用于治療和預(yù)防轉(zhuǎn)移癌的藥物組合物和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了可用于預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的分離的肽、其片段和衍生物以及包含其的藥物組合物。
【專利說明】
用于治療和預(yù)防轉(zhuǎn)移癌的藥物組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本公開大體上涉及轉(zhuǎn)移癌治療學。 現(xiàn)有技術(shù)
[0002] 被認為作為與本發(fā)明所公開的主題相關(guān)的【背景技術(shù)】的參考文獻列于下文中：
[0003] [1]卩;[01'；[0?1&，八.和61<11^，0.2013卩1'0111:16『8；[11?115^;[010區(qū)7 4(論文311):1-120
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[0012] 在本文對上述參考文獻的承認不應(yīng)當被推斷為意味著這些參考文獻以任何方式 與本發(fā)明所公開的主題的可專利性有關(guān)。
【背景技術(shù)】
[0013]
[0014] 根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization)，在2008年在世界范圍內(nèi)有760 萬人死于癌癥。公知的是，癌癥是與可影響身體的任何部位的一大組疾病相關(guān)的通用術(shù)語。 癌癥的一個定義性特征是異常細胞的快速形成，這些細胞生長超越它們通常的邊界，然后 可能侵襲身體的鄰近部位并且通過被稱為轉(zhuǎn)移的過程擴散到其它器官中。
[0015] 轉(zhuǎn)移是癌癥死亡的主要原因，并且依賴于兩個關(guān)鍵的過程:癌細胞癌細胞侵襲到 相鄰組織中的細胞迀移，繼而內(nèi)滲到血管/淋巴管和腫瘤脈管系統(tǒng)中，這提供了進入血流的 通道(1)。已知癌癥轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多步過程，所述過程使得癌癥在整個身體內(nèi)擴散并且 有時需要與被選用于治療原發(fā)癌的方法不同的治療方法。
[0016] 舉例來說，在作為最常見的癌癥之一的結(jié)腸直腸癌中，約50%的結(jié)腸直腸癌患者 在他們的疾病過程中的某一時刻產(chǎn)生肝臟轉(zhuǎn)移(2)。作為手術(shù)切除肝臟轉(zhuǎn)移的候選者的患 者可以期望延長的生存期或甚至治愈。令人遺憾的是，只有10%至25%的患者是肝臟切除 術(shù)的候選者并且在有不可切除的轉(zhuǎn)移的患者中，化療是首選治療。
[0017] 在癌癥中對治療的完全響應(yīng)通常被定義為在成像時靶病灶的消失。然而，如由 Benoist，S.等(2)所報道，在超過25%的病例中，在手術(shù)探查期間在基于成像被認為已經(jīng)消 失的肝臟轉(zhuǎn)移的部位處發(fā)現(xiàn)肉眼可見的殘留疾病。此外，在手術(shù)時沒有明顯疾病的患者中， 在來自80%患者的最初肝臟轉(zhuǎn)移的部位的所切除的樣品中觀測到細微的癌。最終，在沒有 更多的腫瘤被觀測到并且完全響應(yīng)部位被留在原處的患者中，在1年后在74%的病例中觀 測到原位復(fù)發(fā)。
[0018] 這些數(shù)據(jù)證實了盡管在成像時所看到的完全響應(yīng)可能是用于評價化療的功效的 有用的標準，但是它在大多數(shù)情況下并不意味著癌癥的治愈。此外，雖然某些類型的轉(zhuǎn)移癌 是作為慢性疾病被治療的，從而延長了患者的生命，但是許多類型的轉(zhuǎn)移癌仍被認為是不 能治愈的。
[0019] 人胸腺特有的cDNA編碼的被稱作"T10Γ的肽被鑒定出。這種肽特別參與到經(jīng)由它 作為免疫系統(tǒng)的刺激物的作用來治療癌癥(W02006/046239,3)。冊2006/046239證實T101 能夠刺激免疫系統(tǒng)并且減小腫瘤尺寸，這表明所述肽影響了癌細胞的增殖。使用T101治療 癌癥還在W0 2007/122622(4)中被提出，該文獻特別證實了T101對各種類型的腫瘤發(fā)展的 作用。肽T101還在W0 2007/091240(5)中被描述為與治療免疫疾病有關(guān)，并且在W0 2008/ 075349(6)中被描述為與治療或預(yù)防涉及具有T1/ST2受體的細胞的疾病有關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 通過本發(fā)明的各方面中的一個方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組 合物包含含有氨基酸序列SEQ ID N0:3的分離的肽或所述分離的肽的任何功能片段或衍生 物，用于預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的方法中。
[0021] 通過本發(fā)明的另外的方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含 含有氨基酸序列SEQ ID N0:3的分離的肽或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物，用于 在癌癥患者中減少癌細胞運動性、預(yù)防或抑制血管生成、或者在癌癥患者中降低血管內(nèi)皮 生長因子(VEGF)的水平的方法中。
[0022] 通過本發(fā)明的各方面中的又另一個方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移 的方法，所述方法包括向有需要的癌癥患者施用藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有 效量的含有氨基酸序列SEQ ID N0: 3的分離的肽或所述分離的肽的任何功能片段或衍生 物。
[0023] 在另外的方面，本發(fā)明提供了一種在癌癥患者中減少癌細胞運動性、預(yù)防或抑制 血管生成、或降低癌癥患者的血清中VEGF的水平的方法，所述方法包括向被診斷為患有具 有轉(zhuǎn)移潛能的癌癥的癌癥患者施用藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的含有氨 基酸序列SEQ ID N0:3的分離的肽或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物。
[0024]在一些實施方案中，如本文所限定的分離的肽含有氨基酸序列SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2、或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物。
[0025]在其它實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的分離的肽由氨基酸序列SEQ ID N0:3組成。
[0026]在另外的實施方案中，如本文所限定的分離的肽含有SEQ ID N0:3的修飾的氨基 酸序列，其中一個或多個氨基酸殘基通過保守替代被置換，與具有氨基酸序列SEQ ID N0:3 的未修飾的肽相比，所述保守替代沒有顯著影響修飾的肽的生物學特征。
[0027]在具體實施方案中，如本文所限定的分離的肽含有SEQ ID N0:3的修飾的氨基酸 序列，其中一個或多個氨基酸殘基被相應(yīng)的D-氨基酸殘基置換。
[0028]在另外的具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的分離的肽含有氨基酸序列SEQ ID N0:4。
[0029]在再另外的實施方案中，如本文所限定的分離的肽由氨基酸序列SEQ ID N0:4組 成。
[0030] 在上述和其它實施方案中，本發(fā)明涉及一種癌癥，所述癌癥是轉(zhuǎn)移癌。
[0031] 在一些實施方案中，所述轉(zhuǎn)移癌選自由以下各項組成的組:胰腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸 直腸癌、結(jié)腸腺癌、直腸腺癌、乳腺癌、皮膚癌、肺癌、非小細胞肺癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、甲 狀腺癌、前列腺癌、腺癌、頭頸部癌、胃腸道癌、胃癌、小腸癌、梭形細胞瘤、肝癌(hepatic carcinoma)、肝臟癌（liver cancer)以及女性生殖道的惡性腫瘤。
[0032] 在另外的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的供使用的藥物組合物適用于與至少一種另外 的抗癌治療一起施用。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的方法進一 步包括向所述癌癥患者施用至少一種另外的抗癌治療。
[0033] 在其它實施方案中，如本文所限定的至少一種另外的癌癥治療選自由以下各項組 成的組:抗血管生成劑、細胞毒性劑、化療劑、激素治療、放療以及免疫治療。
[0034] 在另外的其它實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的供使用的藥物組合物和方法如下，其中 所述施用是通過選自由以下各項組成的組的途徑實現(xiàn)的：靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、經(jīng) 皮、局部、關(guān)節(jié)內(nèi)、結(jié)膜下、□服、鼻內(nèi)以及眼內(nèi)。
【附圖說明】
[0035] 為了更好地理解本文所公開的主題以及為了舉例說明如何可以在實踐中實施所 述主題，現(xiàn)將僅通過非限制性實例的方式并參考附圖來描述實施方案，其中：
[0036]圖1:在BrdU摻入測定中所測定的Nerofe肽（lμg/ml-50μg/ml)對人類腺癌胰腺癌 細胞增殖的作用的圖表表示(上線）。下部條形圖示出了 Nerofe肽（lμg/ml-50μg/ml)對人類 腺癌胰腺癌細胞向細胞培養(yǎng)基中分泌組織纖溶酶原激活物(TPA)的能力的作用。縮寫:TPA: 組織纖溶酶原激活物;BrdU:溴脫氧尿苷；以及細胞系1、細胞系2和細胞系3:人類腺癌胰腺 癌細胞。
[0037]圖2:是在BrdU摻入測定中所測定的Nerofe肽（lμg/ml-50μg/ml)對人類腺癌胰腺 癌細胞增殖的作用的圖表表示(上線）。下部條形圖示出了 Nerofe肽（lμg/ml-50μg/ml)對人 類腺癌胰腺癌細胞的sST2分泌的作用。縮寫：sST2:可溶性ST2;BrdU:溴脫氧尿苷；以及細胞 系1、細胞系2和細胞系3:人類腺癌膜腺癌細胞。
[0038]圖3A-圖3D:是在細胞迀移測定開始時（圖3A和圖3B)以及在開始迀移測定后的27 小時之時（圖3C和圖3D)所拍攝的人類腺癌胰腺癌細胞的顯微照片。在開始測定前將細胞在 25μg/ml的Nerofe肽存在下（圖3B和圖3D)或在不存在所述肽的情況下（圖3A和圖3C)孵育48 小時。
[0039]圖4:是條形圖，所述條形圖示出了使用人類腺癌胰腺癌細胞進行的細胞迀移測定 中無細胞面積百分比，在開始所述細胞迀移測定前將所述細胞在25μg/ml的Nerofe肽存在 下孵育48小時。進行兩次獨立的測定（T1和T2)。用于四次獨立測定中的對照細胞由C0N1、 C0N1、C0N3以及C0N4指示。無細胞面積百分比是通過用在開始實驗后的27小時之時所獲得 的無細胞面積除以在開始實驗后的1小時之時所獲得的無細胞面積來計算的。
