西藏扁芒菊揮發(fā)油及其在制藥中的用圖
【專利摘要】本發(fā)明屬藏藥制藥領(lǐng)域，涉及西藏扁芒菊揮發(fā)油及其在制藥中的用途，本發(fā)明從西藏扁芒菊植物中提取得到的揮發(fā)油，其中主要成分為甜沒藥烯萜醇；纈草酮；斯巴醇；石竹烯和綠花白千層醇等，經(jīng)藥理篩選CPE法和MTT法進行不同濃度梯度活性檢測，結(jié)果證實所述的西藏扁芒菊植物揮發(fā)油有良好的抗炎和抗流感病毒活性。本發(fā)明的西藏扁芒菊植物提取的揮發(fā)油可用于制備抗炎、抗流感病毒或防治季節(jié)性流感的藥物。尤其是用于制備防治人禽流感的藥物；以及用于制備防治甲型H1N1型流感藥物和防治季節(jié)性流感藥物；本發(fā)明的所述的西藏扁芒菊揮發(fā)油還可用于制備解熱藥物。
【專利說明】
西藏扁芒菊揮發(fā)油及其在制藥中的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬藏藥制藥領(lǐng)域，涉及西藏扁芒菊揮發(fā)油及其在制藥中的用途，具體涉及 來源于西藏扁芒菊植物揮發(fā)油在制備抗炎、抗病毒藥藥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 流感病毒（Influenza viruses)屬正粘病毒科，是RNA病毒。據(jù)研究報道，流感病 毒核蛋白NP和基質(zhì)蛋白Ml抗原性的不同，流感病毒可分為甲（A)、乙（B)和丙（C)三型， 該三種型的流感病毒均能感染人。其中，A型流感病毒根據(jù)其表面血凝素蛋白（HA)和神經(jīng) 氨酸酶（NA)的結(jié)構(gòu)以及其基因特性的不同又可分成若干亞型，至今發(fā)現(xiàn)的HA有16個亞型 H1-H16, NA有9個亞型N1-N9。研究顯示，流感病毒具有很強的宿主特異性，人流感病毒識 別SAa 2,6Gal特異性受體，主要存在于人的呼吸道中，因此流感病毒會引起急性呼吸道傳 染病，以及引起心肌炎、肺炎、支氣管炎等多種并發(fā)癥。據(jù)報道，季節(jié)性流感病毒株不斷地在 亞洲演化，形成重疊性的流行蔓延；根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，全球每年有大約300萬 至500萬人因感染流感病毒而嚴(yán)重發(fā)?。≒. Palese, M.L. Shaw, PA (2007)，pp :1647 - 1689 ; T.Ito et al. , Arch. Virol. , 140(1995), pp. 1163 - 1172) 〇
[0003] 流感病毒是至今未被有效控制的傳染性疾病。目前，臨床實踐中應(yīng)對流感病毒 的主要干預(yù)方式是采用疫苗和藥物治療。其中，抗流感病毒藥物根據(jù)作用機制分為兩類， 第一類是上市較早的離子通道阻斷劑，以金剛烷胺和金剛乙胺為代表；第二類是神經(jīng)氨酸 酶（NA)抑制劑；目前由美國FDA批準(zhǔn)的抗流感病毒藥物有磷酸奧司他韋（oseltamivir phosphate)，扎那米韋（zanamivir)和帕拉米韋（peramivir)三個抗流感病毒藥物 (Centers for Disease Control and Prevention http://www. cdc. gov ;張強，趙慶杰， 等.藥學(xué)，2010, 45 (3) : 289-299)。研究顯示，迄今，國內(nèi)外采用的抗流感病毒藥物均存在有 一定的副作用，并且對最新流行的病毒株均存在有一定的耐藥性，因此，開發(fā)新型抗流感病 毒藥物是迫在眉睫。
