槐角苷抗布氏田鼠生育的新方法
【專利摘要】以槐角苷為活性成分的抗雌性布氏田鼠生育滅鼠劑,屬于生物防治技術(shù)領(lǐng)域。布氏田鼠主要棲息于植被退化的草場上,種群繁殖力強,各年度與季節(jié)間的數(shù)量變動幅度很大,繁殖速度快,對草原植被的破壞力很強,是畜牧業(yè)的大敵,是內(nèi)蒙古草原主要鼠害之一,鼠害問題不僅嚴重破壞了生態(tài)環(huán)境,而且威脅著人類的健康。長久以來,人們采用多種方法對其種群數(shù)量加以控制,其中運用抗生育技術(shù)對害鼠種群數(shù)量進行控制是近些年發(fā)展起來的一項新技術(shù)。本發(fā)明涉及一種以槐角苷為活性成分的雌性不育滅鼠劑用于控制布氏田鼠繁殖。相較于傳統(tǒng)的生態(tài)滅鼠法及化學毒餌法,抗生育技術(shù)具有作用時間長、控制效果明顯、環(huán)境毒副作用小等優(yōu)點,能更有效地抑制害鼠種群的超補償性效應。本發(fā)明若能應用于農(nóng)林牧業(yè)生產(chǎn),將能有效控制害鼠種群數(shù)量,具有廣闊的經(jīng)濟效益。
【專利說明】
槐角苷抗布氏田鼠生育的新方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于控制害鼠布氏田鼠的抗生育滅鼠劑,具體的說是涉及一種以槐角苷為活性成分的雌性不育劑用于控制害鼠布氏田鼠繁殖,主要涉及槐角苷影響布氏田鼠胚胎著床數(shù)目來控制其繁殖的新方法?!颈尘凹夹g(shù)】
[0002]因草原鼠害損失的牧草量占15%-20%,重災年份則會高達44%。草原鼠害的發(fā)生-草場土壤肥力下降,水份大量流失,草地的生產(chǎn)力降低,造成雜草滋生及草地沙漠化,環(huán)境急劇惡化,呈現(xiàn)逐年擴增的趨勢。
[0003]布氏田鼠分布于中國內(nèi)蒙古中東部地區(qū),遼寧等地,主要棲息于植被退化的草場上,種群繁殖力強,各年度與季節(jié)間的數(shù)量變動幅度很大,繁殖速度快,對草原植被的破壞力很強,是畜牧業(yè)的大敵,是內(nèi)蒙古草原主要鼠害之一。
[0004]目前,草原鼠害防治仍主要使用化學滅鼠劑來防治害鼠。而化學滅鼠劑具有成二次中毒,產(chǎn)生抗藥、耐藥以及環(huán)境污染等一系列嚴重問題,使得傳統(tǒng)的鼠害防治方法已經(jīng)不能滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)發(fā)展的要求。生物源性抗生育劑因為其具備特異性高,資源豐富、 無環(huán)境污染,對生態(tài)環(huán)境影響小且能有效控制害鼠等優(yōu)點在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)的害鼠生物防治上展現(xiàn)出了廣闊的應用前景。
[0005]槐角苷主要來源于豆科植物槐樹的果實(槐角),槐角中異黃酮及其苷類成分非常豐富,槐角苷作為槐角中最主要的異黃酮成分之一被廣大科學工作者進行了大量的研究,動物實驗闡明了槐角苷呈現(xiàn)出雌激素樣活性,具有顯著的抗生育作用。
[0006]由于前期實驗室探究了槐角苷對ICR小白鼠的抗生育效果,結(jié)果顯示該藥物可明顯降低受孕ICR小鼠的子宮胚胎著床數(shù)量,即大大降低小白鼠的受孕率,具有相當明顯的抗生育效果。有了前期的進展,就為我們下一步的開展提供了實驗支持,我們欲探究植物源性異黃酮成分槐角苷對草原一大害鼠布氏田鼠的抗生育效果,力求為草原害鼠生育率的控制提供一種生態(tài)、高效的新方法,希望為我國草原鼠害的防治提供一種了新的方法,這對我國農(nóng)林牧業(yè)鼠害的防治具有一定的生態(tài)意義與經(jīng)濟意義。