[0040]圖5:接受了 6mg/m2(每公斤體重0.16mg，虛線）或12mg/m2(每公斤體重0.32mg，實 線）的肽Nerof e施用的患者在所示的時間點的血清VEGF水平的圖表表示?？s寫：pt002、 pt004、pt007、pt011:患有結(jié)腸癌的患者;pt005:患有結(jié)腸直腸癌的患者；以及pt006:具有 梭形細胞瘤癌癥的患者。
[0041 ]圖6:接受了 24mg/m2 (每公斤體重0 · 64mg，虛線）或48mg/m2 (每公斤體重1 · 28mg，實 線）的肽Nerof e施用的患者在所示的時間點的血清VEGF水平的圖表表示?？s寫:ptO 12:患有 胰腺癌的患者;pt013:患有小腸癌的患者;pt015:患有非小細胞肺癌的患者;pt016:患有肝 癌的患者;ptO 17:患有結(jié)腸腺癌的患者；以及ptO 19:患有直腸腺癌的患者。
【具體實施方式】
[0042] 本發(fā)明是基于以下的觀測結(jié)果:具有氨基酸序列Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu Trp Glu Arg Lys的其中全部氨基酸殘基呈其D構(gòu)型的肽在本文被稱作 "Nerofe"，該肽減少了癌細胞的已知與癌癥轉(zhuǎn)移有關(guān)的蛋白質(zhì)（即組織纖溶酶原激活物 (TPA)和可溶性ST2(sST2))的分泌。這種肽被證實在體外直接抑制癌細胞的迀移。此外，所 述肽被證實降低了癌癥患者的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的血清水平。
[0043]基于在暴露于Nerofe肽后癌細胞的TPA和sST2的分泌減少、所述肽在體外對癌細 胞的迀移能力的直接作用、以及基于在癌癥患者中所觀測到的Nerofe肽對VEGF的血清水平 的作用，本發(fā)明提供了 Nerofe肽抑制癌癥轉(zhuǎn)移的方法和用途。
[0044] 因此，在本發(fā)明的各個方面之一個方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物 組合物包含含有氨基酸序列SEQ ID N0: 3的分離的肽、或所述分離的肽的任何功能片段或 衍生物，用于預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的方法中。
[0045] 如本文所定義的術(shù)語"肽"指的是氨基酸殘基的分子鏈，如果需要的話，該分子鏈 可以在它的氨基酸殘基中的每一個處被修飾，例如通過甘露糖基化(manosylation)、糖基 化、酰胺化(例如C末端酰胺）、羧化或磷酸化而被修飾。所述肽可以通過合成、經(jīng)由遺傳工程 化方法、在宿主細胞中表達、或經(jīng)由任何其它合適的手段而獲得。用于產(chǎn)生肽的方法是本領(lǐng) 域公知的。
[0046] 術(shù)語"分離"指的是諸如氨基酸序列或肽的分子從它們的自然環(huán)境中被取出、分離 或分開。
[0047] 如本文所用的術(shù)語"氨基酸"指的是天然存在的氨基酸殘基和合成氨基酸殘基、以 及以類似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的 氨基酸是由遺傳密碼編碼的那些、以及隨后被修飾的那些氨基酸，例如羥脯氨酸、γ-羧基 谷氨酸、以及〇-磷酸絲氨酸。
[0048] 術(shù)語氨基酸還涵蓋了 D-氨基酸，它們是L-氨基酸的鏡像，其中在碳α處手性已經(jīng)反 轉(zhuǎn)。D-氨基酸對蛋白酶介導的降解具有高度的抗性并且具有低免疫原性反應(yīng)。
[0049]術(shù)語"氨基酸序列"或"肽序列"還涉及其中由肽鍵連接的氨基酸殘基位于肽和蛋 白質(zhì)中的鏈中的順序。序列一般是從含有游離氨基的Ν末端向含有游離羧基的C末端報道 的。
[0050] 如下文所舉例說明，在本文被稱作"Nerofe"的肽具有序列Trp Trp Thr Phe Phe LeuProSerThrLeuTrpGluArgLys，其中全部氨基酸殘基呈其D構(gòu)型（由SEQIDN0:4表 示），該肽被證實減少了癌細胞的TPA和sST2的分泌并且直接抑制癌細胞的迀移，這表明了 它在抑制癌癥轉(zhuǎn)移方面的潛能。
[0051]具有氨基酸序列Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu Trp Glu Arg Lys、其中全部氨基酸殘基均為L型氨基酸殘基的肽（在本文由SEQ ID N0:3表示）是WO 2006/046239(3)中所述的被稱作"完整T101肽"的肽的C末端片段。
[0052]完整T101肽是具有84個氨基酸的長度的序列，在本文由SEQ ID NO: 1表示。它的N 末端的33個氨基酸的信號肽的缺失產(chǎn)生了在本文由SEQ IDN0: 2表示并且被稱作"T101肽" 的肽片段。T101肽具有51個氨基酸的長度。氨基酸序列SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0: 2以及 SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4詳述于下表1中。
[0053]
[0054] 表1:肽的氨基酸序列
[0055]根據(jù)本發(fā)明的分離的肽至少包含在本文被稱作"完整Τ101肽"的肽的連續(xù)C末端片 段，例如但不限于由SEQ ID Ν0:3表示的氨基酸序列，該氨基酸序列是完整Τ101肽的C末端 的14個氨基酸殘基的片段。
[0056]在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的分離的肽包含完整Τ101肽的連續(xù)C末端片段，所 述片段包含來自完整Τ101肽（由SEQ ID NO: 1表示）的C末端的至少10個、11個、12個、13個、 14 個、15 個、16 個、17 個、18 個、19 個、20 個、21 個、22 個、23 個、24 個、25 個、26 個、27 個、28 個、29 個、30個、31個、32個、33個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44 個、45個、46個、47個、48個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59 個、60個、61個、62個、63個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74 個、75個、76個、77個、78個、79個、80個、81個、82個、83個或84個氨基酸殘基。
[0057]特別地說，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語"分離的肽"指的是包含由SEQ ID N0:3表示的氨基 酸序列的分離的肽、或所述分離的肽的任何功能片段和衍生物。在一些實施方案中，根據(jù)本 發(fā)明的分離的肽是如下文所定義的完整T101肽(具有SEQ ID NO: 1)或所述分離的肽的任何 功能片段和衍生物。在其它實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的分離的肽是缺少N末端33個氨基酸的 胸腺肽T101(具有SEQ ID N0:2)或所述分離的肽的任何功能片段和衍生物。
[0058]術(shù)語"包含/含有"意指根據(jù)本發(fā)明的分離的肽不僅包含由SEQ ID N0:3或SEQ ID NO 4表示的肽，還可以在由SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4表示的肽的N末端或C末端處包含另 外的氨基酸殘基，例如但不限于根據(jù)本發(fā)明的分離的肽可以包含由SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2表示的序列，如下文所詳述。
[0059] 因此，在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的供使用的藥物組合物涉及一種含有如由 SEQIDN0:3所表不的氨基酸序列TrpTrpThrPhePheLeuProSerThrLeuTrpGlu Arg Lys的分離的肽、或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物。
[0060] 在其它實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的供使用的藥物組合物是其中所述分離的肽含有 氨基酸序列SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2、或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物。
[0061] 在另外的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的供使用的藥物組合物是其中所述分離的肽由 氨基酸序列SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物組成。
[0062] 在再另外的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的供使用的藥物組合物是其中所述分離的肽 由氨基酸序列SEQ ID N0:3組成。
[0063] 如本文所限定的分離的肽的衍生物和修飾的肽也由本發(fā)明所涵蓋。術(shù)語"修飾"、 "衍生物"或"分離的肽的衍生物"意指包括如下的肽，所述肽在整體序列中有一個或多個氨 基酸不同，即，具有缺失、替代(例如至少一個氨基酸通過保守替代被另一個氨基酸置換）、 倒位或添加。這個術(shù)語還涵蓋了整體序列中的至少一個氨基酸殘基被它的對應(yīng)的D型氨基 酸殘基置換。
[0064] 舉例來說，肽Nerofe(由SEQIDN0:4表示)具有氨基酸序列SEQIDN0:3，其中所 有的氨基酸殘基已經(jīng)被它們相應(yīng)的D型氨基酸置換。
[0065] 氨基酸"替代"是將一個氨基酸置換為具有相似的結(jié)構(gòu)和/或化學特性的另一個氨 基酸即保守氨基酸置換的結(jié)果。氨基酸替代可以基于所涉及的殘基在極性、電荷、溶解度、 疏水性、親水性、和/或兩親性質(zhì)上的相似性來進行。舉例來說，以下八組中的每一組含有對 于彼此來說是保守替代的氨基酸：
[0066] 1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);
[0067] 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);
[0068] 3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);
[0069] 4)精氨酸(R)、賴氨酸(K);
[0070] 5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V);
[0071 ] 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);
[0072] 7)絲氨酸(S)、蘇氨酸(T);以及
[0073] 8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)。
[0074]如本文所限定的肽的片段也包括在本發(fā)明中。術(shù)語"片段"指的是比根據(jù)本發(fā)明的 分離的肽短至少一個氨基酸的任何肽，通過使至少一個氨基酸殘基從根據(jù)本發(fā)明的肽中缺 失而獲得。
