板栗花活性提取物及其制備方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種板栗花活性提取物及其制備方法和應用，其包括：將板栗花粉末分散于體積分數(shù)為45?55％的醇溶液中，所述板栗花粉末與所述醇溶液的料液比為1：80?90，然后于330?370W的功率下微波提取15?25min，過濾后除去濾液中的溶劑，得粗提物浸膏。將所述粗提物浸膏用水溶解得到粗提液，然后用乙酸乙酯對所述粗提液進行萃取，得到乙酸乙酯萃取物。采用吸附色譜法和凝膠色譜法對所述乙酸乙酯萃取物進行精制，分離純化得板栗花活性提取物。通過這種方法制備的板栗花活性提取物具有很強的抑菌活性，對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌和屎腸球菌均有很好的抑菌作用。
【專利說明】
板栗花活性提取物及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及天然藥物化學領域，具體而言，設及一種板栗花活性提取物及其制備 方法和應用。
【背景技術】
[0002] 板栗花為殼斗科(i^igaceae)栗屬（Castanea)植物板栗(Castanea mollissima)的 雄性柔美花序。板栗性溫，味甘平，入脾、胃、腎經，有補腎、健脾等功效。據(jù)《中藥大辭典》記 載，板栗花具有治療便血、瀉頻、療痛、大腸下血、小兒消化不良及腹瀉、日久赤白頻疾等功 效。研究發(fā)現(xiàn)頻疾的病理原因主要有:細菌感染、原蟲與寄生蟲感染、病毒感染、真菌感染和 食物中毒等。
[0003] 板栗花治療頻疾的功效在民間被廣泛應用。目前國內外學者對板栗花的化學成分 及其應用研究取得了一定進展，但還需要系統(tǒng)深入研究黃酬類和多酪類物質的結構和活 性。板栗花資源豐富，但長期W來一直未能充分開發(fā)利用。

【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種板栗花活性提取物。運種板栗花的活性提取物中 的主要活性成分是齊墳果酸和烏蘇酸，運種板栗花的活性提取物對多種細菌均有很好的抑 菌作用，如對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、和尿腸球菌均有很強的抑菌作用。運種板栗 花活性提取物來自天然植物，毒副作用小，能夠廣泛應用于各種抗菌劑中。
[0005] 本發(fā)明的第二目的在于提供一種所述的板栗花活性提取物的制備方法。運種方法 操作簡單，易于實現(xiàn)，且制得的板栗花活性提取物中有效活性成分的含量大、純度高、且抗 菌作用強。
[0006] 本發(fā)明的第Ξ目的在于提供一種板栗花活性提取物的應用，即將板栗花活性提取 物作為活性成分應用于抗菌劑中。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用W下技術方案：
[000引將板栗花粉末分散于體積分數(shù)為45-55%的醇溶液中，板栗花粉末與醇溶液的料 液比為1:80-90,然后于330-370W的功率下微波提取15-25min，過濾后除去濾液中的溶劑， 得粗提物浸膏；
[0009] 將粗提物浸膏用水溶解得到粗提液，然后用乙酸乙醋對粗提液進行萃取，其中乙 酸乙醋與粗提液的體積比為0.5-2:1,得到乙酸乙醋萃取物；
[0010] 采用吸附色譜法和凝膠色譜法對乙酸乙醋萃取物進行精制，分離純化得板栗花活 性提取物。
[0011] -種由上述制備方法制得的板栗花活性提取物。
[0012] 上述方法制備的板栗花活性提取物在制備抑制尿腸球菌的抗菌劑中的應用。
[0013] 板栗花，為殼斗科植物板栗的花。中醫(yī)認為，板栗花性味微溫、微苦、澀，有健脾止 泄、散結消腫之功，適用于瀉頻、便血等。本發(fā)明W燕山板栗主產區(qū)的板栗花為實驗原材料， 提取分離板栗花中的活性物質，并進行結構表征和抑菌活性研究。。
