廣金錢草提取物治療泌尿性結(jié)石的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及廣金錢草提取物治療泌尿性結(jié)石的應(yīng)用。本發(fā)明通過將廣金錢草的三個(gè)部位進(jìn)行提取，采用腹腔注射乙醛酸鹽溶液制作小鼠草酸鈣結(jié)晶模型分別研究各部位對(duì)草酸鈣結(jié)晶產(chǎn)生的作用。結(jié)果表明：廣金錢草提取物能夠促使小鼠血肌酐、尿素氮水平顯著下降，腎臟組織鈣含量顯著下降、腎組織草酸鈣結(jié)晶沉積及腎臟病理組織損傷均顯著減輕、CAT、CuZn?SOD、GSH、骨橋蛋白、CD44、TRPV5、Calbindin?D28和Ki67水平顯著升高；MDA和TUNEL含量顯著降低。
【專利說明】
廣金錢草提取物治療泌尿性結(jié)石的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及廣金錢草提取物治療泌尿性結(jié)石的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腎臟是人體重要的功能器官，它的功能是生成尿液的同時(shí)清除體內(nèi)代謝產(chǎn)物及廢 物、毒物，經(jīng)重吸收功能保留體內(nèi)水份及其它有用的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、葡萄糖、氨基酸、鉀離 子、鈉離子、碳酸氫鈉等，調(diào)節(jié)水、電解質(zhì)平衡及體內(nèi)酸堿平衡，腎臟保證了機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn) 定，使得新陳代謝能夠正常進(jìn)行。泌尿系結(jié)石是危害人類健康的重要疾病，我國屬于全球結(jié) 石的高發(fā)區(qū)，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，盡管腎結(jié)石的治療方法已 有不少，但始終沒有非常有效的預(yù)防及防止復(fù)發(fā)的方法。泌尿系結(jié)石中，梗阻性腎病最為常 見，左、右腎結(jié)石的發(fā)病率持平，雙腎均有結(jié)石的發(fā)病率約為7%_10%，其中草酸鈣結(jié)石占 腎結(jié)石的80%。腎結(jié)石對(duì)人體的危害不僅是梗阻，結(jié)石可致腎功能不全，但其介導(dǎo)的腎損害 發(fā)生機(jī)制并不明確。
[0003] 結(jié)石的早期表現(xiàn)是結(jié)晶，其成分約80%是草酸鈣，是泌尿系結(jié)石中最常見的種類， 由于其復(fù)發(fā)率高，目前已成為泌尿系結(jié)石的研究重點(diǎn)。目前臨床治療結(jié)石的主要方法以碎 石手術(shù)為主，隨著經(jīng)皮腎鏡、體外沖擊波碎石術(shù)、腹腔鏡、輸尿管鏡等技術(shù)的逐漸成熟，尿路 結(jié)石的治療方法已不再棘手，但術(shù)后結(jié)石復(fù)發(fā)的概率高達(dá)50%，且其對(duì)患者的傷害較大。利 用中草藥治療腎臟結(jié)石效果顯著且副作用少，因此近年來對(duì)中藥在抗石方面的研究越來越 多，目前，廣金錢草各提取部位對(duì)于減輕結(jié)晶腎損傷的作用尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種廣金錢草提取物 治療泌尿性結(jié)石的應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了廣金錢草提取物在制備泌尿性結(jié)石治療藥物中的用 途。
[0007] 進(jìn)一步地，所述泌尿性結(jié)石為腎臟結(jié)石。
[0008] 進(jìn)一步地，所述結(jié)石為草酸鈣結(jié)石。
[0009] 進(jìn)一步地，所述藥物起到以下任一項(xiàng)或多項(xiàng)的作用：（1)用于降低血肌酐或尿素氮 水平；（2)用于減少腎臟組織中鈣含量；（3)用于修復(fù)腎臟組織損傷；（4)用于減少腎臟組織 中的結(jié)晶；（5)用于提高腎臟組織中抗氧化劑和自由基清除劑含量；（6)用于提高腎組織中 骨橋蛋白和⑶44表達(dá)水平；（7)用于提高腎組織中Calbindin-D28蛋白表達(dá)水平；（8)用于促 進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖；（9)用于抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡。
