Artalbic acid衍生物的組合物用于制備抗肝纖維化藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學領域。本發(fā)明公開并提供了一種由Artalbic acid的O?(苯并咪唑基)乙基與O?(二羥乙胺基)乙基衍生物按照質量比為25：75組成的組合物以及將上述化合物按照25：75的質量比進行混合從而制備本發(fā)明組合物的方法。藥理學實驗表明，本發(fā)明提供的這種組合物在20 ug/ml時能夠顯著抑制NIH/3T3增殖以及轉化生長因子?β1誘導的成纖維細胞增殖，具有抗肝纖維化的作用，因此本發(fā)明還提供了Artalbic acid的O?(苯并咪唑基)乙基與O?(二羥乙胺基)乙基衍生物按照質量比為25：75組成的組合物在制備抗肝纖維化藥物中的用途。
【專利說明】
Arta I b i c ac i d衍生物的組合物用于制備抗肝纖維化藥物
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及有機合成和藥物化學領域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
【背景技術】
[0002] 肝纖維化是慢性肝損傷向肝硬化發(fā)展的動態(tài)過程，表現(xiàn)為細胞外基質(ECM)大量 合成、分泌，而降解絕對或相對不足，使ECM在肝臟內彌漫沉積。其起始于肝細胞(HC)壞死， 隨之是炎癥反應、纖維生成介質釋放，肝星狀細胞(FSC)激活，最終以肝臟結締組織成分的 合成與降解明顯失去平衡。肝纖維化是多種慢性肝病共同的病理過程，是影響預后的重要 因素。
[0003] 過去的20年間，肝纖維化的研究取得了長足進展，證實肝纖維化與一定程度的肝 硬化都是可逆的。近年來陸續(xù)出現(xiàn)了一些抗肝纖維化治療方法，包括化學藥、生物制劑、中 藥與基因療法等，但是理想的臨床治療手段仍然缺乏(劉平.加強抗肝纖維化作用機制的研 究.中華肝病雜志，2005，8(13): 561)。目前防治肝纖維的關鍵是針對與肝星狀細胞激活相 關的環(huán)節(jié)，主要是:減輕肝損傷;抑制星狀細胞激活，減少細胞外基質產(chǎn)生;調節(jié)細胞因子紊 亂，促進活化肝星狀細胞凋亡；抑制肝臟成纖維細胞的增殖以及星狀細胞激活大量分泌誘 導肝臟成纖維細胞的增殖。
[0004] 從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導化合物并進行結構修飾獲得其衍生物，從而得到 高效低毒的潛在藥物最有重要價值。
[0005] 本發(fā)明涉及的化合物I是一個2011年發(fā)表（Antonella Maggio et al .， 2011.Artalbic acid,a sesquiterpene with an unusual skeleton from Artemisia alba(Asteraceae)from Sicily·Tetrahedron Letters,52(2011 )4543-4545)的化合物，我 們對化合物I進行了結構修飾，獲得了兩個新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合 物III和化合物IV制備了組合物并對該組合物抗肝纖維化活性進行了評價，其具有抗肝纖 維化活性。
[0006] 由于肝臟星狀細胞的激活，從而引起了多種生長因子的大量分泌，這些生長因子 會誘導肝臟成纖維細胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長因子之一就是 TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細胞增殖的 藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長因子誘導的成纖維細胞的增殖，篩選常常在成纖維細胞 上進行，NIH/3T3細胞是最常用的細胞株。

【發(fā)明內容】

[0007] 本發(fā)明公開了一個新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物 中化合物III和化合物IV的質量百分數(shù)分別為25%和75%。
[0008]
[0009] 本發(fā)明公開的組合物可以制成藥學上可接受的鹽或藥學上可接受的載體。
[0010] 藥效學實驗表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗肝纖維化作用。本發(fā)明的藥學上 可接受的鹽具有同樣的藥效。
[0011] 進一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抗成纖維細胞增殖的活性， 因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型抗肝纖維化藥物。
[0012] 進一步的，組合物的體外實驗表明，組合物具有很強的抗生長因子誘導的成纖維 細胞增殖的活性，組合物是一個極具開發(fā)潛力的化合物，它可直接用于相應疾病的治療以 及相關藥物的制備。
[0013] 以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實 施例的任何限制，而是由權利要求加以限定。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1化合物Artalbic acid的制備
[0015] 化合物Artalbic acid(I)的制備方法參照Antonella Maggio等人發(fā)表的文獻 (Antonella Maggio et al.,2011.Artalbic acid,a sesquiterpene with an unusual skeleton from Artemisia alba(Asteraceae)from Sicily. Tetrahedron Letters ,52 (2011 )4543-4545)的方法。
[0016]
[0017] 實施例2 Artalbic acid的0-溴乙基衍生物（II)的合成
[0018] 將化合物I (266mg，l. OOmmol)溶于IOmL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨（TBAB) (0.088)，1，2-二溴乙燒(3.76(^，20.00_〇1)和61]1]^的50%氫氧化鈉溶液。混合物在40攝氏 度攪拌iehieh之后將反應液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機相溶液。然 后對有機相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌5次，再用無水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除 溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮= 100:1.0，v/V)， 收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(272mg，73% )。
[0019] 1H NMR(500MHz,DMS0-d6)5ll.41(s,lH),6.06(s,lH),5.76(s,lH),4.99(s,lH), 4.71(s,1H),4.56(s,1H),3.86(s,2H),3.54(s,2H),2.65(s,1H),2.43(s,2H),2.33(s,2H), 2.10(s,lH),1.64(s,3H),1.54(s,lH),1.44(s,2H),0.95(s,3H).