[0014] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0015] (1)采用微波提取法對板栗花進行粗提取，運種提取方法的好處在于，微波提取時 的溫度低，避免板栗花中的熱敏性的活性化合物結構被破壞，從而使得到的板栗花活性提 取物的產率高、且抑菌活性強。
[0016] (2)由于粗提物浸膏中的活性成分易溶于乙酸乙醋，根據(jù)相似相容原理，采用乙酸 乙醋對板栗花的粗提物浸膏進行萃取，活性成分在溶于乙酸乙醋的同時，與粗提物浸膏中 極性過大或者極性很小的雜質分離，使板栗花的乙酸乙醋萃取物中的雜質減少，從而降低 后續(xù)柱分離純化時的難度。
[0017] (3)采用吸附色譜法和凝膠色譜法對乙酸乙醋萃取物進行精制，去除乙酸乙醋萃 取物中絕大部分的雜質，最后得到的板栗花活性提取物中含有的主要活性成分為齊墳果酸 和烏蘇酸，板栗花活性提取物中齊墳果酸和烏蘇酸的質量占板栗花活性提取物總量的90% 社。
[001引（4)通過運種方法制備的板栗花活性提取物具有很強的抑菌活性，對表皮葡萄球 菌、金黃色葡萄球菌和尿腸球菌均有很好的抑菌作用。運種板栗花活性提取物來自天然植 物，毒副作用小，能夠廣泛應用于各種抗菌劑中，也可W應用于各種洗護用品中，比如空氣 清新劑、花露水或者洗手液等。。
【附圖說明】
[0019] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，W下將對實施例或現(xiàn) 有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0020] 圖1為板栗花活性提取物的質譜圖；
[0021 ]圖2為板栗花活性提取物的紅外色譜圖。
【具體實施方式】
[0022] 下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會 理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體 條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為 可W通過市售購買獲得的常規(guī)產品。
[0023] 本實施例提供一種板栗花活性提取物的制備方法，其包括：
[0024] a.提取步驟:將板栗花粉末分散于體積分數(shù)為45-55%的醇溶液中，板栗花粉末與 醇溶液的料液比為1:80-90，然后于330-370胖的功率下微波提取15-25111111，過濾后除去濾液 中的溶劑，得粗提物浸膏。
[0025] 采用微波提取法對板栗花進行粗提取，運種提取方法的好處在于，微波提取時的 溫度低，避免板栗花中的熱敏性的活性化合物結構被破壞，從而得到的板栗花活性提取物 中有效成分的含量高、純度大。
[00%]上述板栗花粉末為新鮮板栗花于30-40°C下干燥至恒重、并粉碎至40-80目后所 得。板栗花在30-40°C下干燥，優(yōu)選為23-28°C，最優(yōu)為35°C，運種方法有利于保護板栗花中 的活性成分不被高溫破壞。進一步優(yōu)選的，新鮮板栗花為采自盛花期的板栗花。采自盛花期 的板栗花中的有效成分的含量高，從而提高板栗花粗體物中有效成分的含量。板栗花粉末 的粒度在40-80目的范圍內，優(yōu)選為50-70目，最優(yōu)為60目，在運個粒度范圍內進行超聲波提 取時有效物質的溶出率大，同時又能避免板栗花中的較質等雜質成分溶出。
[0027] 進一步的，在本發(fā)明較佳的實施例中，為了增大板栗花中活性成分的提取率，上述 體積分數(shù)為45-55 %的醇溶液為45-55 %的乙醇溶液，進一步優(yōu)選為48-53 %，最優(yōu)選的為 51%。45-55%的乙醇溶液的極性適中，板栗花中的絕大部分有效成分易溶于該溶液中。
[0028] 進一步的，在本發(fā)明較佳的實施例中，為了增大板栗花中活性成分的提取率，且避 免活性成分被破壞，板栗花粉末與醇溶液的料液比為1:80-90，優(yōu)選為1:83-88，最優(yōu)選為1: 85;然后于330-370W的功率下微波提取15-25min。微波提取的功率優(yōu)選為340-360W，進一步 優(yōu)選為355W。功率太小，微波的能量不足W破壞植物細胞壁，從而使得有效物質的溶出率 底;功率過大，會使得植物細胞中的較質、油脂等雜質過多的溶出，使后續(xù)的分離純化步驟 難度增大。