[0004] 近年來植物揮發(fā)油除了用于芳香療法，按摩療法，個人護理等以外，在治療抑 郁癥、炎癥、癌癥等疾病發(fā)現(xiàn)有很多有利的科學(xué)證據(jù)，例如，紫蘇屬植物揮發(fā)油主要成 分中，發(fā)現(xiàn)1-紫蘇醛（Ι-Perillaldehyde)可用于治療抑郁癥；香檸檬、藍(lán)桉樹揮發(fā)油 在流行性感冒上顯現(xiàn)有潛在的效果；伊朗布留序（Bunium persicum)揮發(fā)油主要含有 gamma-砲品稀，茴香甲醛和對傘花經(jīng)等，顯示具有抗炎作用（Ito，et al. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2011, Jun 22, pp:1-5 ；Selvarani, James, American Journal of Essential Oils and Natural Products, 2014 ；2(1):47-53 ； Hajhashemi, et al., 2011, Pharm. Biol. 49, 146 - 151 ；ffu et al. , BMC Complement. Altern. Med.，10(2010)，p:69)。
[0005] 青藏高原其極端環(huán)境撫育著豐富多樣的植物藥用資源，同時其極端環(huán)境導(dǎo)致高原 疾病多樣化。多源細(xì)菌和病毒引起的肺部感染是青藏高原人們常見的疾病，然而目前市場 上抗病毒藥物對高原特殊流行性感冒未見有很好的治愈效果，如，尤其在2011年至2014 年期間在孩童、老人及青年各個年齡階段的藏族人出現(xiàn)了因流行性感冒引起呼吸道感染疾 病，由于西藥干預(yù)未見有治愈效果，導(dǎo)致患者最終選擇長期服用藏藥進行治療。
[0006] 西藏扁芒菊（Waldheimia glabra(Decne. ) Rgl.)，藏名為"剛布"，是菊科扁芒菊 屬植物，分布于印度北部、巴基斯擔(dān)、阿富汗、蘇聯(lián)中亞地區(qū)，生長于我國青藏高原喜馬拉雅 山脈及閃底斯山脈海拔4900~5500米的高山碎石坡石縫中，常以民間熏香或泡水喝等方 式用于預(yù)防和治療感冒；亦見有部分醫(yī)學(xué)書籍記載西藏扁芒菊植物全草在民間用于外感表 證、發(fā)熱頭痛、項背強痛等?！吨袊参镏緢蟮馈凡刈迦罕娪胁捎梦鞑乇饷⒕罩参锶莞深A(yù)感 冒等病癥。
[0007] 鑒于目前國內(nèi)外關(guān)于西藏扁芒菊在抗病毒和抗炎的研究工作屬于空白的現(xiàn)狀，雖 然有研究報道了涉及采集尼珀爾昆布地區(qū)的扁芒菊（Waldheimia)植物次生代謝產(chǎn)物及其 抗自由基酸類化合物隨海拔濃度變化的研究工作（Annamaria Giorgi),其中采用頂空固相 萃取法對揮發(fā)性有機物化學(xué)成分分析，但是，該研究采集植物分布與本發(fā)明來源植物分布 不同，尤其生態(tài)環(huán)境有截然不同；該研究得到的主要化學(xué)成分與本發(fā)明擬提供的植物中提 取的揮發(fā)油成分不同；以及該研究尚未報道揮發(fā)油的藥理活性等等，本申請的發(fā)明人擬提 供西藏扁芒菊揮發(fā)油及其在制藥中的新用途，尤其是西藏扁芒菊植物揮發(fā)油的抗炎、抗流 感病毒活性的藥物用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明目的是為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供新的抗病毒藥物，涉及西藏扁芒菊揮 發(fā)油及其在制藥中的用途，尤其涉及來源于西藏扁芒菊（W. glabra)植物提取的揮發(fā)油及 該揮發(fā)油在制備抗炎和抗流感病毒藥物中的用途。
[0009] 本發(fā)明從西藏扁芒菊（W. glabra)植物中提取得到的揮發(fā)油，經(jīng)藥理篩選CPE法和 MTT法進行不同濃度梯度活性檢測，結(jié)果證實西藏扁芒菊植物揮發(fā)油有良好的抗炎和抗流 感病毒活性。
[0010] 本發(fā)明所述的西藏扁芒菊即指扁芒菊屬（Waldheimia)西藏扁芒菊種（W. glabra) 的全草。本發(fā)明的植物揮發(fā)油來源于西藏扁芒菊（W. glabra)植物揮發(fā)油。