[0075]確切地說，根據(jù)本發(fā)明的包含完整T101肽（由SEQ ID NO: 1表示）的分離的肽的片 段可以是來自完整T101肽的C末端的至少約10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、 18 個、19 個、20 個、21 個、22 個、23 個、24 個、25 個、26 個、27 個、28 個、29 個、30 個、31 個、32 個、33 個、34個、35個、36個、37個、38個、39個、40個、41個、42個、43個、44個、45個、46個、47個、48 個、49個、50個、51個、52個、53個、54個、55個、56個、57個、58個、59個、60個、61個、62個、63 個、64個、65個、66個、67個、68個、69個、70個、71個、72個、73個、74個、75個、76個、77個、78 個、79個、80個、81個、82個、83個或84個氨基酸殘基的片段。
[0076]本發(fā)明所包括的分離的肽的具體的修飾的肽是包含SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、 SEQ ID NO:3以及SEQ ID NO:4的修飾的氨基酸序列的分離的肽，其中一個或多個氨基酸殘 基通過保守替代被置換，分別與具有氨基酸序列SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3 以及SEQ ID N0:4的未修飾的肽相比，所述保守替換沒有顯著影響修飾的肽的生物學特征。 [0077] 在一些實施方案中，SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、SEQIDN0:3以及SEQIDN0:4的 修飾的氨基酸序列分別與相應(yīng)序列SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3以及SEQ ID NO:4具有至少70%、優(yōu)選地80%、更優(yōu)選地90%、特別是100%的同一性。
[0078] 根據(jù)本發(fā)明的肽衍生物還涵蓋了包含氨基酸序列SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的任何融合蛋白或綴合物，以及經(jīng)由殘基中的至少一個與另外的藥 劑(例如穩(wěn)定劑、抗血管生成劑、細胞毒性劑等)偶聯(lián)的如本文所限定的任何分離的肽。
[0079] 修飾的片段也由本發(fā)明所囊括。舉例來說，修飾的片段可以是如下的肽，所述肽包 含來自完整T101肽的C末端的至少10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55 個、60個、65個、70個、75個或至少80個氨基酸殘基的連續(xù)序列，所述連續(xù)序列與完整T101肽 中所包含的至少10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70 個、75個或至少80個氨基酸殘基的相應(yīng)序列具有至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少 90 %并且特別是至少100 %的同一性程度。
[0080] 應(yīng)當了解的是，這些肽片段或衍生物不得改變原始肽的生物活性。術(shù)語"功能"或 "與未修飾的肽相比沒有顯著影響修飾的肽的生物學特征"意在表示所述修飾的肽保留了 從定性上與所述未修飾的肽類似的生物活性。
[0081] 術(shù)語"生物學特征"在涉及本發(fā)明的分離的肽時涵蓋了抑制癌細胞迀移、降低組織 型纖溶酶原激活物(TPA)的分泌水平、降低癌細胞中可溶性ST2的分泌水平以及降低VEGF的 分泌水平。
[0082] 為了確定某個肽是否保留了它的從性質(zhì)上類似于未修飾的肽的生物學特征，可以 進行一種或多種測定，例如像其中將修飾的肽與被并行測定的相應(yīng)的未修飾的肽相比較的 體外實驗、體內(nèi)實驗或臨床實驗;或其中對修飾的肽進行測定以研究它是否具有與未修飾 的肽的生物效應(yīng)類似的生物效應(yīng)(如通過單獨進行的實驗所獲知）的實驗?？梢岳缫韵挛?實施例中所述的方式進行這樣的實驗。
[0083] 在一些具體的實施方案中，本發(fā)明涉及功能片段、衍生物或修飾的肽，其中所述功 能片段、衍生物或修飾的肽具有如下的氨基酸序列，所述氨基酸序列與本發(fā)明的未修飾的 分離的肽的氨基酸序列即與由SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4表 示的氨基酸序列之一至少70%、優(yōu)選地至少80%、更優(yōu)選地至少90%并且特別是至少95% 同一。
[0084] 在其它實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的供使用的藥物組合物是其中所述分離的肽包含 其中一個或多個氨基酸殘基通過保守替代被置換的SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的修飾的 氨基酸序列，分別與具有氨基酸序列SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的未修飾的肽相比，所述 保守替代沒有顯著影響所述修飾的肽的生物學特征。
[0085] 在另外的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的供使用的藥物組合物是其中所述分離的肽包 含其中一個或多個氨基酸殘基通過保守替代被置換的SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的修飾 的氨基酸序列，分別與具有氨基酸序列SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的未修飾的肽相比，所 述保守替代沒有顯著影響所述修飾的肽的生物學特征，其中所述修飾的氨基酸序列分別與 具有氨基酸序列SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的未修飾的肽的氨基酸序列至少70%、優(yōu)選地 至少80 %、更優(yōu)選地至少90 %并且特別是至少95 %同一。
[0086] 在再另外的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的供使用的藥物組合物是其中所述分離的肽 包含其中一個或多個氨基酸殘基被相應(yīng)的D-氨基酸殘基置換的SEQ ID N0:3的修飾的氨基 酸序列。
[0087] 在再另外的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的供使用的藥物組合物是其中所述分離的肽 包含氨基酸序列SEQ ID N0:4。
[0088] 在又另外的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的供使用的藥物組合物是其中所述分離的肽 由氨基酸序列SEQ ID N0:4組成。
[0089] 如下文所舉例說明，在本文被稱作"Nerofe"的肽被證實直接抑制胰腺癌細胞和乳 腺癌細胞的細胞運動性或迀移。癌細胞從它們的原始位點迀移到體內(nèi)不同的位置的能力是 癌癥轉(zhuǎn)移中的基本步驟之一。
[0090] 如本文所定義的術(shù)語"癌癥轉(zhuǎn)移"指的是癌癥從其最初產(chǎn)生的位置擴散或迀移到 體內(nèi)另一位置或部位的過程。術(shù)語癌癥轉(zhuǎn)移還指由轉(zhuǎn)移癌細胞在與所述轉(zhuǎn)移癌細胞的原始 位點不同的位置處形成的腫瘤。由轉(zhuǎn)移癌細胞形成的腫瘤也被稱作轉(zhuǎn)移性腫瘤。
[0091] 癌細胞轉(zhuǎn)移通常包括以下步驟:癌細胞向鄰近正常組織的局部侵襲；內(nèi)滲，借此癌 細胞侵襲并且移動穿過鄰近的淋巴管壁或血管壁;癌細胞經(jīng)由淋巴系統(tǒng)和血流循環(huán)到身體 其它部位;停滯和外滲，借此癌細胞停滯在遠端位置處的小血管中，然后侵襲毛細血管壁并 且迀移到周圍組織中（外滲）；癌細胞在遠端位置處增殖以形成被稱為微轉(zhuǎn)移的小腫瘤；以 及血管生成，微轉(zhuǎn)移刺激新血管生長以獲得血液供應(yīng)。癌癥轉(zhuǎn)移的最常見的部位是骨、肝 臟、肺以及腦。
[0092] 本發(fā)明涵蓋了可以形成轉(zhuǎn)移或二次生長的任何癌癥疾病。
[0093] 預(yù)測哪些類型的癌癥最終將產(chǎn)生轉(zhuǎn)移可以由熟練的醫(yī)師（例如專攻腫瘤學的醫(yī) 師)進行。癌癥的轉(zhuǎn)移潛能的預(yù)測特別是基于癌癥的總體階段，包括尺寸、深度、以及淋巴結(jié) 是否被累及。其它指標可以是腫瘤分級以及基因和蛋白質(zhì)測試。
[0094] 鑒定或診斷癌癥轉(zhuǎn)移可以由熟練的醫(yī)師、例如通過密切注意諸如骨痛、持續(xù)咳嗽、 以及頭痛等可能是轉(zhuǎn)移癌的體征的癥狀的出現(xiàn)來進行。此外，轉(zhuǎn)移癌可以通過常規(guī)的掃描 如血液檢查、成像(例如X射線、正電子發(fā)射斷層攝影術(shù)以及計算機斷層攝影術(shù)(PET/CT)、磁 共振成像(MRI)、骨掃描、MRI以及CT)以及通常進行以確認疑似診斷的活檢來檢測。
[0095] 因此，在一些實施方案中，本發(fā)明涉及一種癌癥，所述癌癥被分類為"轉(zhuǎn)移癌"，即 本領(lǐng)域已知具有轉(zhuǎn)移潛能的任何癌癥類型。
[0096] 因此，在上述和其它實施方案中，由本發(fā)明所涵蓋的癌癥是轉(zhuǎn)移癌。
[0097]在具體的實施方案中，如本文所限定的轉(zhuǎn)移癌選自由以下各項組成的組:胰腺癌、 結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、結(jié)腸腺癌、直腸腺癌、乳腺癌、皮膚癌、肺癌、非小細胞肺癌、腎癌、多發(fā) 性骨髓瘤、甲狀腺癌、前列腺癌、腺癌、頭頸部癌、胃腸道癌、胃癌、小腸癌、梭形細胞瘤、肝癌 (hepatic carcinoma)、肝臟癌（liver cancer)以及女性生殖道的惡性腫瘤。
[0098]如所附實施例中所示，在以24mg/m2或48mg/m2(以體表面積單位給出并且分別轉(zhuǎn)換 成每公斤體重約〇.64mg或約1.28mg)的劑量向癌癥患者施用肽Nerofe時，VEGF的血清水平 降低了約SO^IO^^VEGF的血清水平的降低對于患有小腸和直腸腺癌的癌癥患者來說是 特別有意義的。
[0099]如本領(lǐng)域已知的是，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是由刺激血管發(fā)生和血管生成的細 胞產(chǎn)生的信號蛋白。VEGF的正常功能是在胚胎發(fā)育期間形成新的血管、在損傷后形成新的 血管、在運動后形成肌肉、以及形成新的血管以繞過阻塞的血管。已知的是，VEGF的過表達 可以導致疾病。由于實體癌癥在沒有充足的血液供應(yīng)的情況下不能生長超出有限的尺寸， 因此可以表達VEGF的癌癥才能夠生長和轉(zhuǎn)移。
[0?00] 所觀測到的由于向癌癥患者施用肽Nerofe而引起的VEGF血清水平的降低是 Nerofe肽的明確的抗血管生成作用。
[0101]因此，通過本發(fā)明的各個方面中的另一個方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所 述藥物組合物包含如本文所限定的分離的肽，用于預(yù)防或抑制癌癥患者的血管生成的方法 中。
