有效對抗病毒性結(jié)膜炎的組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物組合物，其用作用于預(yù)防性或治療性局部處置由D亞型的腺病毒或H7亞型的A型流感病毒引起的病毒性眼感染的藥劑。其即可使用制劑形式的組合物包含ι角叉菜膠作為抗病毒活性成分，并且基本上不含金屬鹵化物鹽或含有不超過0.5％w/v的金屬鹵化物鹽。
【專利說明】
有效對抗病毒性結(jié)膜炎的組合物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于病毒學(xué)和應(yīng)用醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，其涉及包含^角叉菜膠的組合物及它們作為 藥劑在預(yù)防性或治療性處置病毒引起的結(jié)膜炎中的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 流行性角膜結(jié)膜炎(EKC)是侵害結(jié)膜和角膜兩者的嚴(yán)重的接觸傳染性眼感染，由D 型腺病毒、主要是8、19、37血清型腺病毒引起。已經(jīng)分離了超過50種血清型腺病毒，至少有 19種記錄的血清型導(dǎo)致眼感染。最常相關(guān)的導(dǎo)致EKC的血清型包括腺病毒8、19和37,而血清 型2-5、7、9、10、11、14、16、21和29頻率較低且為嚴(yán)重性較低的形式。由于在普通群體中對腺 病毒的天然免疫性的水平低，即，在美國普通群體的低于5%中發(fā)現(xiàn)了8型腺病毒抗體，所以 每個個體被視為對感染易感。
[0004] EKC的特征是結(jié)膜炎的典型癥狀，例如流淚發(fā)紅的急性發(fā)作、異物感和重度痛。癥 狀還包括結(jié)膜(結(jié)膜炎)和角膜(角膜炎）中的炎癥、相關(guān)疼痛、水腫、視力下降、流淚、對光敏 感、如同眼中存在異物的感覺或知覺和出現(xiàn)假膜。在持續(xù)約2-3周的急性期期間，存在病毒 并且病毒正在進(jìn)行復(fù)制。在典型病例中，第一只眼被感染，然后，在2-3天內(nèi)感染擴(kuò)散至另一 只眼。在60%的病例中兩只眼都被侵害。第一只眼中的感染通常是更嚴(yán)重的。在大約20-50%的患者中，發(fā)生角膜混濁，導(dǎo)致持續(xù)數(shù)周和數(shù)月的視力惡化，在罕見病例中，甚至持續(xù) 數(shù)年。由于該疾病的性質(zhì)通常是流行性的，所以稱為流行性角膜結(jié)膜炎(EKC)。腺病毒結(jié)膜 炎在德國是須報(bào)告的感染（參見例如Meyer-Riisenberg等人，Dtsch Arztebl Int 2011;108 (27): 475-80)，并且被日本國家傳染病流行病學(xué)監(jiān)測(NESID)列為IV類傳染病，要求采集、 分析和公布發(fā)生率的報(bào)告。
[0005] EKC仍然缺乏有效的治療，因此，存在巨大的醫(yī)療需求未得到滿足。聚維酮碘滴眼 劑顯示僅具有有限的效力，同時(shí)導(dǎo)致發(fā)炎的眼中有額外的刺激感，有時(shí)甚至導(dǎo)致結(jié)膜變色。 因此，對于患有該疾病的患者和接觸這類患者的個體如親戚、朋友、同事、醫(yī)師而言，可用于 治療EKC和預(yù)防其傳播的更相容的藥物組合物將是高度期望的。
[0006] 與主要導(dǎo)致人的呼吸系統(tǒng)疾病的其它流感病毒亞型不同，H7流感病毒感染通常導(dǎo) 致眼部癥狀而非呼吸系統(tǒng)癥狀(Belser等人，Emerg Infect Dis.2009; 15:859-865)。因此， 高度期望為治療病毒性眼感染設(shè)計(jì)的抗病毒制劑在導(dǎo)致眼疾病的流感爆發(fā)期間是有效的。
[0007] 在眼科學(xué)中使用角叉菜膠作為賦形劑和增粘劑是充分確立的。美國專利5,403， 841描述了基于角叉菜膠的溶液，其可用于制備藥物活性成分的滴眼劑制劑。在接觸淚膜 時(shí)，該溶液形成凝膠，所述凝膠維持與結(jié)膜的延長接觸，從而防止活性成分從眼表面快速除 去和有助于其局部遞送。關(guān)于基于角叉菜膠或其它帶電荷聚合物的眼用原位膠凝系統(tǒng)的綜 述，參見例如Rupenthal等人，Int J Pharm. 2011;411 (1-2): 69-77和78-85。含有角叉菜膠 的聚合物系統(tǒng)也可用于大分子物質(zhì)的經(jīng)鞏膜遞送（Thrimawithana等人，Eur J Pharm Sci. 2011 ;44(3) :399-409)。在任意上述文件中均沒有提及或隱含公開角叉菜膠的固有藥 物活性。