[0010] 廣金錢草，為豆科植物廣金錢草Desmodium styraci foLium, (Osb. )Merr.的干燥 地上部分。
[0011]進(jìn)一步地，所述廣金錢草提取物為廣金錢草經(jīng)提取溶劑提取制得的提取物。
[0012] 所述提取溶劑，只要不損害本發(fā)明的效果，則沒有特別的限制，可以為水；甲醇、乙 醇等一元醇；1，3_丁二醇、丙二醇等多元醇;醋酸乙酯等低級(jí)烷基酯；乙醚，丙酮等。在本發(fā) 明中，也可以將上述溶劑組合使用。優(yōu)選的提取溶劑為水、甲醇、乙醇、1，3_丁二醇或其組 合。尤其優(yōu)選的提取溶劑為水、乙醇或其組合(即乙醇水溶液）。
[0013] 更為具體地，所述廣金錢草提取物采用包括下列步驟的方法制得：以廣金錢草為 原料，用提取溶劑提取，然后采用萃取溶劑進(jìn)行萃取，獲得廣金錢草提取物。
[0014] 進(jìn)一步地，所述提取溶劑選用乙醇水溶液。優(yōu)選地，所述提取溶劑選用95%的乙醇 水溶液。在本發(fā)明中，95 %的乙醇水溶液中的95 %是指乙醇體積分?jǐn)?shù)占95 %，亦即100體積 中含95體積的乙醇。
[0015] 進(jìn)一步地，所述萃取溶劑選自石油醚、乙酸乙酯或正丁醇中的任一種。
[0016]再進(jìn)一步地，所述廣金錢草提取物采用包括下列步驟的方法制得：以廣金錢草為 原料，粉碎，用提取溶劑提取，合并提取液，濃縮，獲得濃縮液;然后將所得濃縮液用水分散， 分別采用萃取溶劑進(jìn)行萃取，濃縮，獲得廣金錢草提取物。
[0017]所述濃縮的方法包括但不限于:常壓蒸發(fā)、減壓蒸發(fā)、薄膜蒸發(fā)、多效蒸發(fā)。
[0018] 所述綠萼梅提取物制備時(shí)，滿足下列條件中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)：
[0019] (1)所述廣金錢草與提取溶劑的料液比為Ig: (5~13 )ml;
[0020] (2)萃取時(shí)，濃縮液與萃取溶劑之間的體積比為1:1至1:3,萃取次數(shù)為1-3次。
[0021] 本發(fā)明的第二方面，還提供了廣金錢草提取物在制備藥物中的用途，所述藥物起 到以下任一項(xiàng)或多項(xiàng)的作用：（1)用于降低血肌酐或尿素氮水平；（2)用于減少腎臟組織中 鈣含量；（3)用于修復(fù)腎臟組織損傷；（4)用于減少腎臟組織中的結(jié)晶；（5)用于提高腎臟組 織中抗氧化劑和自由基清除劑含量；（6)用于提高腎組織中骨橋蛋白和CD44表達(dá)水平；（7) 用于提高腎組織中Calbindin-D28蛋白表達(dá)水平；（8)用于促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖；（9)用 于抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡。
[0022] 本發(fā)明的第三方面，提供了一種藥物組合物，含有前述廣金錢草提取物以及藥學(xué) 上可接受的載體。
[0023] 藥學(xué)上可接受的載體為各種藥學(xué)上常用的輔料和/或賦形劑，包括(但不限于)糖 類(如乳糖、葡萄糖和蔗糖），淀粉(如玉米淀粉和土豆淀粉），纖維素及其衍生物(如羧甲基 纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素），黃蓍膠粉末，麥芽，明膠，滑石，固體潤滑劑(如硬脂 酸和硬脂酸鎂），硫酸鈣，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油，多元 醇（如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇），海藻酸，乳化劑(如Tween、聚氧乙烯 蓖麻油），潤濕劑(如月桂基硫酸鈉），著色劑，調(diào)味劑，壓片劑、穩(wěn)定劑，抗氧化劑，防腐劑，無 熱原水，等滲鹽溶液和磷酸鹽緩沖液等;該載體可根據(jù)需要提高配方的穩(wěn)定性、活性及生物 有效性等。
[0024] 本發(fā)明藥物組合物使用時(shí)，所述廣金錢草提取物作為唯一有效成分，或者所述廣 金錢草提取物作為有效成分之一，可與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合制成 不同給藥途徑的藥物劑型。