[0102] 在一個具體的實施方案中，所述血管生成是腫瘤相關(guān)的血管生成。在另一個具體 的實施方案中，所述血管生成與VEGF有關(guān)。
[0103] 在具體的實施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含含有 氨基酸序列SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的分離的肽或所述分離的肽的任何功能片段或衍 生物，用于預(yù)防或抑制血管生成的方法中。
[0104] 在另外的具體的實施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包 含由氨基酸序列SEQ ID N0: 3或SEQ ID N0:4組成的分離的肽或所述分離的肽的任何功能 片段或衍生物，用于預(yù)防或抑制血管生成的方法中。
[0105] 如本領(lǐng)域已知的是，術(shù)語"血管生成"指的是新血管形成的過程并且涉及各種生理 過程以及病理過程，包括傷口修復(fù)、繁殖、對缺血的響應(yīng)、關(guān)節(jié)炎、銀肩病、視網(wǎng)膜病、實體腫 瘤生長以及轉(zhuǎn)移性腫瘤擴散。血管生成是一個高度受控的過程，它依賴于促進因子和抑制 因子這兩者的復(fù)雜的平衡。
[0106] 術(shù)語"預(yù)防或抑制血管生成"意指血管生成至少約1 %、5 %、10 %、15%、20%、 25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 約100 %的任何限制、延緩、減輕、減少或減弱。
[0107] 術(shù)語預(yù)防或抑制血管生成還意指預(yù)防或抑制任何新血管形成，包括但不限于抑制 血管發(fā)生（內(nèi)皮細胞由中胚層細胞前體的從頭形成）。
[0108] 如本文所限定的分離的肽對血管生成的作用可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來 監(jiān)測，例如通過成像或通過監(jiān)測與血管生成相關(guān)的生理標志物(例如血管內(nèi)皮生長因子）。
[0109] 如本領(lǐng)域已知和如上文所示的那樣，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是刺激包括內(nèi)皮細 胞迀移、管形成和增殖的促血管生成特性的促有絲分裂因子。認識到VEGF是病理狀態(tài)下血 管生成的主要刺激物已經(jīng)促使各種嘗試以阻斷VEGF活性。
[0110] 不希望受理論所束縛，如圖6中所示，所觀測到的由于向癌癥患者施用肽Nerofe所 引起的VEGF血清水平的降低表明了 Nerofe肽的抗血管生成作用。
[0111] 因此，在本發(fā)明的各個方面中的又另一個方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所 述藥物組合物包含如本文所限定的分離的肽，用于降低癌癥患者的VEGF水平的方法中。
[0112] 可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法對接受如本文所限定的分離的肽施用的癌癥患 者的VEGF水平進行測量，例如通過在用如本文所限定的分離的肽開始治療之前以及在治療 期間和之后的多個時間點從所述患者獲得生物樣品（例如血液)來測量?？梢宰裱绢I(lǐng)域公 知的程序來測定這些生物樣品中VEGF的水平。
[0113] 當在用如本文所限定的分離的肽開始治療后從癌癥患者獲得的一個或多個生物 樣品中VEGF的血清水平低于在開始治療之前從癌癥患者獲得的一個或多個生物樣品中 VEGF的血清水平時，觀測到VEGF水平的降低。
[0114]接受如本文所限定的分離的肽施用的癌癥患者的血液中VEGF的血清水平的任何 降低均由本發(fā)明所涵蓋。在具體的實施方案中，VEGF的血清水平可以降低至少約1 %、5%、 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、90%、95% 或約 100%。
[0115] 在具體的實施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含含有 氨基酸序列SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的分離的肽或所述分離的肽的任何功能片段或衍 生物，用于降低VEGF水平的方法中。
[0116] 在具體的實施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含由氨 基酸序列SEQ ID N0: 3或SEQ ID N0:4組成的分離的肽或所述分離的肽的任何功能片段或 衍生物，用于降低VEGF水平的方法中。
[0117]在另外的實施方案中，本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)移癌，所述轉(zhuǎn)移癌與VEGF的過表達有關(guān)。 舉例來說，如本文所限定的轉(zhuǎn)移癌可以是但不限于胰腺癌、小腸癌、直腸腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸 直腸癌、梭形細胞瘤、非小細胞肺癌、肝癌以及直腸腺癌。
[0118] 在另外的具體實施方案中，本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)移癌，所述轉(zhuǎn)移癌是胰腺癌、乳腺 癌、小腸癌或直腸腺癌。
[0119] 如本領(lǐng)域已知的是，如本文所定義的術(shù)語"胰腺癌"指的是構(gòu)成胰腺(位于胃后面 的腺器官）的細胞不受控制的生長。這些癌細胞具有侵襲或擴散到身體其它部位的能力。存 在許多不同類型的胰腺癌，但是胰腺腺癌占病例的約85%。
[0120] 如本文所定義以及如本領(lǐng)域已知的術(shù)語"乳腺癌"指的是在乳房組織中形成的癌 癥。乳腺癌的最常見的類型是導管癌，它起始于輸乳管的內(nèi)層。乳腺癌的另一種類型是小葉 癌，它起始于乳房的小葉(乳腺）。侵襲性乳腺癌是如下的乳腺癌，所述乳腺癌已經(jīng)從它在乳 腺導管或小葉中起始之處擴散到周圍正常的組織。
[0121] 如本領(lǐng)域已知的是，術(shù)語"小腸癌"是一種罕見的疾病，其中惡性癌細胞在小腸的 組織中形成。
[0122] 術(shù)語"直腸腺癌"指的是癌細胞在直腸組織中形成的疾病。腺癌占結(jié)腸癌和直腸癌 的絕大多數(shù)（98%)并且較罕見的直腸癌包括淋巴瘤（1.3%)、類癌（0.4%)、以及肉瘤 (0.3%)〇
[0123] 在另外的具體實施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含 含有氨基酸序列SEQ ID N0:4的分離的肽、或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物，用于 預(yù)防或治療胰腺癌或乳腺癌轉(zhuǎn)移的方法中。
[0124] 在再另外的具體實施方案中，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包 含由氨基酸序列SEQ ID N0:4組成的分離的肽、或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物， 用于預(yù)防或治療胰腺癌轉(zhuǎn)移的方法中。
[0125] 用于根據(jù)本發(fā)明的方法使用的藥物組合物的預(yù)期用途是預(yù)防或治療有需要的受 試者的癌癥轉(zhuǎn)移。
[0126] 因此，在一些實施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明的方法使用的藥物組合物旨在預(yù)防被 診斷為患有癌癥的患者形成癌癥轉(zhuǎn)移。在這些情況下，本發(fā)明的藥物組合物本身可以被施 用或與作為"預(yù)防"計劃或輔助計劃的其它抗癌劑組合施用，所述"預(yù)防"計劃或輔助計劃待 與施用于被診斷為患有癌癥的個體施用的主要治療一起施用。所述主要治療可以是例如手 術(shù)和/或化療。
[0127] 術(shù)語"輔助治療"指的是除了初級、主要或初步治療之外所給予的治療。當前已知 的向癌癥患者施用的輔助治療的一些非限制性實例是化療、激素治療、生物治療、放療、或 其組合，這取決于癌癥的類型。輔助治療被設(shè)計成降低未來轉(zhuǎn)移的風險，但是并不保證不復(fù) 發(fā)。
[0128] 因此，在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的供使用的藥物組合物是其中所述藥物組 合物適用于與至少一種另外的抗癌治療一起施用。
[0129] 即，在本發(fā)明的各個方面之一方面，本發(fā)明提供了用于治療被診斷為患有癌癥的 受試者(癌癥患者）的方法和藥物組合物，所述方法和藥物組合物任選地與初級、主要或初 步治療組合，以預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的產(chǎn)生。
[0130] 根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物的施用可以在至少一種另外的抗癌治療的施用之前、同 時或之后進行。
[0131] 如本文所定義的術(shù)語"至少一種另外的抗癌治療"指的是本領(lǐng)域已知的任何抗癌 治療，例如但不限于抗血管生成劑、細胞毒性劑、化療劑(例如烷化劑、抗代謝物、拓撲異構(gòu) 酶抑制劑以及細胞毒性抗生素）、激素治療（例如用于治療乳腺癌的他莫昔芬 (Tamoxifen))、放療以及免疫治療(例如基于細胞的治療、抗體治療或細胞因子治療）。
[0132] 如本文所定義的術(shù)語"抗血管生成劑"指的是抑制新血管生長(血管生成）的物質(zhì)。 抑制血管生成的藥劑的一些非限制性實例是減少促血管生成因子的產(chǎn)生的藥劑以及VEGF 通路的抑制劑等等。VEGF通路抑制劑可以是例如酪氨酸激酶抑制劑以及針對VEGF或VEGFR 的抗體，如與VEGF結(jié)合并且抑制它與VEGF受體結(jié)合的貝伐單抗(Be va c i z umab)(阿瓦斯汀 (Avastin))〇
[0133] 因此，在上述和其它實施方案中，所述至少一種另外的癌癥治療選自由以下各項 組成的組:抗血管生成劑、細胞毒性劑、化療劑、激素治療、放療以及免疫治療。
[0134] 如本文所定義的術(shù)語"預(yù)防"意指對被診斷為患有癌癥的個體(癌癥患者）的癌癥 轉(zhuǎn)移的形成的任何限制、延緩、減輕、減少、阻止、抑制、阻礙或壓制，其中所述癌癥可以任選 地被診斷為轉(zhuǎn)移癌。
[0135] 如本文所定義的術(shù)語預(yù)防意指被診斷為患有癌癥的個體的癌癥轉(zhuǎn)移的形成至少 約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、 80%、85%、90%、95%、或約100%的任何限制、延緩、減輕、減少、阻止、抑制、阻礙或壓制。
[0136] 本發(fā)明還提供了如本文所限定的用于治療癌癥轉(zhuǎn)移的方法中的藥物組合物。換句 話說，根據(jù)本發(fā)明的方法還可以用于"治療癌癥轉(zhuǎn)移"，這在本文被定義為在癌癥患者中診 斷出癌癥轉(zhuǎn)移后防止轉(zhuǎn)移癌細胞的繼續(xù)或進一步擴散。
[0137] 如本文所定義的術(shù)語"癌癥患者"或"有需要的癌癥患者"因此指的是被診斷為患 有癌癥特別是轉(zhuǎn)移癌的溫血動物，特別是人類。術(shù)語"治療(treat )"、"治療(treatment)"或 其各種形式意指預(yù)防、抑制、阻止或緩解患者的疾病或病況。