[0011] 本發(fā)明的西藏扁芒菊揮發(fā)油通過下述方法制備：
[0012] 采用西藏扁芒菊植物干草粉碎，過篩后，用蒸餾水浸泡4h，然后用水蒸氣蒸餾法提 取，得到1. 5 %的淡黃色精油。
[0013] 本發(fā)明對西藏扁芒菊揮發(fā)油進行了化學(xué)成分分析：
[0014] 西藏扁芒菊植物提取的揮發(fā)油用氣相色譜-質(zhì)譜檢測（GC-MS)、分析，經(jīng)搜索 NIST譜庫以及標(biāo)準(zhǔn)樣品比對結(jié)合人工解析質(zhì)譜圖，首次鑒定了 67個化合物，其中主要 成分為甜沒藥稀碗醇（a -Bisabolol，CAS#515_69_5) 20. 22 % ;繳草酬（Jatamansone CAS#1803-39-0) 11.79 %;斯巴醇（（-)-Spadhuleno#l 139-30-6)8.2 %;石竹烯 (Caryophyllene) 6. 06% ;綠花白千層醇（Viridiflorol) 5. 18%等。
[0015] 本發(fā)明進行了西藏扁芒菊揮發(fā)油抗流感病毒活性實驗：
[0016] CPE法（細(xì)胞病變）檢測西藏扁芒菊提取的揮發(fā)油對流感病毒A型的甲型流感病 毒A3 (H3N2) (A3/京科/30/95)(購買于上海疾控中心）的抑制作用，用MTT法檢測西藏扁 芒菊提取的揮發(fā)油對MDCK細(xì)胞毒性，以利巴韋林作為陽性對照進行實驗；結(jié)果顯示所述的 揮發(fā)油濃度在100 μ g/ml時，CPE抑制率達到37. 5%，且無明顯毒性，表明西藏扁芒菊揮發(fā) 油在中等劑量下有良好的抗流感病毒活性。
[0017] 本發(fā)明進行了西藏扁芒菊揮發(fā)油的抗炎藥理實驗：
[0018] 以LPS和PolyI = C為刺激劑，激活巨噬細(xì)胞系RAW264. 7的TLR4、TLR3受體，引發(fā) 下游的炎癥反應(yīng)，通過檢測細(xì)胞上清中NO評估揮發(fā)油在抗LPS和Poly IC誘導(dǎo)的炎癥的能 力強弱，同時用MTT法測定樣品的細(xì)胞毒性。結(jié)果，西藏扁芒菊揮發(fā)油在20ug/ml時能顯著 抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥，且無明顯毒性。
[0019] 本發(fā)明的西藏扁芒菊植物提取的揮發(fā)油進一步可用于制備抗炎、抗流感病毒或防 治季節(jié)性流感的藥物。尤其是所述的西藏扁芒菊植物提取的揮發(fā)油可用于制備防治人禽流 感的藥物；以及用于制備防治甲型HlNl型流感藥物和防治季節(jié)性流感藥物；本發(fā)明的所述 的西藏扁芒菊揮發(fā)油也可用于制備解熱藥物。
【附圖說明】
[0020] 圖1是西藏扁芒菊（W. glabra)抗炎活性NO值，其中，Sample DJ(濃度分別為 4, 20, 100ug/ml)。
[0021] 圖2是西藏扁芒菊（W. glabra)細(xì)胞毒性MTT值，其中，Sample DJ(濃度分別為 4, 20, 100ug/ml)。
[0022] 圖3西藏扁芒菊（W. glabra)標(biāo)準(zhǔn)總離子譜圖。
[0023] 圖4 (：8至C 33標(biāo)準(zhǔn)離子譜圖。
【具體實施方式】
[0024] 實施例1提取制備西藏扁芒菊揮發(fā)油
[0025] 取西藏扁芒菊（W. glabra)干燥全草，用中藥粉碎機粉碎，并過（40目）篩，稱取 l〇〇g，用蒸餾水浸泡過夜。按照《中華人名共和國國家藥典2010版附錄XD》揮發(fā)油測定方 法提取4h，得1. 5 %的淡黃色精油；
[0026] 按照《中華人名共和國國家藥典2010版附錄XD》揮發(fā)油測定方法進行化學(xué)成分分 析；采用氣相色譜-質(zhì)譜檢測（GC-MS)分析，色譜-質(zhì)譜分析條件為如下：