[0025] 優(yōu)選的，所述藥物組合物的制劑形式為片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、 口服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無菌粉末，或者栓劑。上述制劑類型可 以按照藥劑學(xué)(第六版，人民衛(wèi)生出版社，崔福德）中的相關(guān)定義理解，上述制劑的制備可以 按照藥劑學(xué)(第六版，人民衛(wèi)生出版社，崔福德）中的相關(guān)制劑的方法配制。
[0026] 優(yōu)選的，所述藥物組合物的制劑形式為片劑或口服液。
[0027] 優(yōu)選的，本發(fā)明所述藥物組合物可經(jīng)過口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。
[0028] 優(yōu)選的，本發(fā)明的藥物組合物生產(chǎn)時(shí)可以通過濾膜過濾除菌，或者進(jìn)行高壓滅菌。
[0029] 廣金錢草提取物作為活性成分的有效劑量可隨給藥模式和疾病的嚴(yán)重程度而變 化。對(duì)大部分大型哺乳動(dòng)物而言，每天有效成分的服用劑量均在本領(lǐng)域技術(shù)人員或醫(yī)師所 熟知的范圍內(nèi)。
[0030] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0031]本發(fā)明通過將廣金錢草的三個(gè)部位進(jìn)行提取，采用腹腔注射乙醛酸鹽溶液制作小 鼠草酸鈣結(jié)晶模型分別研究各部位對(duì)草酸鈣結(jié)晶產(chǎn)生的作用。結(jié)果表明：廣金錢草提取物 能夠促使小鼠血肌酐、尿素氮水平顯著下降，腎臟組織鈣含量顯著下降、腎組織草酸鈣結(jié)晶 沉積及腎臟病理組織損傷均顯著減輕、CAT、CuZn-SOD、GSH、骨橋蛋白、CD44、TRPV5、 Calbindin-D28和Ki67水平顯著升高;MDA和TUNEL含量顯著降低。
【附圖說明】
[0032]圖1:各組小鼠腎臟H-E染色結(jié)果(200 X )。
[0033] 圖2:各組小鼠腎臟病理評(píng)分結(jié)果;注:與A組比較，*P〈0.05;與B組比較，#P〈0.05。
[0034]圖3:各組小鼠腎臟馮庫薩染色結(jié)果（100X)。
[0035] 圖4:各組小鼠腎臟結(jié)晶評(píng)分結(jié)果;注:與A組比較，*P〈0.05;與B組比較，#P〈0.05。
[0036]圖5:各組小鼠骨橋蛋白定量結(jié)果;注:與A組比較，*P〈0.05;與B組比較，#P〈0.05。 [0037]圖6:各組小鼠 CD44定量結(jié)果;注:與A組比較，*P〈0.05;與B組比較，#P〈0.05。
[0038] 圖7:各組小鼠腎組織TRPV5免疫組化染色結(jié)果(200X )。
[0039] 圖8 :各組小鼠腎臟TRPV5免疫組化評(píng)分結(jié)果；注：與A組比較，*P〈0.05 ;與B組比 較，#Ρ〈0·05。
[0040] 圖9:各組小鼠腎組織Calbindin-D28免疫組化染色結(jié)果(200Χ )。
[0041 ] 圖10:各組小鼠腎臟Calbindin-D28免疫組化評(píng)分結(jié)果；注：與A組比較，*P〈0.05; 與B組比較，#P〈0.05。
[0042] 圖11:各組小鼠腎組織Ki67免疫組化染色結(jié)果(200 X )。
[0043] 圖12 :各組小鼠腎臟Ki67免疫組化評(píng)分結(jié)果；注：與A組比較，*P〈0.05 ;與B組比 較，#Ρ〈0·05。
[0044] 圖13:各組小鼠腎組織TUNEL染色結(jié)果(200Χ )。
[0045] 圖14 :各組小鼠腎臟TUNEL評(píng)分結(jié)果；注：與A組比較，*Ρ〈0.05 ;與B組比較，#Ρ〈 0.05〇
【具體實(shí)施方式】
[0046]在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實(shí)施方案;還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法， 通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。
[0047] 當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端 點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明。