[0138] 對癌癥轉(zhuǎn)移形成的阻止、抑制、阻礙或壓制的水平可以通過在本發(fā)明的分離的肽 存在下進行合適的測定以實驗方式來評價，如本領(lǐng)域已知的那樣。對癌癥轉(zhuǎn)移形成的阻止、 抑制、阻礙或壓制的水平的臨床評價可以由熟練的醫(yī)師來進行，例如如上文所述。
[0139] 所述藥物組合物或根據(jù)本發(fā)明的供使用的藥物組合物可以根據(jù)良好醫(yī)療實踐來 施用和給予，例如通過腸胃外、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射全身給藥。在另一個實施例中，所 述藥物組合物可以通過任何合適的途徑被引入到部位中，所述途徑包括靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng) 皮、局部、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、結(jié)膜下、或粘膜，例如口服、鼻內(nèi)、或眼內(nèi)施用。
[0140] 在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的施用是通過選自由以下各項組成的組的途徑實 現(xiàn)的:靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、局部、關(guān)節(jié)內(nèi)、結(jié)膜下、口服、鼻內(nèi)以及眼內(nèi)。
[0141 ]如下文所舉例說明，肽"Nerofe"被證實直接抑制了胰腺癌細胞的細胞運動性。
[0142] 因此，在本發(fā)明的各個方面中的另一個方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述 藥物組合物包含含有氨基酸序列SEQ ID N0:3的分離的肽、或所述分離的肽的任何功能片 段或衍生物，用于減少癌細胞運動性的方法中。
[0143] 在一些實施方案中，如本文所限定的藥物組合物用于減少被診斷為患有具有轉(zhuǎn)移 潛能的癌癥的癌癥患者的癌細胞運動性的方法中。
[0144] 術(shù)語"減少癌細胞運動性"意指對癌細胞從它們的位置進行迀移的能力的任何部 分或完全抑制、減弱或降低?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法，例如通過下文所舉例說明的 細胞迀移測定來監(jiān)測癌細胞迀移。
[0145]如本文所定義的術(shù)語"組合物"或"藥物組合物"一般包含活性劑，所述活性劑是根 據(jù)本發(fā)明的分離的肽；以及緩沖劑、調(diào)節(jié)其滲透壓的試劑、和任選的如本領(lǐng)域已知的至少一 種藥學上可接受的載體、賦形劑和/或添加劑中的至少一種。
[0146] 根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物可以根據(jù)醫(yī)藥行業(yè)公知的常規(guī)技術(shù)來制備。這樣的技術(shù) 包括使活性成分與藥學上可接受的一種或多種載體、一種或多種賦形劑或一種或多種添加 劑締合的步驟。
[0147] 舉例來說，如本文所用的術(shù)語"藥學上可接受的載體"包括如本領(lǐng)域公知的任何和 所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細菌劑以及抗真菌劑。每一種載體應(yīng)當在與其它成分相容以 及對患者無害的意義上是藥學上和生理學上可接受的。
[0148] 藥學上可接受的載體可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇以及液 體聚乙二醇等）、其合適的混合物以及植物油的溶劑或分散介質(zhì)。
[0149] 還可以將補充或附加的活性成分例如另外的抗癌劑并入到本發(fā)明的藥物組合物 中。
[0150] 應(yīng)當了解的是，在考慮到所討論的制劑的類型的情況下，除了上文特別提到的成 分之外，制劑還可以包括本領(lǐng)域中常規(guī)的其它試劑，例如適用于口服施用的那些制劑可以 包括調(diào)味劑。
[0151] 因此，在上述和其它實施方案中，所述藥物組合物和根據(jù)本發(fā)明的供使用的藥物 組合物進一步包含至少一種藥學上可接受的載體、賦形劑和/或添加劑。
[0152] 通過本發(fā)明的各個方面中的另一個方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移 的方法，所述方法包括向有需要的癌癥患者施用藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有 效量的包含氨基酸序列SEQ ID N0.3的分離的肽或所述分離的肽的任何功能片段或衍生 物。
[0153] 在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的方法是其中所述如本文 所限定的分離的肽包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2或所述分離的肽的任何功 能片段或衍生物。
[0154]在其它實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的方法是其中所述分離的 肽由氨基酸序列SEQ ID NO: 1或SEQ ID N0:2或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物組 成。
[0155] 在另外的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的方法是其中所述分離 的肽由氨基酸序列SEQ ID N0:3組成。
[0156] 在再另外的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的方法是其中所述分 離的肽包含SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的修飾的氨基酸序列，其中一個或多個氨基酸殘基 通過保守替代被置換，分別與具有氨基酸序列SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的未修飾的肽相 比，所述保守替代沒有顯著影響所述修飾的肽的生物學特征。
[0157] 在又另外的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的方法是其中所述分 離的肽包含SEQ ID N0:3的修飾的氨基酸序列，其中一個或多個氨基酸殘基被相應(yīng)的D-氨 基酸殘基置換。
[0158] 在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的方法是其中所述分離的 肽包含氨基酸序列SEQ ID N0:4。
[0159] 在一些實施方案中，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包 括向有需要的癌癥患者施用藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的由氨基酸序列 SEQ ID N0:4組成的分離的肽。
[0160] 在其它實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的方法是其中所述方法進 一步包括向所述癌癥患者施用如本文所限定的至少一種另外的抗癌治療。
[0161 ]本發(fā)明進一步提供了一種減少癌細胞運動性的方法，所述方法包括向被診斷為患 有具有轉(zhuǎn)移潛能的癌癥的癌癥患者施用藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的包 含氨基酸序列SEQ ID N0.3的分離的肽或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物。
[0162] 在本發(fā)明的各個方面中的另一個方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)防或抑制癌癥患者的 血管生成的方法，所述方法包括向有需要的癌癥患者施用藥物組合物，所述藥物組合物包 含治療有效量的包含氨基酸序列SEQ ID N0:3的分離的肽或所述分離的肽的任何功能片段 或衍生物。
[0163] 通過本發(fā)明的各個方面中的再另一個方面，本發(fā)明提供了一種降低有需要的癌癥 患者的血清中VEGF的水平的方法，所述方法包括向所述癌癥患者施用藥物組合物，所述藥 物組合物包含治療有效量的包含氨基酸序列SEQ ID NO:3的分離的肽或所述分離的肽的任 何功能片段或衍生物。
[0164] 在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的減少癌細胞運動性的方法、預(yù)防或抑制血管生 成的方法或降低有需要的癌癥患者的血清中VEGF的水平的方法是其中所述藥物組合物包 含治療有效量的包含氨基酸序列SEQ ID N0:4的分離的肽。
[0165] 在其它實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的減少癌細胞運動性的方法、預(yù)防或抑制血管生 成的方法或降低有需要的癌癥患者的血清中VEGF的水平的方法是其中所述藥物組合物包 含治療有效量的由氨基酸序列SEQ ID N0:4組成的分離的肽。
[0166] 根據(jù)本發(fā)明的用于本文所限定的目的的分離的肽的"一個治療有效量"（或多個治 療有效量)是通過本領(lǐng)域已知的這樣的考慮因素來確定以治療、預(yù)防、抑制、阻止或緩解癌 癥轉(zhuǎn)移。
[0167] 根據(jù)本發(fā)明的分離的肽或包含其的藥物組合物可以單次劑量或分多次劑量以治 療有效量向有需要的患者施用。
[0168] 施用如本文所限定的分離的肽或包含其的藥物組合物的給藥方案和給藥時間表 可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員基于本領(lǐng)域已知的考慮因素例如但不限于遵循下表3中所匯總的臨 床測定來確定。
[0169] 如本文所限定的治療方法和供使用的藥物組合物旨在抑制、阻止或減慢癌癥轉(zhuǎn)移 的進展。監(jiān)測如本文所限定的分離的肽的治療作用（或癌癥患者對如本文所限定的治療的 響應(yīng)性)可以由熟練的醫(yī)師定期進行，例如通過評估所有的腫瘤以及跟蹤它們的尺寸和轉(zhuǎn) 移或通過跟蹤癌癥患者的如本領(lǐng)域已知的癌癥轉(zhuǎn)移的癥狀，例如如上文所述來進行。
[0170] 舉例來說，確定癌癥患者對包括施用如本文所限定的供使用的藥物組合物的治療 的響應(yīng)性可以通過跟蹤來自含有細胞的生物樣品的癌癥轉(zhuǎn)移特異性標志物來進行，所述標 志物例如但不限于分泌的可溶性ST2、TPA或VEGF的水平中的至少一種，所述生物樣品是在 通過如本文所限定的方法和供使用的藥物組合物進行治療之前以及在治療之后以定期的 方式(例如每周一次、每兩周一次、每月一次)從癌癥患者獲得的。
[0171] 術(shù)語"生物樣品"是以它的最廣泛的意義使用的。生物樣品可以是從動物(包括人 類)獲得的并且涵蓋流體(例如血液）、固體以及組織。
[0172] 在本發(fā)明的各個方面中的又另一個方面，本發(fā)明提供了如本文所限定的分離的肽 或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物用于制備用于預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的藥物組合 物的用途。