[0008] 使用角叉菜膠作為賦形劑和/或膜模擬物的一些眼用藥物制劑含有抗病毒劑。例 如，國際專利申請WO 2007/039201要求保護(hù)了用于治療皰疹性角膜炎的溴夫定的光穩(wěn)定制 劑。還已知角叉菜膠和相關(guān)的陰離子型聚合物膜模擬物可用于意欲用于清潔和儲存接觸透 鏡的溶液中，在那里它們改善了所述溶液的收斂性質(zhì)，所述溶液含有具有廣譜抗微生物活 性的低分子量物質(zhì)如過氧化氫、硼酸鹽或西吡氯銨（參見W0 2009/152028和W0 2010/ 038129)。抗病毒或抗炎作用沒有歸因于這些溶液的角叉菜膠成分。
[0009] 基于天然有機(jī)聚合物的眼用制劑已知明確地是為治療結(jié)膜發(fā)炎而設(shè)計(jì)的。例如， 國際專利申請W0 2005/046562要求保護(hù)了用于這類治療目的的硫酸化透明質(zhì)酸。在該公開 文獻(xiàn)中未提及角叉菜膠。
[0010] Stiles等人（Invest Ophthalmol Vis Sci 2008;49(4): 1496-1501)報(bào)道了用λ-角叉菜膠的眼用制劑治療患有實(shí)驗(yàn)誘發(fā)的皰疹性角膜炎的貓縮短了動物傳染性的持續(xù)時(shí) 間，雖然結(jié)膜炎的臨床過程未縮短。該論文僅解決了由貓科動物皰疹病毒引起的結(jié)膜炎癥； 未提及腺病毒和非λ類別的角叉菜膠。
[0011] 在W0 2009/027057中，公開了 I-角叉菜膠對抗Β-型（呼吸系統(tǒng))腺病毒的抗病毒作 用。然而，在該申請中，未提及可以確定對抗A、C和D亞型的顯著作用。
[0012] 發(fā)明簡述
[0013] 現(xiàn)在已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn):可以將角叉菜膠、特別是^-角叉菜膠配制成新的藥物 組合物以產(chǎn)生對抗D型腺病毒和由所述D型腺病毒導(dǎo)致的感染的抗病毒功效，這與上文討論 的本領(lǐng)域狀態(tài)的知識相反。
[0014] 因此，如獨(dú)立權(quán)利要求中所要求保護(hù)的本發(fā)明涉及這類新的組合物等，它們被認(rèn) 為可用于預(yù)防或治療流行性角膜結(jié)膜炎。
[0015] 如已經(jīng)在W0 2009/027057中所報(bào)道的那樣，t-角叉菜膠在生理?xiàng)l件下、即當(dāng)將聚 合物溶于0.9%NaCl水溶液中時(shí)對于對抗D型腺病毒是無效的。然而，偶然地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)t-角叉 菜膠溶于不含NaCl的水中時(shí)，該聚合物顯示出令人驚訝的對抗D型腺病毒的功效。
[0016] 對這些意外的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步研究產(chǎn)生了如下理念:與生理(0.9% )NaCl溶液相比，在 即可使用局部眼用溶液中降低氯化鈉含量可以顯著地降低對抗A型流感病毒的H7N7亞型的 活性所要求的I-角叉菜膠IC 5Q值。這些特征允許并推薦使用該聚合物來預(yù)防和治療由H7A型 流感病毒引起的眼感染。
[0017] 因此，本發(fā)明的一個目的是提供包含角叉菜膠、優(yōu)選角叉菜膠的藥物制劑，其用 作用于預(yù)防或局部治療由D型腺病毒或H7型A型流感病毒引起的傳染性結(jié)膜炎的藥劑，更特 別地，用作用于預(yù)防或局部治療由腺病毒引起的流行性角膜結(jié)膜炎和在流感株H7N7的感染 期間發(fā)生的結(jié)膜炎的藥劑。
[0018] 發(fā)明詳述