[0029] 微波提取的時間優(yōu)選為18-22min，進一步優(yōu)選為20min。微波時間過短，有效成分 難W溶出，微波時間過長，也會使更多的雜質成分被提取出來。
[0030] b.萃取步驟:將粗提物浸膏用水溶解得到粗提液，然后用乙酸乙醋對粗提液進行 萃取，其中乙酸乙醋與粗提液的體積比為0.5-2:1,得到乙酸乙醋萃取物。
[0031] 由于粗提物浸膏中的活性成分易溶于乙酸乙醋，根據(jù)相似相容原理，采用乙酸乙 醋對板栗花的粗提物浸膏進行萃取，活性成分在溶于乙酸乙醋的同時，與粗提物浸膏中極 性過大或者極性很小的雜質分離，從而使乙酸乙醋萃取物的純度得到進一步的提高。
[0032] 在本發(fā)明較佳的實施例中，上述粗提液用乙酸乙醋萃取后，分離出有機相，隨后將 有機相在溫度為30-40°C的水浴、轉速為80-100轉/min、W及真空度為0.07-0.09Mh的條件 下旋轉蒸發(fā)，除去有機相中的乙酸乙醋，得到粉末狀的乙酸乙醋萃取物。
[0033] 在運種條件下對在有機相中的乙酸乙醋萃取物進行減壓濃縮，有利于在回收溶劑 時保護板栗花中的活性成分的結構不被破壞，從而得到抑菌活性很強的板栗花活性提取 物。減壓濃縮的條件進一步優(yōu)選為，水浴溫度為33-38Γ、轉速為85-95轉/min、W及真空度 為0.07-0.08MPa;進一步優(yōu)選的，水浴溫度為35°C、轉速為90轉/min、W及真空度為 0.075MPa，在運種減壓濃縮的條件下，活性提取物的活性W及產率最大。
[0034] 在本發(fā)明較佳的實施例中，上述粗提液在用乙酸乙醋萃取之前，先依次用石油酸 和氯仿進行萃取W除去粗提液中的雜質。依次用石油酸和氯仿萃取，能夠除去易溶于石油 酸和氯仿中的雜質，從而使乙酸乙醋提取物中雜質的含量減小。其中，石油酸和氯仿與粗提 液的體積比均為0.5-2:1，有利于提局萃取效率。
[0035] 在本發(fā)明較佳的實施例中，上述用乙酸乙醋萃取粗提液時，萃取3次，合并3次萃取 后所得的有機相，得到乙酸乙醋萃取物。萃取3次，有利于提高乙酸乙醋萃取物中活性成分 的含量。
[0036] C.純化步驟:采用吸附色譜法和凝膠色譜法對乙酸乙醋萃取物進行精制，分離純 化得板栗花活性提取物。
[0037] 根據(jù)對各類有機溶劑萃取后的萃取物進行抑菌活性跟蹤發(fā)現(xiàn)，乙酸乙醋萃取物對 試驗菌的抑菌活性最大，其中試驗菌為表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、和尿腸球菌。因此， 直接對乙酸乙醋萃取物進行吸附色譜分離，有利于減少工序、降低時間和經濟成本，在短時 間內即可得到抑菌活性強的活性提取物。然后用凝膠色譜對上述活性提取物進一步進行精 審IJ，W得到活性組分的純度更高的板栗花活性提取物。
[0038] 在本發(fā)明的一些優(yōu)選的實施例中，該吸附色譜法為大孔樹脂色譜法和硅膠柱色譜 法。其中，利用大孔樹脂色譜對乙酸乙醋粗取物進行粗分，隨后再用硅膠柱色譜對其進行精 審IJ。運種吸附色譜的分離效果好，能夠對板栗花中的化學組分進行更進一步的分離純化，W 獲得抑菌活性更強的組合物。進一步優(yōu)選的，色譜柱中裝有的硅膠與乙酸乙醋萃取物的干 重之間的重量比為40-50:1，在運個比例范圍內，能夠明顯提高硅膠柱的柱效，能夠在縮短 分離時間、節(jié)省洗脫劑用量的同時提高分離效果。
[0039] 進一步的，在本發(fā)明較佳的實施例中，吸附色譜法為大孔樹脂色譜法和硅膠柱色 譜法。大孔樹脂色譜法采用AB-8型大孔樹脂對乙酸乙醋萃取物進行柱分離，并采用不同體 積分數(shù)的乙醇溶液進行梯度洗脫，隨后將體積分數(shù)為80-90 %的乙醇溶液洗脫下的饋分作 為樣品I過硅膠色譜柱，采用石油酸-乙酸乙醋混合溶液梯度洗脫后，再用二氯甲燒-甲醇混 合溶液梯度洗脫，得到樣品II，最后再將樣品II過凝膠色譜柱，采用體積比為1.5-2.5:1的 二氯甲燒-甲醇溶液進行等度洗脫，得到板栗花活性提取物。