[0173] 在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含氨基酸序列SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4的 分離的肽或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物用于制備用于預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的 藥物組合物的用途，所述預(yù)防或治療包括向有需要的癌癥患者施用。
[0174] 本發(fā)明進一步提供了如本文所限定的分離的肽或所述分離的肽的任何功能片段 或衍生物用于制備用于減少癌細胞運動性的藥物組合物的用途。
[0175] 在具體的實施方案中，本發(fā)明提供了包含氨基酸序列SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4 的分離的肽或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物用于制備用于減少癌細胞運動性的 藥物組合物的用途。
[0176] 如本文所用的術(shù)語"約"表明與所提到的值相比可以偏差多達1 %、更確切地說 5%、更確切地說10%、更確切地說15%、并且在一些情況下比所提到的值高或低多達20% 的值，所述偏差范圍包括整數(shù)值，并且如果適用的話，同樣包括非整數(shù)值，從而構(gòu)成連續(xù)的 范圍。
[0177] 如所公開和描述，應(yīng)當了解的是，本發(fā)明不限于本文所公開的具體的實施例、方 法、步驟、以及組合物，這是因為這些方法、步驟以及組合物可以有所變化。還應(yīng)當理解的 是，本文所使用的術(shù)語只是用于描述具體實施方案的目的，而不意圖具有限制性，這是因為 本發(fā)明的范圍將僅由所附權(quán)利要求書和其等同方案來限制。
[0178]必須指出的是，除非上下文另外明確規(guī)定，否則如本說明書和所附權(quán)利要求書中 所用，單數(shù)形式"a/an ( -)"和"所述"包括復(fù)數(shù)指代對象。
[0179]在整個本說明書和實施例以及所附權(quán)利要求書中，除非上下文另外要求，否則詞 語"包含（comprise)"以及諸如"包含（comprises)"和"包含(comprising)"之類的變化形式 將被理解成表示包括所述整數(shù)或步驟或者整數(shù)或步驟的組，但并不排除任何其它整數(shù)或步 驟或者整數(shù)或步驟的組。
[0180]以下實施例代表了本申請的發(fā)明人在實施本發(fā)明的方面中所使用的技術(shù)。應(yīng)當了 解的是，雖然這些技術(shù)示例了用于實施本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員根 據(jù)本公開將認識到可以進行許多修改而不脫離本發(fā)明的精神和預(yù)期范圍。
[0181] 實施例
[0182] 在沒有進行進一步詳細描述的情況下，認為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用前述說明將 本發(fā)明利用到它的最大程度。以下優(yōu)選的具體實施方案因此僅應(yīng)當被視作是說明性的，而 不會以任何方式限制要求保護的本發(fā)明。
[0183] 本領(lǐng)域已知并且在本文沒有具體描述的標準分子生物學方案大體上如Sambrook 和Russell ,2001中那樣來遵循。
[0184] 實驗程序
[0185]細胞培養(yǎng)(細胞傳代）
[0186] 在燒瓶中將細胞(人類腺癌胰腺癌細胞和人類乳腺癌細胞)在37°C、5 %C02下培養(yǎng) 在孵育箱中直到達到70%-80%的密度為止。在達到70%-80%的密度時，如下處理細胞:棄 去培養(yǎng)基，并且將燒瓶用胰蛋白酶EDTA(5ml，Biological industries公司目錄號:03-052-1B)洗滌。然后將另外5ml體積的胰蛋白酶EDTA添加到細胞中，并且在37 °C、5 % C02下將細胞 在孵育箱中放置幾分鐘（5分鐘-10分鐘），直到大部分的細胞從燒瓶上脫落為止。建議避免 在燒瓶上敲擊以增加細胞脫落。燒瓶購自Nunc公司（目錄號：178905)。
[0187] 然后將RPMI培養(yǎng)基（10ml)添加到經(jīng)過胰蛋白酶處理的細胞中。通過將RPMI 1640 (含有L-谷氨酰胺和25mM HEPES，Renium公司目錄號：52400)補充以50ml FBS(Biological industries公司目錄號：04-121-1 A)、5ml丙酮酸鈉 (Biological industries公司目錄號： 03-042-1B)、5ml青霉素 -鏈霉素 (Biological industries公司目錄號：03-〇31_lB)以及5ml 非必需氨基酸(Biological industries公司目錄號:03-340-lB)來制備培養(yǎng)基。然后將培 養(yǎng)基和經(jīng)胰蛋白酶處理的細胞分到2個燒瓶中，并且將每一個燒瓶補充以另外的15ml新鮮 培養(yǎng)基。將細胞培養(yǎng)2天-3天直到達到70 % -80 %的細胞密度為止。然后重復(fù)上述程序。
[0188] 肽的制備
[0189]如下制備和使用具有14個氨基酸殘基的長度的肽，其中所有的氨基酸殘基均呈它 們的D構(gòu)型，所述肽具有氨基酸序列Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu Trp Glu Arg Lys(或WWTFFLPSTLWERK(單個字母代碼），如由SEQ ID勵:4所表示），在本文也被稱作 "Nerofe" ：由Novetide公司在優(yōu)良制造規(guī)范(GMP)條件下合成所述肽并且將所述肽凍干成 粉末。將Nerofe粉末用二甲亞砜(DMS0)溶解以獲得10mg/ml或20mg/ml的Nerofe溶液，然后 進一步用培養(yǎng)基稀釋以獲得所期望的測定濃度的兩倍，而在最終的細胞懸浮液中不超過總 2 % DMS0的濃度。實驗中所用的最終Nerof e濃度是lμg/ml、1 Oμg/ml、25μg/ml以及50μg/ml。 將相似量的DMSO添加到對照細胞中，所述對照細胞在不存在Nerofe下孵育。
[0190]溴脫氧尿苷(BrdU)摻入測定
[0191] 如上文所述在燒瓶中將人類腺癌胰腺癌細胞和人類乳腺癌細胞培養(yǎng)直到達到 70 % -80 %的密度為止，并且使用胰蛋白酶EDTA使所述細胞從燒瓶上脫落(使用上述用于細 胞培養(yǎng)的方案直到將l〇ml培養(yǎng)基添加到經(jīng)過胰蛋白酶處理的細胞中的步驟為止）。然后將 懸浮在培養(yǎng)基和胰蛋白酶中的細胞轉(zhuǎn)移到50ml錐形管中并且以300g離心（10分鐘，4°C)。然 后棄去上清液并且將細胞沉淀物重懸于新鮮培養(yǎng)基(如上文所述所制備的2ml培養(yǎng)基）中。
[0192] 然后使細胞流化并且再將3ml培養(yǎng)基添加到細胞懸浮液中以使得細胞重懸于總體 積5ml的培養(yǎng)基中。然后將細胞計數(shù)并且稀釋到每毫升培養(yǎng)基20,000個細胞的濃度。隨后， 將細胞放置在96孔板(Nunc公司目錄號：167008)中，每孔放置100μ1的細胞懸浮液，因此每 一個孔容納2000個細胞。然后將細胞在孵育箱中在37 °C孵育過夜。
[0193] 將濃縮的Nerofe肽懸浮在總體積100μ1的培養(yǎng)基中并且添加到96孔板中的所測定 的細胞中以達到仏8/1111、1(^8/1111、25以8/1111以及5(^8/1111的最終濃度。在不存在所述肽的情 況下進行對照(背景)測定，即將?〇〇μ1培養(yǎng)基添加到對照細胞中。
[0194] 在37°C將細胞在Nerofe肽存在下孵育24小時或48小時。然后，在收集細胞前24小 時之時將每孔20μ1的溴脫氧尿苷(BrdU)試劑(密理博公司(Millipore)目錄號：2752,在培 養(yǎng)基中1:500稀釋)添加到孔中。即，在一與所述肽一起孵育就立即添加 BrdU，或在其中將細 胞孵育48小時的實驗中在前24小時孵育之后添加 BrdU。根據(jù)制造商的方案使用BrdU試劑盒 (細胞信號轉(zhuǎn)導有限公司（Cell Signaling Ltd))。
[0195] 組織型纖溶酶原激活物(TPA)人類ELISA測定
[0196] 如上文所述在燒瓶中將人類腺癌胰腺癌細胞培養(yǎng)直到達到70%_80%的密度為止 并且使用胰蛋白酶EDTA使所述細胞從燒瓶上脫落。然后將懸浮在培養(yǎng)基和胰蛋白酶中的細 胞離心并且重懸在2ml新鮮培養(yǎng)基(如上文對于BrdU摻入測定所述）中。
[0197] 然后使細胞流化并且將3ml培養(yǎng)基添加到細胞懸浮液中以使得細胞重懸于總體積 5ml的培養(yǎng)基中。將細胞計數(shù)并且稀釋到每毫升培養(yǎng)基50,000個細胞的濃度。隨后，通過每 孔放置2ml的細胞培養(yǎng)物將細胞放置在6孔板(Nunc公司目錄號：140675)的每一個孔中，因 此每一個孔容納100，〇〇〇個細胞。隨后將細胞在孵育箱中在37 °C孵育過夜。
[0198] 將上清液棄去并且替換為含有2.5%FBS的lml RPMI培養(yǎng)基。然后將細胞在37°C在 lμg/ml、10μg/ml、25μg/ml以及50μg/ml最終濃度的Nerof e肽存在下孵育24小時或48小時。 通過將細胞離心（以300g，5分鐘，4°C)來收集上清液并且儲存在-20°C。
[0199] 隨后，如下進行TPA ELISA測定:將上清液解凍并且保持在冰上，然后用隨試劑盒 (xlN，艾博抗公司(Abeam)目錄號:abl08914)所提供的TPA稀釋劑1:15稀釋。根據(jù)制造商的 方案繼續(xù)程序并且將ELI SA板在450/590的光密度(O.D.)下讀數(shù)。
[0200] 可溶性 ST2(sST2)ELISA 測定
[0201] 如上文所述在燒瓶中將人類腺癌胰腺癌細胞和人類乳腺癌細胞(MDA-MB-231)培 養(yǎng)直到達到70%-80%的細胞密度為止并且使用胰蛋白酶EDTA使所述細胞從燒瓶上脫落。 然后將懸浮在培養(yǎng)基和胰蛋白酶中的細胞離心并且重懸在2ml新鮮培養(yǎng)基（如上文對于 BrdU摻入測定所述）中。
[0202] 然后使細胞流化并且將3ml培養(yǎng)基添加到細胞懸浮液中以使得細胞重懸于總體積 5ml的培養(yǎng)基中。然后將細胞計數(shù)并且稀釋到每毫升培養(yǎng)基50,000個細胞的濃度。將細胞以 每個板2ml放置在6孔板的每一個孔中，因此每一個孔容納100,000個細胞。將細胞在孵育箱 中在37 °C孵育過夜。
[0203] 將上清液棄去并且替換為含有2.5%FBS的lml RPMI培養(yǎng)基。然后將細胞在37°C在 lμg/ml、10μg/ml、25μg/ml以及50μg/ml最終濃度的Nerof e肽存在下孵育24小時或48小時。 通過將細胞離心(5分鐘，300g，4°C)來收集上清液并且儲存在-20 °C。
[0204] 隨后，如下進行sST2ELISA測定：首先，通過將sST2肽(Genmed公司，項目ID 35622B 型，序列：HTVRLSRKNPSKECF)在PBS(Biological industries公司，02-023-5A)中從 10， 000pg/ml到156pg/ml連續(xù)稀釋來為sST2肽制備校準曲線。然后，將上清液樣品解凍并且保 持在冰上（將濃縮的樣品在PBS中稀釋）。通過在Maxi sorp 96孔板(NUNC公司，F(xiàn)96Maxi sorp， 442404)中加入100μ1-式兩份的每一個樣品和標準品來進行上樣。將經(jīng)過上樣的板在4°C 在輕微的軌道振蕩下孵育過夜。