[0027] 檢測儀器：美國Thermo DSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；
[0028] 色譜條件：Hp_5MS 毛細(xì)管柱（5 % phenyl methyl siloxane， 30mX0. 25_Χ0. 25μπι)毛細(xì)管柱；進樣口溫度：250°C ;柱溫：起始溫度60°C，保持2min; 以15°C /min升至300°C，保持8min ;載氣（He);流速：lmL/min ;分流比：200:1 ;進樣量： l.OyL；
[0029] 質(zhì)譜條件：電離方式EI，電離能量70eV，離子源溫度250°C，傳輸線溫度：250°C;掃 描范圍（41-40(^11111) ;標(biāo)準(zhǔn)譜庫：見31'庫；
[0030] 經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜分離檢測得到的化合物質(zhì)譜圖在NIST庫搜庫，同時結(jié)合標(biāo) 準(zhǔn)樣品的譜圖比較，結(jié)合人工解析質(zhì)譜圖鑒定了 67個化合物，其中主要成分為下式的 (I )甜沒藥稀砲醇（a_Bisabolol，CAS#515-69_5)20. 22% ;( II )繳草酮（Jatamansone CAS#1803-39-0) 11. 79 % ;斯巴醇（（-)-Spadhuleno#1139-30-6)8. 2 % ; ( III )石竹烯 (Caryophyllene) 6. 06% ; (IV)綠花白千層醇（Viridiflorol) 5. 18%等。
[0031]
[0033] 實施例2西藏扁芒菊揮發(fā)油抗流感病毒活性篩選實驗
[0034] 用MTT法檢測制得的西藏扁芒菊揮發(fā)油對MDCK細(xì)胞毒性，CPE法（細(xì)胞病變）檢 測所述西藏扁芒菊揮發(fā)油對流感病毒A型的甲型流感病毒A3 (H3N2) (A3/京科/30/95)(購 買于上海疾控中心），抑制作用，以利巴韋林作為陽性對照實驗：
[0035] 首先，進行藥物的細(xì)胞毒性檢測，MDCK細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)形成單層后，加入 不同濃度的藥液繼續(xù)培養(yǎng)，以細(xì)胞病變或MTT染色法為觀察指標(biāo)，用Reed-Muench法計算藥 物對細(xì)胞無毒的最大濃度（TD。）和半數(shù)中毒濃度（TD 5。）；
[0036] 其次，進行藥物抗流感病毒作用檢測，MDCK細(xì)胞培養(yǎng)形成單層后，用IOOTCId5。（含 胰蛋白酶）的流感病毒感染細(xì)胞，吸附2小時后，傾出病毒，再加入無毒濃度下的系列濃度 的含藥培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)；試驗設(shè)病毒對照、細(xì)胞對照及陽性藥物對照，以病毒對照孔出現(xiàn) 病變達75 %以上（即4+時），可終止試驗；根據(jù)細(xì)胞病變程度CPE，用Reed-Muench法計算 半數(shù)有效濃度（IC5。）；結(jié)果顯示所述揮發(fā)油在濃度100 μ g/ml時，CPE抑制率達到37. 5%， 且無明顯毒性，表明西藏扁芒菊植物揮發(fā)有良好的抗流感病毒活性。
[0037] 表1是西藏扁芒菊細(xì)胞毒性檢測和抗流感病毒A3 (H3N2)活性測試檢測結(jié)果
[0038]
[0039] 實施例3西藏扁芒菊揮發(fā)油抗炎活性篩選實驗
[0040] 以LPS和PolyI: C為刺激劑，激活巨噬細(xì)胞系RAW264. 7的TLR4、TLR3受體，引發(fā) 下游的炎癥反應(yīng)，通過檢測細(xì)胞上清中NO評估揮發(fā)油在抗LPS和Poly IC誘導(dǎo)的炎癥方面 的能力強弱：