[0040] 采用上述方法得到的板栗花活性提取物中齊墳果酸和烏蘇酸的含量高、純度大。 經HPLC分析，該板栗花活性提取物中齊墳果酸和烏蘇酸的質量是板栗花活性提取物總量的 90%。
[0041] 本發(fā)明還提供一種采用上述方法制備的板栗花活性提取物，W及上述制備的板栗 花活性提取物在抗菌劑中的應用。更進一步的，板栗花活性提取物的最低抑菌濃度為16yg/ ml。在本發(fā)明較佳的實施例中，板栗花活性提取物在制備抑制尿腸球菌的抗菌劑中的應用。
[0042] 通過運種方法制備的板栗花活性提取物具有很強的抑菌活性，對表皮葡萄球菌、 金黃色葡萄球菌、和尿腸球菌均有很好的抑菌作用。運種板栗花活性提取物來自天然植物， 毒副作用小，能夠廣泛應用于各種抗菌劑中，也可W應用于各種洗護用品中，比如空氣清新 劑、花露水或者洗手液等。
[0043] 實施例1
[0044] 本實施例提供一種板栗花活性提取物的制備方法，其包括：
[0045] 預處理步驟:將新鮮板栗花于30°C下干燥至恒重后，粉碎至40目，得到板栗花粉 〇
[0046] 提取步驟:將板栗花粉末分散于體積分數(shù)為55%的乙醇溶液中，板栗花粉末與乙 醇溶液的料液比為1:90,然后于330W的功率下微波提取15min，過濾后除去濾液中的溶劑， 得粗提物浸膏。
[0047] 萃取步驟:將粗提物浸膏用水溶解得到粗提液，然后用乙酸乙醋對粗提液進行萃 取，其中乙酸乙醋與粗提液的體積比為0.5:1，萃取3次，合并3次萃取后所得的有機相，減壓 濃縮后得到板栗花乙酸乙醋萃取物。
[0048] 純化步驟:將乙酸乙醋萃取物過大孔樹脂柱進行純化，大孔樹脂采用AB-8型大孔 樹脂對乙酸乙醋萃取物進行柱分離，并采用不同體積分數(shù)的乙醇溶液進行梯度洗脫，隨后 將體積分數(shù)為90%的乙醇溶液洗脫下的饋分作為樣品I過硅膠色譜柱，采用干法上樣，其 中，色譜柱中裝有的硅膠與樣品的干重之間的重量比為40:1，采用石油酸-乙酸乙醋混合溶 液梯度洗脫后，再用二氯甲燒-甲醇混合溶液梯度洗脫，得到樣品II，最后再將樣品II過凝 膠色譜柱，采用體積比為1.5:1的二氯甲燒-甲醇溶液進行等度洗脫，得到板栗花活性提取 物。
[0049] 實施例2
[0050] 本實施例提供一種板栗花活性提取物的制備方法，其包括：
[0051] 預處理步驟:將盛花期采集的新鮮板栗花于35°C下干燥至恒重后，粉碎至60目，得 到板栗花粉末。
[0052] 提取步驟:將板栗花粉末分散于體積分數(shù)為51%的乙醇溶液中，板栗花粉末與乙 醇溶液的料液比為1:85,然后于35抓的功率下微波提取20min，過濾后除去濾液中的溶劑， 得粗提物浸膏。
[0053] 萃取步驟:將粗提物浸膏用水溶解得到粗提液，然后用乙酸乙醋對粗提液進行萃 取，其中乙酸乙醋與粗提液的體積比為1:1，萃取3次，合并3次萃取后所得的有機相，減壓濃 縮后得到板栗花乙酸乙醋萃取物。
[0054] 純化步驟:將乙酸乙醋萃取物過大孔樹脂柱進行純化，大孔樹脂采用AB-8型大孔 樹脂對乙酸乙醋萃取物進行柱分離，并采用不同體積分數(shù)的乙醇溶液進行梯度洗脫，隨后 將體積分數(shù)為85%的乙醇溶液洗脫下的饋分作為樣品I過硅膠色譜柱，采用干法上樣，其 中，色譜柱中裝有的硅膠與樣品的干重之間的重量比為45:1，采用石油酸-乙酸乙醋混合溶 液梯度洗脫后，再用二氯甲燒-甲醇混合溶液梯度洗脫，得到樣品II，最后再將樣品II過凝 膠色譜柱，采用體積比為2:1的二氯甲燒-甲醇溶液進行等度洗脫，得到板栗花活性提取物。 [0化5] 實施例3
[0056] 本實施例提供一種板栗花活性提取物的制備方法，其包括：
[0057] 預處理步驟:將新鮮板栗花于40°C下干燥至恒重后，粉碎至80目，得到板栗花粉 〇
[0058] 提取步驟:將板栗花粉末分散于體積分數(shù)為45 %的甲醇溶液中，板栗花粉末與甲 醇溶液的料液比為1:80,然后于370W的功率下微波提取25min，過濾后除去濾液中的溶劑， 得粗提物浸膏。
[0059] 萃取步驟:將粗提物浸膏用水溶解得到粗提液，然后用乙酸乙醋對粗提液進行萃 取，其中乙酸乙醋與粗提液的體積比為1.5:1，萃取3次，合并3次萃取后所得的有機相，減壓 濃縮后得到板栗花乙酸乙醋萃取物。