[0020] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)S201.95(s),175.93(s),149.13(s),148.15(s),117.05 (s),109.43(s),81.86(s),70.27(s),57.68(s),41.26(s),39.07(s),38.86(s),35.69(s), 33.36(s),30.72(s),20.44(s),18.42(s).
[0021] HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for Ci7H26BrO4:373.1014；found 373.1017.
[0022]
[0023] 實施例3 Artalbic acid的0_(苯并咪唑基）乙基衍生物（III)的合成
[0024] 將化合物II(187mg，0.5mmoI)溶于20mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(345mg， 2 · 5mmol)，碘化鉀(84mg，0 · 5mmol)和苯并咪唑（1180mg，IOmmol)，混合物加熱回流2h。反應 結束后將反應液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機相。依次用水和飽和食鹽 水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮=100: l.〇，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃 縮即得到化合物III的棕色固體(80.0 mg，39% )。
[0025] 1H MMR(500MHz，DMS0-d6)Sl6.65(s，lH)，8.22(s，lH)，7.61(d，J = 25.0Hz，2H)， 7.25(s，1H)，7.16(s，1H)，6.05(s，1H)，5.76(s，1H)，4.90(s，1H)，4.67(s，1H)，4.58(s，1H)， 4.12(s，1H)，4.00(s，1H)，3.85(s，2H)，2.63(s，1H)，2.43(s，2H)，2.35(s，2H)，1.95(s，1H)， 1.61(s，3H)，1.52(s，2H)，1.37(s，lH)，0.94(s，3H).
[0026] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)5201.70(s),175.59(s),149.00(s),147.93(s),146.20 (s),139.75(s),133.40(s),123.95(s),123.48(s),118.46(s),116.84(s),110.97(s), 109.08(s),81,62(s),67.86(s),57.36(s),44.96(s),41.15(s),38.72(s) ,38.62(s), 35.56(s),30.41(s),20.19(s),18.28(s).
[0027] HRMS(ESI) :m/z[M+H]+calcd for C24H3IN2O4^ll .2284；found:411.2281 〇
[0028]
[0029] 實施例4 Artalbic acid的0-(二輕乙胺基）乙基衍生物的合成
[0030] 將化合物II(187mg，0.5mmol)溶于20mL乙腈當中，向其中加入無水碳酸鉀(690mg， 5.0_31)，碘化鉀（25211^，1.5_31)和二乙醇胺（105111^，10_31)，混合物加熱回流111。反應 結束后將反應液倒入20mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有機相。依次用水和飽和 食鹽水洗滌合并之后的有機相，再用無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn) 物粗品用硅膠柱層析純化(流動相為:石油醚/丙酮= 100: l.〇，v/v)，收集黃色集中洗脫帶 并揮去溶劑即得到化合物IV的淡黃色固體(146.9mg，74% )。
[0031] 1H NMR(500MHz，DMS0-d6)Sl8.72(s，lH)，S6.11(s，lH)，5.80(s，lH)，5.14(s，lH)， 4.73(s,lH),4.63(s,lH),3.57(s,2H),3.45(s,4H),2.70(d,J=15.6Hz,3H), 2.60(s,4H), 2.50(s,2H),2.46(s,2H),2.33(s,lH),1.88(s,2H),1.68(s,3H),1.62(d,J=19.9Hz,3H), 1.02(s,3H).
[0032] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)5202.01(s),176.11(s),149.21(s),148.55(s),117.15 (s),109.60(s),81.93(s),67.25(s),59.28(s),57.88(s),56.83(s),53.74(s),41.36(s), 39.24(s),38.93(s),35.88(s),30.82(s),20.61(s),18.49(s).