[0041] 將RAW264. 7細(xì)胞消化后計數(shù)，按照4*105/ml種板，配制lmg/ml刺激劑、lmg/ml LPS貯存液、IOOuM DEX貯存液和0. 5mg/ml揮發(fā)油貯存濃度（配制濃度：8、40、200ug/ml終 濃度：4、20、100耶/1111);配制貯存液濃度 ：0.51^/1111，0130:1:800，加板后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱 培養(yǎng)，之后取出收集上清（180ul/孔），用于測定相關(guān)炎癥介質(zhì)因子分泌，加 DMEM-IO% FBS 180 μ L，5mg/ml MTT 20 μ 1 (終濃度0. 45mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，4h后，小心棄去上清，每孔 加 DMSO 200 μ 1，在振蕩器上震蕩10分鐘，于570nm比色（吸光度越大，表明活細(xì)胞數(shù)量越 多），記錄OD值，以亞硝酸鈉溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液建立NO標(biāo)準(zhǔn)曲線（測量范圍0-200umol/L)， 確定各組細(xì)胞上清中的NO水平；
[0042] 結(jié)果顯示，西藏扁芒菊揮發(fā)油20ug/ml時能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥，在IOOug/ ml，抑制炎癥效果明顯，但是在100ug/ml時抑制細(xì)胞增長能力增強（如圖1、2所示），結(jié)果 表明，中等計量的西藏扁芒菊揮發(fā)油具有良好的抗炎作用。
【主權(quán)項】
1. 西藏扁芒菊揮發(fā)油，其特征在于，通過下述方法制備： 取西藏扁芒菊干燥全草，用中藥粉碎機粉碎，過40目篩，用蒸饋水浸泡過夜，提取制得 淡黃色精油； 其中主要成分為下式所示的（I )甜沒藥締祗醇；（II )鄉(xiāng)草酬；斯己醇（(-); (III) 石竹締；（IV)綠花白千層醇；2. 按權(quán)利要求1所述的西藏扁芒菊揮發(fā)油，其特征在于，所述的西藏扁芒菊揮發(fā)油采 用氣相色譜-質(zhì)譜檢測（GC-M巧分析其化學(xué)成分，色譜-質(zhì)譜分析條件為如下： 檢測儀器：美國化ermo DSQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀； 色譜條件 Wp-SMS 毛細(xì)管柱巧％ 地6115^1 meth}d siloxane，30mX0. 25mmX0. 25]im) 毛細(xì)管柱；進樣口溫度：250°C ;柱溫：起始溫度60°C，保持2min ; W 15°C /min升至300°C， 保持8min ;載氣化e);流速：1血/min ;分流比：200:1 ;進樣量：1. 0 y L ; 質(zhì)譜條件：電離方式EI，電離能量70eV，離子源溫度250°C，傳輸線溫度：250°C;掃描范 圍（41-400amu);標(biāo)準(zhǔn)譜庫：NIST庫。3. 權(quán)利要求1所述的西藏扁芒菊揮發(fā)油在制備抗炎和抗流感病毒藥物中的用途。4. 按權(quán)利要求3的用途，其中所述的抗流感病毒藥物是防治人禽流感的藥物。5. 按權(quán)利要求3的用途，其中所述的所述的抗流感病毒藥物是防治甲型HlNl型流感藥 物。6. 按權(quán)利要求1的用途，其中所述的抗流感病毒藥物是是防治季節(jié)性流感藥物。7. 權(quán)利要求1所述的西藏扁芒菊揮發(fā)油在制備解熱藥物中的用途。
【文檔編號】A61P29/00GK105982936SQ201510287695
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年5月29日
【發(fā)明人】德吉, 盧燕, 陳道峰
【申請人】西藏大學(xué)