[0060] 純化步驟:將乙酸乙醋萃取物過大孔樹脂柱進行純化，大孔樹脂采用AB-8型大孔 樹脂對乙酸乙醋萃取物進行柱分離，并采用不同體積分數(shù)的乙醇溶液進行梯度洗脫，隨后 將體積分數(shù)為80%的乙醇溶液洗脫下的饋分作為樣品I過硅膠色譜柱，采用干法上樣，其 中，色譜柱中裝有的硅膠與樣品的干重之間的重量比為50:1，采用石油酸-乙酸乙醋混合溶 液梯度洗脫后，再用二氯甲燒-甲醇混合溶液梯度洗脫，得到樣品II，最后再將樣品II過凝 膠色譜柱，采用體積比為2.5:1的二氯甲燒-甲醇溶液進行等度洗脫，得到板栗花活性提取 物。
[0061 ] 實施例4
[0062] 本實施例提供一種板栗花活性提取物的制備方法，與實施例2基本一致，不同之處 在于：
[0063] 萃取步驟:將粗提物浸膏用水溶解得到粗提液，先依次用石油酸和氯仿進行萃取 W除去所述粗提液中的雜質，其中石油酸和氯仿與所述粗提液的體積比均為0.5:1。然后用 乙酸乙醋對粗提液進行萃取，其中乙酸乙醋與粗提液的體積比為0.5:1，萃取3次，合并3次 萃取后所得的有機相，減壓濃縮后得到乙酸乙醋萃取物。
[0064] 實施例5
[0065] 本實施例提供一種板栗花活性提取物的制備方法，與實施例2基本一致，不同之處 在于：
[0066] 萃取步驟:將粗提物浸膏用水溶解得到粗提液，先依次用石油酸和氯仿進行萃取 W除去所述粗提液中的雜質，其中石油酸和氯仿與所述粗提液的體積比均為1:1。然后用乙 酸乙醋對粗提液進行萃取，其中乙酸乙醋與粗提液的體積比為1:1，萃取3次，合并3次萃取 后所得的有機相，并將有機相在溫度為40°C的水浴、轉速為80轉/min、W及真空度為 0.07M化的條件下旋轉蒸發(fā)，除去有機相中的乙酸乙醋，得到粉末狀的乙酸乙醋萃取物。
[0067] 實施例6
[0068] 本實施例提供一種板栗花活性提取物的制備方法，與實施例2基本一致，不同之處 在于：
[0069] 純化步驟:將粗提物浸膏用水溶解得到粗提液，先依次用石油酸和氯仿進行萃取 W除去所述粗提液中的雜質，其中石油酸和氯仿與所述粗提液的體積比均為1:1。然后用乙 酸乙醋對粗提液進行萃取，其中乙酸乙醋與粗提液的體積比為1:1，萃取3次，合并3次萃取 后所得的有機相，并將有機相在溫度為35°C的水浴、轉速為90轉/min、W及真空度為 0.08M化的條件下旋轉蒸發(fā)，除去有機相中的乙酸乙醋，得到粉末狀的乙酸乙醋萃取物。
[0070] 實施例7
[0071] 本實施例提供一種板栗花活性提取物的制備方法，與實施例2基本一致，不同之處 在于：
[0072] 純化步驟:將粗提物浸膏用水溶解得到粗提液，先依次用石油酸和氯仿進行萃取 W除去所述粗提液中的雜質，其中石油酸和氯仿與所述粗提液的體積比均為2:1。然后用乙 酸乙醋對粗提液進行萃取，其中乙酸乙醋與粗提液的體積比為2:1，萃取3次，合并3次萃取 后所得的有機相，并將有機相在溫度為30°C的水浴、轉速為80轉/min、W及真空度為 0.07M化的條件下旋轉蒸發(fā)，除去有機相中的乙酸乙醋，得到粉末狀的乙酸乙醋萃取物。
[0073] 對比例1
[0074] 本對比例提供一種板栗花活性提取物的制備方法，與實施例2基本一致，不同之處 在于：
[0075] 提取步驟:將板栗花粉末分散于體積分數(shù)為38%的乙醇溶液中，板栗花粉末與乙 醇溶液的料液比為1:75,然后于35抓的功率下微波提取lOmin，過濾后除去濾液中的溶劑， 得粗提物浸膏。
[0076] 對比例2
[0077] 本對比例提供一種板栗花活性提取物的制備方法，與實施例2基本一致，不同之處 在于：
[0078] 提取步驟:將板栗花粉末分散于體積分數(shù)為65%的乙醇溶液中，板栗花粉末與乙 醇溶液的料液比為1:90,然后于450W的功率下微波提取30min，過濾后除去濾液中的溶劑， 得粗提物浸膏。
[0079] 對比例3
[0080] 本對比例提供一種板栗花活性提取物的制備方法，與實施例2基本一致，不同之處 在于：
[0081] 提取步驟:將板栗花粉末分散于體積分數(shù)為51 %的乙醇溶液中，板栗花粉末與乙 醇溶液的料液比為1:90,然后于270W的功率下微波提取20min，過濾后除去濾液中的溶劑， 得粗提物浸膏。