[0007]本發(fā)現(xiàn)以槐角中其中一種異黃酮成分槐角苷為藥物材料,對草原害鼠布氏田鼠的進行急性毒性實驗,再依據(jù)急性毒性實驗結(jié)果,對布氏田鼠的抗生育效果進行探究,發(fā)現(xiàn)該藥物確實能夠通過降低布氏田鼠的胚胎著床數(shù)目而具有明顯的抗生育作用,降低布氏田鼠的生育率,進一步的實驗為槐角苷對布氏田鼠的抗生育作用效果提供了充分的證據(jù),該發(fā)現(xiàn)為將槐角苷開發(fā)成植物源性不育劑提供足夠的理論支持,也為草原鼠害的防治提供了一種新方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)現(xiàn)主要是發(fā)現(xiàn)了一種新藥物對布氏田鼠具有顯著的抗生育效果,旨在對草原害鼠布氏田鼠的繁殖率、數(shù)量進行控制,為其防治提供一種新方法。
[0009]本發(fā)現(xiàn)通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)。[〇〇1〇]本發(fā)現(xiàn)是用槐角中的異黃酮成分槐角苷對懷孕布氏田鼠進行喂藥處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)槐角苷能夠明顯降低布氏田鼠的胚胎著床數(shù)目,從而降低害鼠布氏田鼠的繁殖率,降低其數(shù)量。然后利用組織學的研究方法對槐角苷對布氏田鼠的抗生育效果進行進一步探討,對其抗生育的具體機制進行初步探索。槐角苷是一種中藥成分,不會造成環(huán)境破壞等一系列問題,為鼠害的防控提供了一種新方法。
[0011]1藥物材料及實驗動物實驗用槐角苷,純度98%,HPLC,批號:QY-HJG201210040,購自西安清樂生物科技有限公司。實驗用布氏田鼠捕捉自內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟錫林浩特市東烏珠穆沁旗,皆為幼鼠,以鼠籠盒雌雄分開喂養(yǎng)于內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟錫林浩特市毛登牧場中國科學院動物研究所草原動物生態(tài)研究站實驗室內(nèi)至性成熟,自然光照,室溫,通風良好,供以充足的鼠糧及水,選擇健康,達到性成熟的雄鼠及無懷孕跡象的雌鼠備用。
[0012]2急性毒性實驗方法預實驗:參照文獻,槐角苷對小鼠的最大致死濃度為l〇〇〇mg/kg左右,依據(jù)此具體實驗方法如下,將實驗用布氏田鼠分為4組,每組4只,雌雄各半,1個空白組和3個染毒劑量組,于實驗室內(nèi)自然光照,室溫,通風良好,供以充足的鼠糧及水的條件下喂養(yǎng)一周,觀察各組實驗用布氏田鼠有無異常,如無異常,將實驗用槐角苷用0.5%羧甲基纖維素鈉配置成不同濃度槐角苷懸液,接著按照空白對照組(0 mg/kg同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉)、800mg/kg、 400011^/1^、2000011^/1^/(^7的給藥方式進行給藥,將實驗用槐角苷用0.5%羧甲基纖維素鈉配置成不同濃度槐角苷懸液,于某天早上9點對實驗用布氏田鼠進行灌胃,空白對照組灌以同體積的〇.5%羧甲基纖維素鈉懸液,自灌胃時刻其的7天內(nèi),觀察實驗用布氏田鼠的死亡情況,統(tǒng)計數(shù)據(jù)。依據(jù)預實驗所得到的實驗數(shù)據(jù),將備用布氏田鼠分為分為6組,每組6只,雌雄各半,分別為1個空白對照組和5個染毒劑量組,將實驗用槐角苷用0.5%羧甲基纖維素鈉配置成不同濃度槐角苷懸液,分別為 〇mg/kg、4000mg/kg、6000mg/kg、9000mg/kg、13500mg/kg、 20000mg/kg,空白對照組以同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉代替,將各組老鼠于實驗室內(nèi)自然光照,室溫,通風良好,供以充足的鼠糧及水的條件下喂養(yǎng)一周,觀察各組實驗用布氏田鼠有無異常,如無異常,于一周后的第一天早上9點對各組布氏田鼠按照預先設(shè)定的槐角苷濃度進行灌胃,自灌胃時刻起的7天內(nèi),觀察實驗用布氏田鼠的死亡情況,統(tǒng)計數(shù)據(jù),用改良寇氏法公式對槐角苷對布氏田鼠的LD50進行計算,最終得到其LD50大約為10715mg/kg。 [〇〇13]3抗生育效果實驗方法依據(jù)槐角苷對布氏田鼠的急性毒性實驗所得到的數(shù)據(jù),按照等比數(shù)列的方法設(shè)置各個槐角苷給藥濃度,將實驗備用的布氏田鼠雌雄分開進行一周喂養(yǎng),觀察布氏田鼠采食和飲水有無異常,然后按照雌雄2:1的比例進行合籠,次日早上進行妊娠檢查(陰栓檢查法)根據(jù)檢查結(jié)果確認已受孕為妊娠第一天(D1),將受孕田鼠分為5組,每組10只,分別為三個槐角苷染毒實驗組(用0.5%羧甲基纖維素鈉將槐角苷配置成預先設(shè)計的三個濃度劑量),分別為,一個陽性對照組(用0.5%羧甲基纖維素鈉將炔雌醚配置成預先設(shè)計濃度劑量)、一個空白對照組(以同樣的方法給予相同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉),灌胃劑量為0.2ml/10g,自 D1起分別對各劑量組于每天早上9:00進行經(jīng)口灌胃給藥,連續(xù)給藥7天(D7),第10天(D10) 解剖檢驗,統(tǒng)計各組胚胎數(shù)量、稱量子宮及各臟器的重量,計算出各組胚胎平均數(shù)量并用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,統(tǒng)計實驗組與各對照組的胚胎著床是否有統(tǒng)計學差異, 以P〈0.05為有統(tǒng)計學意義。與空白未經(jīng)藥物處理的布氏田鼠組相比,經(jīng)槐角苷灌胃處理的布氏田鼠子宮胚胎數(shù)目隨著槐角苷濃度的增大而顯著降低,且差異性顯著,結(jié)果表明,槐角苷對布氏田鼠具有顯著的抗生育作用效果,即可以達到降低其繁殖率,降低種群數(shù)量。
[0014]4組織保存將實驗解剖所得到的布氏田鼠子宮組織部分保存于動物組織RNA保護液,部分保存于組織固定液(4%多聚甲醛)中帶回實驗室,再將其轉(zhuǎn)移到冰箱中保存?zhèn)溆茫M行下一步實驗探究。
[0015]5 HE染色實驗分析用HE染色實驗對布氏田鼠的子宮組織進行病理組織學組織形態(tài)觀察。HE結(jié)果表明與空白組的布氏田鼠子宮相比,經(jīng)過槐角苷藥物處理的布氏田鼠的子宮結(jié)構(gòu)中子宮內(nèi)膜腔上皮的厚度明顯,腺體增多,間質(zhì)細胞明顯減少,子宮腔上皮有損傷,有明顯的組織病理學增生, 說明槐角苷藥物的處理對布氏田鼠的子宮組織造成了傷害。[0〇16]6掃描電子顯微鏡(SEM)用SEM掃描電鏡技術(shù)對布氏田鼠子宮組織子宮內(nèi)膜表面進行觀察,主要是對子宮內(nèi)膜表面微絨毛及胞飲突進行觀察分析。SEM結(jié)果表明,跟空白組相比較,藥物處理組的子宮內(nèi)膜胞飲突大量減少、排列也是相當?shù)幕靵y,散亂的分布在子宮內(nèi)膜表面上,子宮內(nèi)膜容受性是指內(nèi)膜對胚胎的接受能力,子宮內(nèi)膜上的胞飲突異常,進而導致胚胎著床失敗。
[0017]7免疫組織化學實驗分析用免疫組織化學染色實驗技術(shù)對布氏田鼠子宮中相關(guān)蛋白的表達進行分析,相關(guān)的蛋白主要是胚胎著床過程中扮演至關(guān)重要角色的蛋白,如ERa,PR等。IHC結(jié)果表明,與正常狀態(tài)下懷孕布氏田鼠相比,經(jīng)槐角苷處理組布氏田鼠子宮的ERa、PR、MMP2表達水平都顯著降低,與空白組相比較,槐角苷處理組的E-caderin在子宮中的表達顯著增加,總之,子宮中在胚胎著床過程中扮演重要角色的蛋白其表達水平相較于正常狀態(tài)下的布氏田鼠子宮都出現(xiàn)了異常表達,其蛋白出現(xiàn)異常表達,其胚胎著床過程也就不能正常運作了,從而導致了胚胎著床失敗。
[0018]本發(fā)現(xiàn)與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點。
[0019]1槐角苷屬于植物源性中藥材,其健康、生態(tài)、來源廣泛,槐角苷的使用不會對環(huán)境造成污染、二次中毒等相關(guān)問題。