[0205] 然后通過去除液體并且將板使用多道移液器或自動化洗滌器用300μ1于PBS中的 0.05%了1-20(六11^68(3〇公司，0777-11^洗滌3次來洗滌樣品。通過在1^5中稀釋5%854(]\03 biomedicals公司，160069)并且將300μ1的封閉緩沖液加入每一個孔中來將樣品封閉。封閉 步驟包括在振蕩(350RPM)下在室溫(RT)1小時的孵育期。隨后，如上文所述洗滌樣品。
[0206] 通過稀釋的抗sST2親和純化抗體(Genmed公司，項目ID 35622Β型）（在稀釋劑（于 PBS中的0.05%1￥-20、0.1%83六）中1:100稀釋)對83了2進行檢測，其中將10(^1的檢測抗體 加到每一個孔上。然后將樣品在室溫在振蕩（350RPM)下孵育1.5小時并且如上文所述進行 洗滌。然后將稀釋的（1:500,在稀釋劑中）山羊抗兔HRP綴合抗體(細胞信號轉(zhuǎn)導公司，7074) 加到每一個孔上（100μ1)，并且再將樣品在室溫在振蕩下孵育30分鐘。然后如上文所述將樣 品洗滌并且通過將1〇〇μ1的3,3 7 四甲基聯(lián)苯胺(ΤΜΒ，密理博公司，ES001-500ML)添加 到每一個孔中，等待藍色顯色，并且最終添加1〇〇μ1的2N H2S〇4(Frutarom公司，5552540)來 顯色。在微孔板讀數(shù)器中在450nm/590nm的0 · D ·獲得板吸光度。
[0207] 人類癌細胞的細胞迀移測定
[0208] 如上文所述在燒瓶中將人類腺癌胰腺癌細胞培養(yǎng)直到達到70%_80%的細胞密度 為止并且使用胰蛋白酶Η)ΤΑ使所述細胞從燒瓶上脫落。然后以300g將懸浮在培養(yǎng)基和胰蛋 白酶中的細胞離心10分鐘（4°C)并且重懸在2ml新鮮培養(yǎng)基（如上文對于BrdU摻入測定所 述)中。
[0209]然后使細胞流化并且添加 3ml培養(yǎng)基以使得細胞懸浮于5ml體積的培養(yǎng)基中，并且 隨后計數(shù)并且稀釋到每毫升培養(yǎng)基150,000個或300,000個細胞的濃度。
[0210]或者，使用補充有 50ml FBS(Biological industries 公司目錄號：04-121-1Α)、 5ml Hepes lM(Biological industries公司目錄號：03-025-lC)、0.5ml兩性霉素 Β 2500μ g/ml (Biological industqries公司目錄號：03-029-1)以及5ml硫酸慶大霉素 （Gentamycin sulfate)50mg/ml (Biological industries公司目錄號:03-035-1)的杜氏改良伊格氏培養(yǎng) 基（Dulbeccc/s modification of Eagle7 s medium) (DMEM,Biological Industries公司 目錄號：01-055-lA)來進行細胞培養(yǎng)和重懸并且將細胞重懸到每毫升培養(yǎng)基100,000個細 胞的最終濃度。
[0211] 根據(jù)制造商的方案制備radius 96孔細胞迀移測定板(Cell Biolabs公司目錄號： 〇8八-126)并且向每一個孔中加入10(^1的細胞，因此每一個孔容納10,000個、15,000個或 30，000個細胞。將細胞在孵育箱中孵育過夜（37°C)。隨后，將上清液棄去并且替換為含有 2.5 %FBS的100μ1 RPMI。然后將細胞通過懸浮在總體積100μ1培養(yǎng)基中的Nerof e肽（以lyg/ ml和10μg/ml的最終濃度)處理，因此每一個孔容納200μ1的總體積。然后將細胞在孵育箱中 在37 °C孵育24小時。
[0212] 或者，將上清液棄去并且替換為含有2.5%FBS和所需處理即對照（沒有Nerofe)、 10μg/ml、25μg/ml或50μg/ml的Nerofe的200μ1 DMEM。然后將細胞在孵育箱中在37°C孵育48 小時。
[0213]當細胞達到70%-80%密度時，將上清液棄去并且在沒有影響細胞附著的情況下 將凝膠從孔的中央去除，如制造商的方案中所述。然后，在零時間時（即在去除凝膠后立 即）、然后每兩小時使用倒置共聚焦顯微鏡（以40倍的放大倍數(shù))對無細胞的區(qū)域進行拍照。 通過根據(jù)制造商的方案對細胞進行染色來結(jié)束測定。
[0214]使用Photoshop軟件來計算在每個時間點時沒有細胞的面積以確定細胞行進到空 區(qū)域中的速度。按一式兩份進行所有實驗。
[0215]實施例1: Nerofe肽對人類胰腺癌細胞中組織型纖溶酶原激活物(TPA)的水平的作 用
[0216] 已經(jīng)報道的是，胰腺癌細胞中組織纖溶酶原激活物(TPA)的過表達在體外促進了 侵襲和增殖以及在體內(nèi)促進了腫瘤生長和血管生成(7)。
[0217] 研究了 Nerofe肽在體外對胰腺癌細胞的TPA分泌的作用，所述肽具有全部呈D型的 氨基酸的序列Trp Trp Thr Phe Phe Leu Pro Ser Thr Leu Trp Glu Arg Lys(如由SEQ ID NO: 4所表示）。圖1 (下部條形圖）示出了在lμg/ml-50μg/ml的Nerofe肽存在下孵育24小 時、然后通過ELISA測定評估TPA水平的人類腺癌胰腺癌細胞，如上文所述。
[0218] 如圖1(下部條形圖）中所示，在Nerofe肽存在下，與沒有與所述肽一起孵育的對照 細胞相比，在測試細胞(在本文也被稱作"細胞系Γ、"細胞系2"以及"細胞系3"）中檢測到分 泌的TPA的水平更低。
[0219] 如上文所示，胰腺癌細胞中TPA的過表達促進了細胞侵襲。因此，TPA水平的降低可 以影響癌細胞的侵襲或轉(zhuǎn)移潛能，由此，所證實的在所述肽存在下TPA水平的降低表明了所 述肽可以有效減少細胞運動性。
[0220]實施例2:Ner〇fe肽對人類胰腺癌細胞中可溶性ST2的水平的作用
[0221] T1/ST2受體(也被稱為白細胞介素1受體樣1)是Toll樣受體超家族的成員?？扇苄?T1/ST2受體和膜結(jié)合型T1/ST2受體這兩者在體內(nèi)均主要表達在造血組織中（8)。最近已經(jīng) 報道的是，ST2的可溶性形式(sST2)的基因敲低在多種細胞系中減少了 ErbB2誘導的細胞運 動性(9)。
[0222] 如圖2(下部條形圖）中所示，在lμg/ml-5〇yg/ml的Nerofe肽存在下，與沒有與所述 肽一起孵育的細胞中sST2的水平相比，在所有測試細胞(人類腺癌胰腺癌細胞）中均檢測到 更低的sST2水平。所觀測到的Nerofe肽的作用具有劑量依賴性。由于sST2與細胞運動性有 關(guān)，因此所證實的在所述肽存在下sST2水平的降低表明了所述肽可以有效減少細胞運動性 或侵襲。
[0223] 在相似的測定條件下在Nerofe肽存在下在人類乳腺癌細胞(MDA-MB-231)中也表 現(xiàn)出sST2水平有約80 %的降低(數(shù)據(jù)未示）。
[0224]實施例3: Nerofe肽對人類腺癌胰腺癌細胞增殖的作用
[0225] 由胸腺肽(被稱作"T101肽"，如上表1中所示）的C末端51個氨基酸殘基組成的具有 由SEQ ID N0.2所表示的氨基酸序列的肽先前由本申請的發(fā)明人證實顯著地減小了成年 Balb/C小鼠模型中的腫瘤尺寸(3)。
[0226] 此外，Nerofe肽先前被證實在造血系統(tǒng)起源的多種癌細胞中抑制細胞增殖，所述 Nerofe肽是T101肽的修飾的肽片段，由其C末端14個氨基酸殘基組成，所述氨基酸殘基全部 都是D型氨基酸殘基（由SEQ ID N0.4表示）。"對細胞增殖的抑制作用"在本文被定義為與在 不存在所述肽的情況下進行的對照測定相比，在所述肽存在下細胞增殖被抑制了至少 40% 〇
[0227] 驚人的是，本申請的發(fā)明人現(xiàn)在證實了 Nerofe肽被發(fā)現(xiàn)對人類腺癌胰腺癌細胞增 殖僅有很小的作用，如圖1和圖2的上圖中所示。
[0228] 使用溴脫氧尿苷(BrdU)摻入測定對人類腺癌胰腺癌細胞的增殖進行測定以評估 合成DNA的細胞的量，如上文所述。如圖1和圖2(上線）中所示，與在不存在Nerofe肽的情況 下進行的對照測定相比，在1^8/1111、1(^8/1111、25以8/1111以及5(^8/1111的此1'(^6肽存在下孵育 的人類胰腺癌細胞在所述肽存在下在它們的BrdU摻入能力方面僅表現(xiàn)出不太大的降低(最 多26%抑制）。此外，在Nerofe肽的濃度與抑制程度之間沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。
[0229]實施例4: Nerofe肽對人類腺癌胰腺癌細胞的細胞迀移的作用 [0230]使用Radius細胞迀移測定，根據(jù)制造商的方案直接測定Nerofe肽對細胞迀移的作 用。簡單地說，將細胞接種到Radius 96孔板(Cell Biolabs公司目錄號:CBA-126)的孔中并 且使所述細胞在除了孔中央之外的任何地方附著，在所述孔中央處，放置了生物相容性水 凝膠點。在細胞形成單細胞層后，通過輕輕地將凝膠用可去除的溶液溶解，從而留下可以進 行細胞迀移的空隙來開始測定。
[0231]如下表2中所示，與對照細胞(其沒有與所述肽一起孵育）相比，當在Nerofe肽（以 l〇μg/ml的最終濃度)存在下將細胞孵育8小時之時，細胞向孔中央的迀移對于細胞系1來說 減少了30%并且對于細胞系2來說減少了82%。細胞系"Γ和細胞系"2"都是腺癌胰腺癌細 胞。
[0232]這些結(jié)果是Nerofe肽對癌細胞的迀移潛能的作用的直接證據(jù)。
[0233]
[0234] 表2:Nerofe肽對細胞迀移的作用
[0235] 在不同的測定條件下，即通過將細胞在開始測定前在Oμg/ml、10μg/ml、25μg/ml以 及50μg/ml的Nerofe肽存在下孵育48小時的時間，來進一步測定Nerofe肽對人類腺癌胰腺 癌細胞的迀移能力的作用。
[0236]通過將人類腺癌胰腺癌細胞在25μg/ml的Nerofe肽存在下孵育所進行的測定的結(jié) 果呈現(xiàn)于圖3中。如通過比較圖3C和圖3A可知，沒有通過Nerofe肽處理的對照癌細胞迀移到 板中央，其中圖3C在開始迀移測定后27小時之時獲得，圖3A在開始迀移測定后1小時之時獲 得。
[0237] 相比之下，如通過比較圖3D和圖3B所證實，在Nerofe肽存在下孵育的細胞的迀移 基本上被抑制。
[0238] 這種抑制作用還以圖表方式呈現(xiàn)于圖4中，該圖4示出了在使用在開始迀移測定前 在25μg/ml的Nerofe肽存在下孵育48小時的人類腺癌胰腺癌細胞進行的兩次獨立的迀移測 定（T1和T2)中所獲得的結(jié)果以及在使用對照細胞進行的四次獨立的測定（CONI、C0N2、 C0N3、以及C0N4)中所獲得的結(jié)果。
[0239] 如圖4中以圖表方式所示，使用先前暴露于Nerofe肽的細胞進行的細胞迀移測定 中的無細胞面積在迀移測定期間基本上被維持，這表明了這些細胞的迀移在很大程度上被 抑制。
[0240] 所觀測到的在Nerofe肽存在下分泌的TPA和sST2的水平降低以及Nerofe對癌細胞 迀移的直接抑制作用表明了這種肽在抑制癌癥轉(zhuǎn)移方面的特定治療潛能。
[0241] 不希望受理論所束縛，Nerofe肽的這些所觀測到的作用并不一定與細胞增殖機制 有關(guān)，這是因為Nerofe被證實對細胞增殖僅有很小的抑制作用，如圖1和圖2中所舉例說明。
[0242] 實施例5:Ner〇fe肽對癌癥患者的血管內(nèi)皮生長因子的血清水平的作用