[0082] 對比例4
[0083] 本對比例提供一種板栗花活性提取物的制備方法，與實施例2基本一致，不同之處 在于采用回流提取法進行提取，具體為：
[0084] 提取步驟:將板栗花粉末分散于體積分數(shù)為51%的乙醇溶液中，其中，板栗花粉末 與乙醇溶液的料液比為1:90,在80°C下進行加熱回流，提取3次，每次回流化，過濾后合并濾 液，并除去濾液中的溶劑，得粗提物浸膏。
[0085] 對比例5
[0086] 本對比例提供一種板栗花活性提取物的制備方法，與實施例2基本一致，不同之處 在于采用浸潰法進行提取，具體為：
[0087] 提取步驟:將板栗花粉末分散于體積分數(shù)為51%的乙醇溶液中，其中，板栗花粉末 與乙醇溶液的料液比為1:90,在25°C下浸提2次，每次7天，過濾后合并濾液，并除去濾液中 的溶劑，得粗提物浸膏。
[0088] 對比例6
[0089] 本對比例提供一種板栗花活性提取物的制備方法，與實施例2基本一致，不同之處 在于：
[0090] 純化步驟:將乙酸乙醋萃取物過大孔樹脂柱進行純化，大孔樹脂采用D-101型大孔 樹脂對乙酸乙醋萃取物進行柱分離，并采用不同體積分數(shù)的乙醇溶液進行梯度洗脫，隨后 將體積分數(shù)為70%的乙醇溶液洗脫下的饋分作為樣品I過硅膠色譜柱，采用干法上樣，其 中，色譜柱中裝有的硅膠與樣品的干重之間的重量比為45:1，采用石油酸-乙酸乙醋混合溶 液梯度洗脫后，再用二氯甲燒-甲醇混合溶液梯度洗脫，得到樣品II，最后再將樣品II過凝 膠色譜柱，采用體積比為3:1的二氯甲燒-甲醇溶液進行等度洗脫，得到板栗花活性提取物。
[0091] 對比例7
[0092] 本對比例提供一種板栗花活性提取物的制備方法，與實施例2基本一致，不同之處 在于：
[0093] 純化步驟:將乙酸乙醋萃取物過大孔樹脂柱進行純化，大孔樹脂采用AB-8型大孔 樹脂對乙酸乙醋萃取物進行柱分離，并采用不同體積分數(shù)的乙醇溶液進行梯度洗脫，隨后 將體積分數(shù)為85%的乙醇溶液洗脫下的饋分作為樣品I過硅膠色譜柱，采用干法上樣，其 中，色譜柱中裝有的硅膠與樣品的干重之間的重量比為45:1，采用石油酸-乙酸乙醋混合溶 液梯度洗脫后，再用二氯甲燒-甲醇混合溶液梯度洗脫，得到樣品II，最后再將樣品II過凝 膠色譜柱，采用體積比為1:1的二氯甲燒-甲醇溶液進行等度洗脫，得到板栗花活性提取物。
[0094] 對比例8
[00M]本對比例提供一種板栗花活性提取物的制備方法，與實施例2基本一致，不同之處 在于：
[0096] 純化步驟:將乙酸乙醋萃取物過大孔樹脂柱進行純化，大孔樹脂采用AB-8型大孔 樹脂對乙酸乙醋萃取物進行柱分離，并采用不同體積分數(shù)的乙醇溶液進行梯度洗脫，隨后 將體積分數(shù)為85%的乙醇溶液洗脫下的饋分作為樣品I過硅膠色譜柱，采用干法上樣，其 中，色譜柱中裝有的硅膠與樣品的干重之間的重量比為60:1，采用石油酸-乙酸乙醋混合溶 液梯度洗脫后，再用二氯甲燒-甲醇混合溶液梯度洗脫，得到樣品II，最后再將樣品II過凝 膠色譜柱，采用體積比為2:1的二氯甲燒-甲醇溶液進行等度洗脫，得到板栗花活性提取物。
[0097] 實驗例1
[0098] 板栗花活性提取物中有效成分的結構分析：
[0099] 采用質譜、紅外色譜和核磁共振色譜等技術手段對上述實施例和對比例中所得的 板栗花活性提取物進行表征：
[0100] (1)質譜解析，結果如圖1所示，
[0101] 從圖1中可W看出，板栗花活性提取物中的準分子離子峰m/z455.353[M-Hr提示 其分子量為456.35，分子式為C30H4803 ;次要的分子離子峰為255.23，其對應的化合物的化學 式為Cl6出102。說明板栗花活性提取物中所含的主要化合物的分子式為C30H48化。
[0102] (2)紅外色譜解析，結果如圖2所示，
[0103] 紅外色譜圖顯示該化合物含有徑基（3433cm-i)、幾基（1699cm-i)，說明分子式為 〔30此8〇3的化合物的結構中同時含有徑基和幾基。
[0104] (3)核磁共振色譜解析，Uc-NMR的數(shù)據(jù)如表1所示