[0048] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng) 域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及 相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998；METH0DS IN ENZYM0L0GY,Vol.304,Chromatin(P.M.ffassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press，San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY，Vol.119,Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0049] 實(shí)施例1
[0050] 一、廣金錢草提取物的制備：
[00511以廣金錢草為原料，粉碎，用濃度為95 %乙醇水溶液滲漉或者熱回流提取，所述廣 金錢草與95 %乙醇水溶液的料液比為Ig: (5~13)ml，合并乙醇水溶液提取液，濃縮至無醇 味，獲得濃縮液。所述提取液濃縮后到無醇味指的醇的濃度小于10%。
[0052]然后將所得濃縮液用水分散，分別采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇作為萃取溶劑 進(jìn)行萃取，濃縮液與萃取溶劑之間的體積比為1:1至1:3,萃取次數(shù)為1-3次，獲得萃取液。然 后濃縮各萃取液，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位以及萃取后的水層部位(水 溶液)。
[0053] 二、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：
[0054] C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(A組）、乙醛酸鹽結(jié)晶組(B組）、石油醚部位干預(yù) 組(C組）、乙酸乙酯部位干預(yù)組(D組）、正丁醇部位干預(yù)組(E組)和剩余水溶液干預(yù)組(F組）。 A組腹腔注射100mg/kg生理鹽水，B組腹腔注射100mg/kg乙醛酸鹽，C組腹腔注射100mg/kg乙 醛酸鹽+20mL/kg石油醚部位，D組腹腔注射100mg/kg乙醛酸鹽+20mL/kg乙酸乙酯部位，E組 腹腔注射l〇〇mg/kg乙醛酸鹽+20mg/kg正丁醇部位，F(xiàn)組腹腔注射100mg/kg乙醛酸鹽+20mL/ kg剩余水溶液，連續(xù)給藥5天后，通過血生化分析儀、HE染色、馮庫薩染色檢測各組小鼠血生 化指標(biāo)、腎組織鈣含量、各組小鼠腎組織切片中草酸鈣結(jié)晶體分布及組織病理改變，同時(shí)利 用相關(guān)試劑盒、熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和免疫組化技術(shù)檢測CAT、CuZn-SOD，GSH、MDA、TRPV5、 Calbindin-D28、骨橋蛋白、CD44、Ki67 和 TUNEL 表達(dá)改變。
[0055]三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0056] 1、各組小鼠血生化指標(biāo)測定結(jié)果
[0057]為明確廣金錢草三個(gè)不同提取部位對(duì)于小鼠草酸鈣結(jié)晶模型小鼠生化指標(biāo)是否 有影響，首先測定了各組小鼠的血肌酐、尿素氮的含量。結(jié)果顯示:B組小鼠血肌酐及尿素氮 水平顯著高于對(duì)照組A組(P〈0.05); C組、D組、E組小鼠血肌酐及尿素氮水平明顯低于B組(P〈 0.05) ;F組小鼠血肌酐及尿素氮水平較對(duì)照組A組顯著升高(P〈0.05)，與B組小鼠血肌酐及 尿素氮水平無明顯差異(P>〇.05)。具體結(jié)果見表1。此結(jié)果說明B組乙醛酸鹽造腎結(jié)晶模型 成功，小鼠血肌酐、尿素氮水平明顯升高，C、D、E組小鼠血肌酐、尿素氮水平低于B組小鼠，說 明廣金錢草石油醚部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分對(duì)小鼠生化指標(biāo)有效;而F組剩余水溶 液灌胃對(duì)小鼠血肌酐、尿素氮無影響，其結(jié)果與B組相近，說明剩余水溶液對(duì)小鼠草酸鈣結(jié) 晶造模小鼠的血生化指標(biāo)沒有影響。
