊金曱酯 0.20g
羥乙基纖維素(Natrosol 250 HHX-Aqualon) 2.00g
純化水 至100ml
實施例10-含有阿魏0Fww/" w/;)提取物的美容制劑
赫蒙阿魏提取物 0.5g
。米唑啉基脲 0.30g
尼泊金甲酯 0.20g
羥乙基纖維素(Natrosol 250 HHX-Aqualon) 2.00g
純化水 至100ml
實驗
產(chǎn)品效能
在對40名年齡為39至56歲的女性志愿者進行的雙盲研究中評價對皮膚 彈性和緊致性以及對皺紋測定法(rugometry)的作用，測定了實施例7的乳青 劑的效能。研究之前進行7天調(diào)節(jié)期，在此期間受試者必須戒絕使用保濕產(chǎn) 品、防曬霜及液體化妝品，并避免曬黑處理及過度暴露在紫外線中。
受試者允許使用常規(guī)的眼部*部護理產(chǎn)品、搽臉粉和非保濕皂。
將受試者隨機分成兩組， 一組用安慰乳骨劑處理，另一組用實施例7的 乳骨劑處理。乳骨劑以標準量(O.Sg,即從管中擠出0，5cm乳骨)涂于面部，一 曰兩次，早晚各一次。治療前及治療五周后進行以下測量。
在每個測量期之前，所有受試者在23C及相對濕度50。/。的氣候室中停留 30分鐘。每一期包括在下述指定的皮膚區(qū)域用角質(zhì)層測定儀(corneometer) 測量三次、用膚質(zhì)測定儀(cutometer)測量三次以及眶周區(qū)的硅印模(silicon impression),
所有40名受試者均完成了研究。
膚質(zhì)測定法(Cutometrv)
膚質(zhì)測定儀是用于以非損傷方式測量皮膚機喊性能的市售裝置 (Cutometer SEM 575， Courage & Khazaka，德國)。更為詳細地說，它測量 皮膚表面在通it2mm開口的探針受到500mmHg的負壓時的垂直形變。透入 探針中的皮膚長度以0.01mm的精度進行目測。探針與計算^M目連，計算機 記錄皮膚隨時間的形變。從所得曲線可外推出多個變量來評價皮膚的彈性、 粘彈性及粘性行為。
記錄以下M: 即時膨脹(Ue)，在0.1秒時測量； 延遲膨脹(Uv);
最終膨脹(Uf)，在10秒時測量；以及 即時縮回(Ur)。
試驗使用皮膚測定儀在兩頰進行。
在安慰劑組中未觀察到顯著變化。處理5周后，治療組的延遲膨脹(U" 顯著降低(16。/。,p0.05)。該^L良映了皮膚的粘彈性能和真皮行為。5周后 i^見察到Ue的顯著變化(-12。/0, p<0.05)， Ue主要受角質(zhì)層的水合性能及^M^ 性能的影響。Uv和Ue的降低以及Ur的穩(wěn)定表明皮膚的緊致性增加。 角質(zhì)層測定法(Corneometry)
柔軟光滑的皮膚外觀主要取決于角質(zhì)層中存在有充足量的水分。
角質(zhì)層測定儀是測量由皮膚水合變化引起的電容變化的市售裝置 (Cor歸meter CM 825 Combi 3, Courage & Khazaka，德國)。
試驗使用角質(zhì)層測定儀在兩頰進行。
5周后，在治療組中觀察到顯著變化，具體而言，皮膚水合增加l7.5。/0, 而在安慰劑組中水合降4氐3% 。 鈹玟測定法(Ru2ometry)
硅印模在處于坐姿的受試者中進行。在開始時以^5周后，采用"Silflo 硅印模材料，，(從Flexico，UK可得)獲得印模(2 x 5cm)。
然后用采用Quantirides-Monaderm軟件的皮膚圖像分析儀系統(tǒng)(Skin Image Analyzer System)分析印模，該系統(tǒng)可將皮膚樣沐伏與中等皺紋及深
皺紋區(qū)別開，并計算它們的數(shù)量和深度；最終，獲得皺紋的總面積值。 5周后，在治療組中觀察到顯著變化。具體而言，觀察到皺紋面積減少
21.3% (p<0.05)，而在安慰劑組中則減少0.4%。
已經(jīng)觀察到，主要是中等及深皺紋的數(shù)量和深度在統(tǒng)計學上顯著減少。
結論
該研究可作出如下結論實施例7的乳骨劑在治療有時間跡象及光老化 跡象的皮膚中具有良好的美容活性，因為它可增加皮膚的緊致性和水合作 用，并可減小平均皺紋面積，特別是深的微小皺紋和大皺紋部位。皮膚明顯 變得更緊致和更光滑。
權利要求
1.阿魏(Ferula spp)提取物在制備美容和/或皮膚病學組合物中的用途。
2. ferutinine在制備美容和/或皮膚病學組合物中的用途。
3. 對新戊酰氧基ferutinine在制備美容和/或皮膚病學組合物中的用
全文摘要
本發(fā)明涉及從阿魏(Ferula spp)提取物中制備ferutinine(Ia)的方法，該方法包括提取物的堿水解和用對新戊酰氧基苯甲酸進行的處理。本發(fā)明還涉及提取物和ferutinine在美容及皮膚病學領域中的用途。
文檔編號A61Q19/08GK101371818SQ20081014891
公開日2009年2月25日 申請日期2004年3月23日 優(yōu)先權日2003年4月4日
發(fā)明者A·克里斯托尼, E·梅爾卡利, E·邦巴爾代利, G·豐塔納 申請人:因德納有限公司