[0033] HRMS(ESI) :m/z[M+H].calcd for C2iH36Ni〇6:398.2543;found:398.2547〇
[0034]
[0035] 實施例5組合物抗肝纖維化活性
[0036] 由于肝臟星狀細胞的激活，從而引起了多種生長因子的大量分泌，這些生長因子 會誘導肝臟成纖維細胞的快速增殖，從而加速纖維化，其中最重要的生長因子之一就是 TGF。因此，篩選抗肝纖維化藥物的一個重要思路就是篩選能夠抑制肝臟成纖維細胞增殖的 藥物或者篩選能夠抑制TGF等生長因子誘導的成纖維細胞的增殖，篩選常常在成纖維細胞 上進行，NIH/3T3細胞是最常用的細胞株。
[0037] 組合物的制備：將研磨之后過200目網(wǎng)的25mg化合物III的粉末和研磨之后過200 目網(wǎng)的75mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到IOOmg組合物， 使用時用水溶解這IOOmg的組合物即得到組合物的溶液。
[0038]實驗例1:組合物對成纖維細胞NIH/3T3增殖的抑制作用 [0039] 一、實驗方法：
[0040] NIH/3T3細胞株購自引自ATCC(American Type Culture Collection)的中科院上 海細胞所細胞庫。
[0041 ] 將對數(shù)生長期的亞融合的NIH/3T3細胞用0.25 %胰酶消化，洗滌，離心后，用DMEM 培養(yǎng)液(含10%FCS)制成IX 104cell/ml的細胞懸液，臺盼藍染色鑒定存活率大于95%，按 每孔IOOul加入96孔板中，在37°C、5 %⑶2培養(yǎng)24h同步處理后，棄上清，加入含有藥物的 DMEM培養(yǎng)液（含10%FCS)200ul，培養(yǎng)48h，每孔加入MTT溶液孵育4h。棄去培養(yǎng)液，加入 150ulDMS0，振蕩10分鐘，使結晶溶解，酶標儀490nm處讀取OD值，結果以0D49Q表示。
[0042] 二、實驗結果：
[0043] 1、形態(tài)學觀察
[0044] NIH/3T3在用藥前伸展良好，折光性較弱，有方向性，呈放射狀，細胞增殖的速度 快;而加組合物24h后，成纖維細胞數(shù)目減少，形狀變得不規(guī)則，突起變短，細胞排列混亂，細 胞內代謝產(chǎn)物增多?；衔颕II和化合物IV無此作用。
[0045] MTT法檢測組合物對NIH/3T3細胞增殖的抑制作用。
[0046] 表1 :MTT法檢測組合物對NIH/3T3增殖的抑制作用
[0048] 注:*，與細胞陰性對照P〈0.05
[0049] 結果:組合物在20ug/ml對成纖維細胞NIH/3T3的細胞增殖有顯著的抑制作用。表 明組合物體外對成纖維細胞的增殖有顯著抑制作用?；衔颕II和化合物IV無此作用。
[0050] 實驗例2:組合物對轉化生長因子-MTGF-fo)誘導的成纖維細胞增殖的抑制作用 [00511 TGFj1是促進細胞增殖和膠原生成的強活性因子，在細胞中加入TGF-β dOng/ml 刺激細胞增殖，再檢測藥物對TGF-m誘導的細胞增殖的抑制作用，以分析判斷組合物的作 用機理。
[0052] 表2 :MTT法檢測組合物對TGF誘導NIH/3T3增殖的抑制作用
[0054] 注:*，與細胞+TGF 對照Ρ〈0·05
[0055] 結果：組合物在20ug/ml對成纖維細胞ΝΙΗ/3Τ3在TGF-fo的誘導下的細胞增殖有顯 著的抑制作用，化合物III和化合物IV無此作用。表明組合物體外對纖維細胞增殖的抑制作 用可能是通過干預TGF信號通路實現(xiàn)的。
[0056] 結論:組合物對成纖維細胞NIH/3T3在10%小牛血清的刺激下的細胞增殖有顯著 的抑制作用；組合物對成纖維細胞NIH/3T3在TGF-fo的誘導下的細胞增殖有顯著的抑制作 用。組合物可以用來制備抗肝纖維化藥物?；衔颕II和化合物IV對成纖維細胞NIH/3T3在 10%小牛血清的刺激下的細胞增殖無顯著的抑制作用，對成纖維細胞NIH/3T3在TGF-仏的 誘導下的細胞增殖無顯著的抑制作用，不可以用來制備抗肝纖維化藥物。
[0057]實施例6本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
[0058] 取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機制成100片。
[0059] 實施例7本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
[0060] 取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。
【主權項】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物HI和化合物IV組成，該組合物中化合物 III和化合物IV的質量百分數(shù)分別為25%和75%，2. 如權利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為:將化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照質量百分數(shù)分別為25%和75%充分混合。3. -種如權利要求1所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應用。4. 如權利要求3所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應用，其特征為所述組合物抑 制成纖維細胞增殖。5. 如權利要求3所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應用，其特征為所述組合物抑 制生長因子誘導的成纖維細胞增殖。6. 如權利要求5所述的組合物在治療肝纖維化藥物中的應用，其特征為所述生長因子 為TGF-化。
【文檔編號】A61K31/4184GK106074521SQ201610405037
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】丁秋菊
【申請人】南京海澳斯生物醫(yī)藥科技有限公司