[0105] 表1板栗花活性提取物的Uc-NMR數(shù)據(jù)
[0106]
[0107]將表1中δ。的"C-醒R數(shù)據(jù)與文獻比對發(fā)現(xiàn)，δ。的"C-NMR的數(shù)據(jù)齊墳果酸的碳譜 數(shù)據(jù)一致，故鑒定此化合物為齊墳果酸。
[010引將表1中δ。的"C-醒R數(shù)據(jù)與文獻比對發(fā)現(xiàn)，δ。的"C-NMR的數(shù)據(jù)烏蘇酸的碳譜數(shù) 據(jù)一致，故鑒定此化合物為烏蘇酸。
[0109] 齊墳果酸(2)和烏蘇酸（3)互為同分異構體，均為五環(huán)Ξ祗類化合物，其結構式如 下，二者的不同之處在于C-19和C-20上的取代基不同。
[0110] 實驗例2
[0111] 板栗花活性提取物的抑菌活性測定：
[0112] 參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會(CLSI)標準，采用平皿二倍稀釋法和多點接種器 進行抑菌活性測定實驗。在中國醫(yī)學院生物技術研究所完成對上述實施例1-7W及對比例 1-8中所得的板栗活性提取物的抑菌試驗，并選用實施例2中的乙酸乙醋萃取物、純度大于 99%的齊墳果酸、W及純度大于99%的烏蘇酸做對照。試驗中的試驗菌包括表皮葡萄球菌、 金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、W及尿腸球菌。
[0113] 將試驗菌用米勒-海頓肉湯培養(yǎng)基(MH肉湯）或腦屯、浸液肉湯培養(yǎng)基進行增菌，將 上述藥品用MH肉湯二倍稀釋成各種所需濃度，分別加適量稀釋后的藥品到平皿中。隨后，將 MH瓊脂培養(yǎng)基烙化后定量注入含藥液的平皿內混勻，使平皿內藥物的終濃度分別為0.03， 0.06,0.12……64，128,2564旨/1111。接種試驗菌(接種量為10伯。1]/點）后置于35°(：恒溫培養(yǎng) 1化后觀察結果，無菌生長的平皿中所含藥物的最小濃度即為最低抑菌濃度(MIC)，試驗結 果如表2所不：
[0114] 表2板栗花乙酸乙醋萃取物對試驗菌的最低抑菌濃度(yg · m[i)
[0115]
[0116] 從表2可W看出：
[0117] (1)實驗組中實施例1-7所得的板栗花活性提取物對試驗菌的MIC(2-32yg · ml/i) 明顯低于對比例1-8的MIC(>64yg · mL-i)，運說明本發(fā)明提供的板栗花活性提取物的制備 方法，能夠從板栗花中制備出抗菌活性強的組合物，運種組合物能夠應用于抗菌劑的制備 中，也可W將其應用于洗護用品中。
[0118] (2)實驗組中實施例1-7中所得的板栗花活性提取物對糞腸球菌和尿腸球菌的抑 菌活性優(yōu)于對其它幾種菌株的抑菌活性，更明顯的優(yōu)于對比例對糞腸球菌和尿腸球菌的抑 菌活性。運說明本發(fā)明提供的板栗花活性提取物的制備方法，能夠從板栗花中制備出對糞 腸球菌和尿腸球菌有極強抗菌活性的組合物，能夠將其應用于抗菌劑的制備中，運種抗菌 劑可專用于治療由糞腸球菌和尿腸球菌所致的感染性疾病。
[0119] (3)對比例4和5對試驗菌的最低抑菌濃度均大于25化g · ml/i，遠大于實施例2中相 應的最低抑菌濃度(小于16yg · 由此說明本發(fā)明采用的微波提取法，提取到的有效活 性物質的含量高，其明顯優(yōu)于回流提取法和浸潰法等傳統(tǒng)提取方法。
[0120] (4)對比例6和7中對試驗菌的最低抑菌濃度均大于12祉g · m[i，遠大于實施例2中 相應的最低抑菌濃度(小于16yg · ml/1)。由此說明采用本實施例的方法，即在純化步驟中采 用AB-8型大孔樹脂、且樣品I為80-90%的乙醇溶液洗脫下的饋分、W及過凝膠色譜柱時采 用的1.5-2.5:1的二氯甲燒-甲醇溶液，都對板栗花活性提取物中有效物質的含量有至關重 要的影響。
[0121] (5)對比例8中對試驗菌的最低抑菌濃度均大于12祉g · ml/i，遠大于實施例2中相 應的最低抑菌濃度(小于16yg · ml/i)。說明色譜柱中裝有的硅膠與樣品的干重之間的重量 比為40-50:1，該重量比能夠提高硅膠柱分離的柱效，對板栗花中活性提取物的提取至關重 要。