[0058] 表1.各組小鼠血肌酐、尿素氮含量檢測結(jié)果(7±s，n = 5)
[0060] 注:與A組比較，*P〈0.05;與B組比較，#P〈0.05 [0061 ] 2、各組小鼠腎臟組織鈣含量測定
[0062]進(jìn)一步驗(yàn)證廣金錢草三個(gè)部位對(duì)于小鼠腎臟組織中鈣含量是否有影響，分別測定 6組小鼠腎臟組織中的鈣含量，結(jié)果顯示B組小鼠腎臟組織鈣含量顯著高于對(duì)照組A組(P〈 0.05); C組、D組、E組小鼠腎臟組織鈣含量明顯低于B組(P〈0.05); F組小鼠腎臟組織鈣含量 較對(duì)照組A組顯著升高(P〈0.05)，與B組小鼠腎臟組織鈣含量無明顯差異(P>0.05)。具體結(jié) 果見表2。其結(jié)果說明廣金錢草石油醚部分、乙酸乙酯部分和正丁醇部分可以有效減少草酸 鈣結(jié)晶小鼠腎臟組織中鈣含量，而剩余水溶液對(duì)小鼠草酸鈣結(jié)晶模型小鼠腎臟組織中鈣含 量沒有影響。
[0063] 表2.各組小鼠腎臟組織鈣含量檢測結(jié)果(T±s，n = 5)
[0065] 注:與A組比較，*P〈0.05;與B組比較，#P〈0.05
[0066] 3、各組小鼠腎臟組織病理損傷
[0067]利用H-E染色各組小鼠腎臟組織切片驗(yàn)證廣金錢草三個(gè)提取部位對(duì)于小鼠腎臟組 織形態(tài)結(jié)構(gòu)是否有影響。在光學(xué)顯微鏡下觀察6組小鼠腎臟組織病理切片，結(jié)果顯示:B組、F 組腎臟皮髓質(zhì)充血明顯，間質(zhì)水腫，大量炎細(xì)胞浸潤，腎小管腔體積明顯增大，同時(shí)腎小管 內(nèi)上皮細(xì)胞腫脹及變性壞死脫落;C組、D組、E組腎臟皮髓質(zhì)充血程度輕，間質(zhì)輕度水腫，少 許炎細(xì)胞浸潤，腎小管腔體積輕度增大，同時(shí)可見少許腎小管內(nèi)上皮細(xì)胞腫脹及變性壞死 脫落。病理評(píng)分結(jié)果為:B組腎臟病理評(píng)分顯著高于對(duì)照組A組(P〈0.05) ;C組、D組、E組小鼠 腎臟病理評(píng)分明顯低于B組（P〈0.05) ;F組小鼠腎臟病理評(píng)分較對(duì)照組A組顯著升高（P〈 0.05)，與B組小鼠腎臟病理評(píng)分無明顯差異(P>0.05)。（見圖1、圖2)結(jié)果說明乙醛酸鹽造模 草酸鈣結(jié)晶小鼠和剩余水溶液灌胃小鼠的腎臟組織損害較嚴(yán)重，而廣金錢草石油醚部分、 乙酸乙酯部分和正丁醇部分灌胃對(duì)小鼠腎臟組織有明顯修復(fù)作用。
[0068] 4、各組小鼠腎臟組織結(jié)晶沉淀
[0069]利用馮庫薩染色各組小鼠腎臟組織切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠腎臟結(jié)晶 情況，結(jié)果顯示:B組、F組較A組小鼠腎小管腔中出現(xiàn)大量黑色鈣鹽結(jié)晶體;C組、D組、E組小 鼠腎小腔中出現(xiàn)少量黑色鈣鹽結(jié)晶體。溶液沉淀評(píng)分結(jié)果為:B組腎臟結(jié)晶評(píng)分顯著高于對(duì) 照組A組(P〈0.05); C組、D組、E組小鼠腎臟結(jié)晶評(píng)分明顯低于B組(P〈0.05);F組小鼠腎臟結(jié) 晶評(píng)分較對(duì)照組A組顯著升高(P〈0.05)，與B組小鼠腎臟結(jié)晶評(píng)分無明顯差異(P>0.05)。（見 圖3、圖4)結(jié)果說明乙醛酸鹽造模B組小鼠結(jié)晶較多，廣金錢草石油醚部分、乙酸乙酯部分和 正丁醇部分灌胃對(duì)小鼠腎臟組織的結(jié)晶有明顯減少，剩余水溶液灌胃對(duì)腎臟組織結(jié)晶無明 顯作用。
[0070] 5 ·各組小鼠腎組織CAT、CuZn-SOD、GSH和MDA含量測定
[0071] 結(jié)果顯示B組小鼠腎臟組織CAT、CuZn-SOD、GSH含量顯著低于對(duì)照組A組(P〈0.05)， 而MDA含量顯著高于對(duì)照組A組(P〈0.05); C組、D組、E組小鼠腎臟組織CAT、CuZn-SOD、GSH含 量明顯高于B組(P〈0.05)，而MDA含量顯著低于對(duì)照組A組(P〈0.05); F組小鼠腎臟組織CAT、 CuZn-S0D、GSH和MDA含量較對(duì)照組A組顯著升高（P〈0.05)，與B組小鼠腎臟組織CATXuZn-S0D、GSH和MDA含量無明顯差異(P>0.05)。具體結(jié)果見表3。結(jié)果說明乙醛酸鹽造模草酸鈣結(jié) 晶小鼠和剩余水溶液灌胃小鼠腎組織抗氧化劑和自由基清除劑含量下降，氧自由基產(chǎn)物升 高；而廣金錢草石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位灌胃對(duì)腎臟組織抗氧化劑和自由 基清除劑含量有恢復(fù)作用。