[0020]2草原鼠害是對草原在不斷開發(fā)利用過程中逐漸出現(xiàn)的嚴重的生態(tài)學問題,布氏田鼠是草原上典型的一大害鼠,其對草原的破壞力相當大的,也給農(nóng)業(yè)帶來了很大的麻煩, 而槐角苷能夠通過影響布氏田鼠的胚胎著床過程從而影響其生育過程,這是一個可觀的發(fā)現(xiàn),也是一個非常有意義的發(fā)現(xiàn),為槐角苷的開發(fā)利提供了理論證據(jù),也為草原鼠害的防治提供了一種新方法?!靖綀D說明】
[0021]圖1圖2槐角苷對布氏田鼠胚胎著床數(shù)量的影響圖1槐角苷對布氏田鼠胚胎著床的影響;A:空白對照組布氏田鼠胚胎著床情況;B、C、D: 槐角苷藥物處理組布氏田鼠胚胎著床情況;E:經(jīng)過藥物槐角苷處理過的未懷孕布氏田鼠的子宮角腫大(雌激素樣所用);F:經(jīng)過藥物槐角苷處理過的懷孕布氏田鼠子宮的胚胎受損傷情況圖3圖4布氏田鼠子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的HE染色圖圖3槐角苷對布氏田鼠子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的影響;A子宮腔;B:子宮腔上皮;C:腺體細胞;D: 間質(zhì)細胞;E:槐角苷藥物處理組的布氏田鼠子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)圖(200 X );F:槐角苷藥物處理組的布氏田鼠子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)圖(400 X )圖5圖6圖7圖8布氏田鼠子宮內(nèi)相關(guān)蛋白表達水平的IHC圖圖9布氏田鼠子宮內(nèi)膜表面的SEM圖
[0022]實例 1:選用純度為98%的槐角苷為不育劑藥物,以受孕第一天的雌性布氏田鼠小鼠為研究對象,以450mg/kg/day的劑量連續(xù)灌胃給藥7天,發(fā)現(xiàn)胚胎著床平均數(shù)量與對照組相比明顯減少。
[0023]實例2:選用純度為98%的槐角苷為不育劑藥物,以受孕第一天的雌性布氏田鼠為研究對象,以 900mg/kg/day的劑量連續(xù)灌胃給藥7天,發(fā)現(xiàn)胚胎著床平均數(shù)量與對照組相比明顯減少。
[0024]實例3:選用純度為98%的槐角苷為不育劑藥物,以受孕第一天的雌性布氏田鼠為研究對象,以 1800mg/kg/day的劑量連續(xù)灌胃給藥7天,發(fā)現(xiàn)胚胎著床平均數(shù)量與對照組相比顯著減少, 且具有顯著的統(tǒng)計學意義(P〈〇.05)。病理學研究發(fā)現(xiàn),槐角苷處理后子宮內(nèi)膜病理學增生、 厚度增加,子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,子宮內(nèi)影響胚胎著床的關(guān)鍵受體ERa的表達水平顯著降低(P〈0.05),PR的表達水平顯著降低(P〈0.05)。實驗結(jié)果為槐角苷對雌性布氏田鼠具有顯著的抗生育效果。
【主權(quán)項】
1.一種抗生育滅鼠劑,其特征在于,所述抗生育滅鼠劑是以槐角苷作為活性組分的抗 生育劑。2.權(quán)利要求1所述的抗生育滅鼠劑,其特征在于,所述鼠類為害鼠布氏田鼠。3.權(quán)利要求1或2中所述的抗生育滅鼠劑,其特征在于,所述槐角苷主要來源于豆科植 物槐樹的果實槐角,尼泊爾黃花木莖,漆樹科植物寬葉尚乳香葉等。4.一種滅鼠方法,其特征在于,通過使用權(quán)利要求1-3任一項所述的抗生育滅鼠劑,控 制害鼠布氏田鼠的生育及其種群的數(shù)量。5.權(quán)利要求4所述的方法,包括在布氏田鼠繁殖開始或繁殖期內(nèi),每鼠每天按照450 mg/kg-2000mg/kg體重進行口服/灌胃給藥的方法,連續(xù)給藥6-7天,即可控制雌性鼠類生育 及其數(shù)量。
【文檔編號】A61K31/7048GK105943546SQ201610310073
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月12日
【發(fā)明人】張 杰, 張興利, 謝晨文, 丁仁芳, 劉筱雪
【申請人】四川大學