[0122] (6)齊墳果酸標準品對試驗菌的最低抑菌濃度均大于32yg · m[i，烏蘇酸標準品對 試驗菌的最低抑菌濃度均大于64yg · m[i，而W齊墳果酸和烏蘇酸為主要成分的板栗花活 性提取物對試驗菌的最低抑菌濃度(小于16yg · m[i)，運說明齊墳果酸和烏蘇酸具有協(xié)同 促進的抑菌作用，其二者的混合物的抑菌活性強于單個化合物的抑菌活性。此外，運也可能 是由于板栗花活性提取物中少量的未知成分對齊墳果酸和烏蘇酸的抑菌作用起促進作用。
[0123] (7)乙酸乙醋萃取物對試驗菌的最低抑菌濃度均在16-6化g · m[i之間，而實施例2 中相應的最低抑菌濃度為2-16yg · ml/i。運說明在乙酸乙醋萃取物在經過吸附色譜和凝膠 色譜純化后，有效活性物質的純度提高，所得的板栗花活性提取物的抑菌活性也得到了很 大的提升。
[0124] 盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應意識到，在不背離本發(fā)明的 精神和范圍的情況下可W作出許多其它的更改和修改。因此，運意味著在所附權利要求中 包括屬于本發(fā)明范圍內的所有運些變化和修改。
【主權項】
1. 一種板栗花活性提取物的制備方法，其特征在于，其包括： 將板栗花粉末分散于體積分數(shù)為45-55%的醇溶液中，所述板栗花粉末與所述醇溶液 的料液比為1:80-90，然后于330-3701的功率下微波提取15-2511^11，過濾后除去濾液中的溶 劑，得粗提物浸膏； 將所述粗提物浸膏用水溶解得到粗提液，然后用乙酸乙酯對所述粗提液進行萃取，其 中所述乙酸乙酯與所述粗提液的體積比為〇.5-2:1，得到乙酸乙酯萃取物； 采用吸附色譜法和凝膠色譜法對所述乙酸乙酯萃取物進行精制，分離純化得板栗花活 性提取物。2. 根據(jù)權利要求1所述的板栗花活性提取物的制備方法，其特征在于，所述吸附色譜法 為大孔樹脂色譜法和硅膠柱色譜法，所述大孔樹脂色譜法采用AB-8型大孔樹脂對所述乙酸 乙酯萃取物進行柱分離，并采用不同體積分數(shù)的乙醇溶液進行梯度洗脫，隨后將體積分數(shù) 為80-90 %的乙醇溶液洗脫下的餾分作為樣品I過硅膠色譜柱，采用石油醚-乙酸乙酯混合 溶液梯度洗脫后，再用二氯甲烷-甲醇混合溶液梯度洗脫，得到樣品II，最后再將樣品II過 凝膠色譜柱，采用體積比為1.5-2.5:1的二氯甲烷-甲醇溶液進行等度洗脫，得到板栗花活 性提取物。3. 根據(jù)權利要求2所述的板栗花活性提取物的制備方法，其特征在于，在所述硅膠柱色 譜法中，采用干法上樣，色譜柱中裝有的硅膠與樣品的干重之間的重量比為40-50:1。4. 根據(jù)權利要求1所述的板栗花活性提取物的制備方法，其特征在于，所述粗提液用乙 酸乙酯萃取后，分離有機相，隨后在溫度為30-40°C的水浴、轉速為80-100轉/min、以及真空 度為0.07-0.09MPa的條件下旋轉蒸發(fā)，除去粗提液中的乙酸乙酯，得到粉末狀的乙酸乙酸 萃取物。5. 根據(jù)權利要求1所述的板栗花活性提取物的制備方法，其特征在于，所述粗提液在用 乙酸乙酯萃取之間，先依次用石油醚和氯仿進行萃取以除去所述粗提液中的雜質。6. 根據(jù)權利要求1所述的板栗花活性提取物的制備方法，其特征在于，所述板栗花粉末 為新鮮板栗花于30-40°C下干燥至恒重并粉碎至40-80目后所得的粉末。7. -種根據(jù)權利要求1-6任一項所述的制備方法制得的板栗花活性提取物。8. 根據(jù)權利要求7所述的板栗花活性提取物在制備抗菌劑中的應用。9. 根據(jù)權利要求8所述的板栗花活性提取物在制備抑制屎腸球菌的抗菌劑中的應用。10. 根據(jù)權利要求8所述的板栗花活性提取物的應用，其特征在于，所述板栗花活性提 取物的最低抑菌濃度為16μg/ml。
【文檔編號】A61K8/63GK105998103SQ201610570072
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月19日
【發(fā)明人】楊越冬, 王同坤, 劉俊芳
【申請人】河北科技師范學院