[0072] 表3各組小鼠腎組織CAT、CuZn-SOD、GSH和MDA活性測定(?±8, η = 5)
[0074] 注:與A組比較，*P〈0.05;與B組比較，#P〈0.05
[0075] 6、各組小鼠腎組織骨橋蛋白和⑶44含量的測定
[0076] 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示B組小鼠腎臟組織骨橋蛋白和⑶44含量顯著高于對(duì)照 組A組(P〈0.05); C組、D組、E組小鼠腎臟組織骨橋蛋白和CD44含量較B組明顯降低(P〈0.05); F組小鼠腎臟組織骨橋蛋白和⑶44含量較對(duì)照組A組顯著升高(P〈0.05)，與B組小鼠腎臟組 織骨橋蛋白和CD44含量無明顯差異(P>0.05)(見圖5和圖6)。結(jié)果說明乙醛酸鹽造模草酸鈣 結(jié)晶小鼠和剩余水溶液灌胃小鼠腎組織骨橋蛋白和CD44表達(dá)下降；而廣金錢草石油醚部 位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位灌胃對(duì)腎組織中骨橋蛋白和⑶44表達(dá)有恢復(fù)作用。
[0077] 7、各組小鼠腎組織TRPV5蛋白表達(dá)
[0078] 免疫組化染色結(jié)果顯示B組小鼠腎臟組織T R P V 5含量顯著低于對(duì)照組A組（P〈 0.05); C組、D組、E組小鼠腎臟組織TRPV5含量較B組明顯升高(P〈0.05);F組小鼠腎臟組織 TRPV5含量較對(duì)照組A組顯著升高(P〈0.05)，與B組小鼠腎臟組織相比無明顯差異(P>0.05)。 (見圖7和圖8)
[0079] 8、各組小鼠腎組織Calbindin_D28蛋白表達(dá)
[0080] 免疫組化染色結(jié)果顯示B組小鼠腎臟組織Calbindin-D28含量顯著低于對(duì)照組A組 (P〈0.05);C組、D組、E組小鼠腎臟組織Calbindin-D28含量較B組明顯升高(P〈0.05) ;F組小 鼠腎臟組織Calbindin-D28含量較對(duì)照組A組顯著降低(P〈0.05)，與B組小鼠腎臟組織相比 無明顯差異(P>〇. 05)。（見圖9和圖10)
[0081 ] 10、各組小鼠腎小管上皮細(xì)胞增殖分析
[0082] 免疫組化染色結(jié)果顯示B組小鼠腎臟組織Ki67染色強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組A組(P〈 0.05); C組、D組、E組小鼠腎臟組織Ki67染色強(qiáng)度較B組明顯升高(P〈0.05);F組小鼠腎臟組 織Ki67染色強(qiáng)度較對(duì)照組A組顯著降低(P〈0.05)，與B組小鼠腎臟組織相比無明顯差異(P> 0.05)(見圖11和圖12)。結(jié)果說明乙醛酸鹽造模草酸鈣結(jié)晶小鼠和剩余水溶液灌胃抑制腎 小管上皮細(xì)胞增殖；而廣金錢草石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位灌胃對(duì)腎小管上 皮細(xì)胞增殖具有恢復(fù)和促進(jìn)作用。
[0083] 12、各組小鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡分析
[0084] TUNEL染色結(jié)果顯示B組小鼠腎臟組織TUNEL染色強(qiáng)度顯著高于對(duì)照組A組（P〈 0.05);C組、D組、E組小鼠腎臟組織TUNEL染色強(qiáng)度較B組明顯降低(P〈0.05);F組小鼠腎臟組 織TUNEL染色強(qiáng)度較對(duì)照組A組顯著升高(P〈0.05)，與B組小鼠腎臟組織相比無明顯差異(P> 0.05)(見圖13和圖14)。結(jié)果說明乙醛酸鹽造模草酸鈣結(jié)晶小鼠和剩余水溶液灌胃促進(jìn)腎 小管上皮細(xì)胞凋亡；而廣金錢草石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位灌胃對(duì)腎小管上 皮細(xì)胞凋亡具有抑制作用。