[0243]血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是由刺激血管發(fā)生和血管生成的細胞產(chǎn)生的信號蛋白。 如上文所示，可以表達VEGF的癌癥能夠生長和轉(zhuǎn)移。
[0244] 因此，在接受肽Nerofe施用的癌癥患者中進行跟蹤VEGF的血清水平的臨床研究。 參與所述研究的患者被診斷為患有不同的癌癥類型，即結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、梭形細胞瘤、 胰腺癌、小腸癌、非小細胞肺癌、肝癌、結(jié)腸腺癌以及直腸腺癌，如下表3中所匯總。
[0245] 患者被包括在群組1、群組2、群組3以及群組4中的至少一個中并且分別在所示的 時間點接受6mg/m2、12mg/m 2、24mg/m2或24mg/m2(每公斤體重約0 · 16mg、0 · 32mg、0 · 64mg或 1.28mg)劑量的肽 Nerofe。
[0246] 使用人類VEFG的Elisa試劑盒(R&D系統(tǒng)公司（R&D systems))在從這些患者獲得的 血液樣品中測量VEGF的血清水平并且結(jié)果呈現(xiàn)于圖5(對于群組1和群組2的患者)和圖6(對 于群組3和群組4的患者）中。
[0247] 如圖5中所示，在群組1和群組2中，參加的癌癥患者的VEGF的血清水平升高。然而， 如圖6中所示，在群組3和群組4的患者的血清中，VEGF的血清水平降低了 30%-40%，這證實 了 Nerofe在癌癥患者中的明確的抗血管生成作用。
[0248] 這一所觀測到的作用對于患有小腸癌和直腸腺癌的癌癥患者即分別是患者13和 19來說是特別有意義的。
[0249]
LU^Ij 表3:用Neori'e進仃的臨冰塒％的'/US、
[0252]由于轉(zhuǎn)移和腫瘤細胞迀移經(jīng)由血管來進行，因此在降低VEGF水平后，血管滲透性 變低并且轉(zhuǎn)移可以被抑制。
【主權(quán)項】
1. 一種藥物組合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:3的分離的肽或所述分離的肽 的任何功能片段或衍生物，用于預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的方法中。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的供使用的藥物組合物，其中所述分離的肽含有氨基酸序列SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的供使用的藥物組合物，其中所述分離的肽由氨基酸序列SEQ ID NO:3組成。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的供使用的藥物組合物，其中所述分離的肽含有SEQ ID N0:3的 修飾的氨基酸序列，其中一個或多個氨基酸殘基通過保守替代被置換，與具有氨基酸序列 SEQ ID N0:3的未修飾的肽相比，所述保守替代不顯著影響修飾的肽的生物學特征。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的供使用的藥物組合物，其中所述分離的肽含有SEQ ID N0:3的 修飾的氨基酸序列，其中一個或多個氨基酸殘基被相應(yīng)的D-氨基酸殘基置換。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的供使用的藥物組合物，其中所述分離的肽含有氨基酸序列SEQ ID N0:4〇7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的供使用的藥物組合物，其中所述分離的肽由氨基酸序列SEQ ID NO:4組成。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的供使用的藥物組合物，其中所述癌癥是轉(zhuǎn)移癌。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的供使用的藥物組合物，其中所述轉(zhuǎn)移癌選自由以下各項組成 的組:胰腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、結(jié)腸腺癌、直腸腺癌、乳腺癌、皮膚癌、肺癌、非小細胞肺 癌、腎癌、多發(fā)性骨髓瘤、甲狀腺癌、前列腺癌、腺癌、頭頸部癌、胃腸道癌、胃癌、小腸癌、梭 形細胞瘤、肝癌、肝臟癌以及女性生殖道的惡性腫瘤。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的供使用的藥物組合物，其中所述藥物組合物適 用于與至少一種另外的抗癌治療一起施用。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的供使用的藥物組合物，其中所述至少一種另外的癌癥治療 選自由以下各項組成的組:抗血管生成劑、細胞毒性劑、化療劑、激素治療、放療以及免疫治 療。12. 根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項所述的供使用的藥物組合物，其中所述藥物組合物是 通過選自由以下各項組成的組的途徑來施用的:靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、局部、關(guān) 節(jié)內(nèi)、結(jié)膜下、口服、鼻內(nèi)以及眼內(nèi)。13. -種藥物組合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID N0:3的分離的肽或所述分離的肽 的任何功能片段或衍生物，用于減少癌細胞運動性的方法中。14. 一種藥物組合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID N0:3的分離的肽或所述分離的肽 的任何功能片段或衍生物，用于預(yù)防或抑制癌癥患者的血管生成的方法中。15. -種藥物組合物，其包含含有氨基酸序列SEQ ID N0:3的分離的肽或所述分離的肽 的任何功能片段或衍生物，用于降低癌癥患者的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的水平的方法 中。16. 根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項所述的供使用的藥物組合物，其中所述分離的肽含 有氨基酸序列SEQ ID NO:4。17. 根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項所述的供使用的藥物組合物，其中所述分離的肽由 氨基酸序列SEQ ID NO:4組成。18. -種預(yù)防或治療癌癥轉(zhuǎn)移的方法，所述方法包括向有需要的癌癥患者施用藥物組 合物，所述藥物組合物包含治療有效量的含有氨基酸序列SEQ ID NO: 3的分離的肽或所述 分離的肽的任何功能片段或衍生物。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述分離的肽含有氨基酸序列SEQ ID NO: 1或 SEQ ID NO:2或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物。20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述分離的肽由氨基酸序列SEQ ID N0:3組成。21. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述分離的肽含有SEQ ID NO: 3的修飾的氨基酸 序列，其中一個或多個氨基酸殘基通過保守替代被置換，與具有氨基酸序列SEQ ID N0:3的 未修飾的肽相比，所述保守替代不顯著影響修飾的肽的生物學特征。22. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述分離的肽含有SEQ ID NO: 3的修飾的氨基酸 序列，其中一個或多個氨基酸殘基被相應(yīng)的D-氨基酸殘基置換。23. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述分離的肽含有氨基酸序列SEQ ID N0:4。24. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述分離的肽由氨基酸序列SEQ ID N0:4組成。25. 根據(jù)權(quán)利要求18至24中任一項所述的方法，其中所述癌癥是轉(zhuǎn)移癌。26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)移癌選自由以下各項組成的組:胰腺癌、 結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、結(jié)腸腺癌、直腸腺癌、乳腺癌、皮膚癌、肺癌、非小細胞肺癌、腎癌、多發(fā) 性骨髓瘤、甲狀腺癌、前列腺癌、腺癌、頭頸部癌、胃腸道癌、胃癌、小腸癌、梭形細胞瘤、肝 癌、肝臟癌以及女性生殖道的惡性腫瘤。27. 根據(jù)權(quán)利要求18至26中任一項所述的方法，其中所述方法進一步包括向所述癌癥 患者施用至少一種另外的抗癌治療。28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述至少一種另外的抗癌治療選自由以下各項 組成的組:抗血管生成劑、細胞毒性劑、化療劑、激素治療、放療以及免疫治療。29. 根據(jù)權(quán)利要求18至28中任一項所述的方法，其中所述施用是通過選自由以下各項 組成的組的途徑來實現(xiàn)的：靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、局部、關(guān)節(jié)內(nèi)、結(jié)膜下、口服、 鼻內(nèi)以及眼內(nèi)。30. -種減少癌細胞運動性的方法，所述方法包括向被診斷患有具有轉(zhuǎn)移潛能的癌癥 的癌癥患者施用藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的含有氨基酸序列SEQ ID NO: 3的分離的肽或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物。31. -種預(yù)防或抑制癌癥患者的血管生成的方法，所述方法包括向有需要的癌癥患者 施用藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的含有氨基酸序列SEQ ID NO:3的分離 的肽或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物。32. -種降低有需要的癌癥患者的血清中VEGF的水平的方法，所述方法包括向所述癌 癥患者施用藥物組合物，所述藥物組合物包含治療有效量的含有氨基酸序列SEQ ID NO: 3 的分離的肽或所述分離的肽的任何功能片段或衍生物。33. 根據(jù)權(quán)利要求30至32中任一項所述的方法，其中所述藥物組合物包含治療有效量 的含有氨基酸序列SEQ ID N0:4的分離的肽。34. 根據(jù)權(quán)利要求30至32中任一項所述的方法，其中所述藥物組合物包含治療有效量 的由氨基酸序列SEQ ID N0:4組成的分離的肽。
【文檔編號】A61P35/04GK105939724SQ201480074295
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2014年12月4日
【發(fā)明人】Y·德瓦里, U·桑德勒
【申請人】免疫系統(tǒng)密鑰有限公司