[0085]以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制， 應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出 若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員， 在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容而做出的些許更 動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì) 上述實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍 內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 廣金錢草提取物在制備泌尿性結(jié)石治療藥物中的用途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述泌尿性結(jié)石為腎臟結(jié)石。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述結(jié)石為草酸鈣結(jié)石。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述藥物起到以下任一項(xiàng)或多項(xiàng)的作用： (1)用于降低血肌酐或尿素氮水平；（2)用于減少腎臟組織中鈣含量；（3)用于修復(fù)腎臟組織 損傷；（4)用于減少腎臟組織中的結(jié)晶；（5)用于提高腎臟組織中抗氧化劑和自由基清除劑 含量；（6)用于提高腎組織中骨橋蛋白和⑶44表達(dá)水平；（7)用于提高腎組織中Calbindin-D28蛋白表達(dá)水平；（8)用于促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖；（9)用于抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述廣金錢草提取物為廣金錢草經(jīng)提取溶 劑提取制得的提取物。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述廣金錢草提取物采用包括下列步驟的 方法制得：以廣金錢草為原料，用提取溶劑提取，然后采用萃取溶劑進(jìn)行萃取，獲得廣金錢 草提取物。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述綠萼梅提取物制備時(shí)，滿足下列條件 中的任一項(xiàng)或多項(xiàng)： (1) 所述提取溶劑選用乙醇水溶液； (2) 所述萃取溶劑選自石油醚、乙酸乙酯或正丁醇中的任一種。8. 廣金錢草提取物在制備藥物中的用途，所述藥物起到以下任一項(xiàng)或多項(xiàng)的作用：（1) 用于降低血肌酐或尿素氮水平；（2)用于減少腎臟組織中鈣含量；（3)用于修復(fù)腎臟組織損 傷；（4)用于減少腎臟組織中的結(jié)晶；（5)用于提高腎臟組織中抗氧化劑和自由基清除劑含 量；（6)用于提高腎組織中骨橋蛋白和⑶44表達(dá)水平；（7)用于提高腎組織中Calbindin-D28 蛋白表達(dá)水平；（8)用于促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞增殖；（9)用于抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡。9. 一種藥物組合物，含有廣金錢草提取物以及藥學(xué)上可接受的載體。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物組合物，其特征在于，所述廣金錢草提取物為唯一有效 成分或有效成分之一。
【文檔編號(hào)】A61P13/12GK105982930SQ201610614237
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2016年7月29日
【發(fā)明人】錢勇, 諶衛(wèi), 董昕, 郭志勇, 婁子洋, 辛振強(qiáng), 張?zhí)镉? 謝天培
【申請(qǐng)人】上海詩丹德生物技術(shù)有限公司, 上海長海醫(yī)院, 上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司