[0019] 在第一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及適于通過施用于被病毒性結(jié)膜炎侵害或處于發(fā) 生所述病毒性結(jié)膜炎的風(fēng)險(xiǎn)中的眼來預(yù)防性或治療性處置所述病毒性結(jié)膜炎的藥物組合 物。"病毒性結(jié)膜炎"應(yīng)當(dāng)指由病毒引起的結(jié)膜感染，如國際疾病分類法（International Classification of Diseases)第10版(ICD-10)的B30代碼組所定義的那樣。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，病毒性結(jié)膜炎是歸因于腺病毒感染的結(jié)膜炎或角膜結(jié)膜炎 (ICD-10代碼分別為B30.1和B30.0)。在其它實(shí)施方案中，病毒性結(jié)膜炎可以由其它或未指 定的病毒引起(I⑶-10代碼B30.8和B30.9)，可以例如由A型流感病毒的H7N7株引起。
[0021]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"治療"或"處置"應(yīng)當(dāng)指旨在以如下方式改變病毒性結(jié) 膜炎的臨床過程的治療性干預(yù)：臨床癥狀如眼發(fā)紅和疼痛、視力障礙和流淚等的嚴(yán)重性低 于未使用本發(fā)明的制劑進(jìn)行干預(yù)的癥狀;或所述臨床癥狀持續(xù)更短的時(shí)間；或具有所述癥 狀的受感染個體保持將引起病毒性結(jié)膜炎的傳染原傳播給另一個體的能力的時(shí)間期限縮 短;或所述作用的任意組合。
[0022]同樣，在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"預(yù)防"應(yīng)當(dāng)指在首先暴露于本發(fā)明的制劑、隨后 暴露于足以引起病毒性結(jié)膜炎（即在沒有這類預(yù)處置的存在下）的量的傳染性病毒物質(zhì)的 健康眼中沒有發(fā)生病毒感染或沒有發(fā)生病毒感染的臨床相關(guān)癥狀。"部分預(yù)防"應(yīng)當(dāng)指:如 果盡管用本發(fā)明的制劑對眼進(jìn)行了預(yù)治療、但是仍然被傳染性病毒物質(zhì)觸發(fā)了病毒性結(jié)膜 炎，則所述病毒性結(jié)膜炎表現(xiàn)出的癥狀的嚴(yán)重性低于未進(jìn)行預(yù)治療的情況，或者顯示出延 遲的發(fā)作，或者更早消退。
[0023]在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及預(yù)防或改善病毒性結(jié)膜炎的晚期并發(fā)癥的藥物 組合物。這類并發(fā)癥在科學(xué)和臨床文獻(xiàn)中是已知的，包括但不限于角膜混濁、上皮下浸潤和 眼假膜形成。
[0024] 本發(fā)明的制劑通常含有角叉菜膠、優(yōu)選t-角叉菜膠作為抗病毒活性成分或作為唯 一的抗病毒活性成分，其濃度為即可使用制劑的〇. 05 % -1 %重量、優(yōu)選0.1 -0.5 %、最優(yōu)選 0.1-0.3 %重量。而且，它們基本上不含金屬鹵化物鹽如氯化鈉或氯化鉀；或含有不超過 0.5% (w/v)、優(yōu)選不超過0.1 % (w/v)的一種或多種金屬鹵化物鹽。金屬鹵化物鹽通常在蓋 侖制劑中用作離子張度調(diào)節(jié)劑。例如，基于"生理"氯化鈉溶液的液體藥物組合物通常包含 0.9%w/v的氯化鈉。
[0025] "基本上不含"在本文中指本發(fā)明的組合物含有不超過痕量的金屬鹵化物鹽，所述 金屬鹵化物鹽可能來源于組合物中存在的其它成分的雜質(zhì)。
[0026]本發(fā)明的可局部施用的眼用組合物可以具有3.5-8.0范圍的pH值、通常約4.0-約 8.0范圍的pH值和約220-320m0sm/kg的同滲質(zhì)量摩爾濃度。然而，對于不同應(yīng)用，可以優(yōu)選 將同滲質(zhì)量摩爾濃度調(diào)整至略低滲的值，所述值通常為170-250m0sm/kg的范圍、更特別是 190-220m0sm/kg的范圍，以補(bǔ)償患有結(jié)膜炎的患者因疾病或過度蒸發(fā)導(dǎo)致的淚膜高滲性。 根據(jù)本發(fā)明，同滲質(zhì)量摩爾濃度的調(diào)節(jié)不使用離子張度劑進(jìn)行，特別地，不使用金屬鹵化物 鹽如NaCl或KC1進(jìn)行。而是可以通過添加低分子量糖和低分子量多價(jià)醇（〃多元醇〃）中的至 少一種來調(diào)整期望的同滲質(zhì)量摩爾濃度。適宜的糖選自單糖、二糖和寡糖，典型地選自葡萄 糖、果糖、甘露糖和蔗糖。適宜的多價(jià)醇、典型地是具有3-12個碳原子骨架的短鏈糖醇可以 選自甘油、赤蘚醇、山梨醇、甘露醇、木糖醇、蘇糖醇、肌醇和麥芽糖醇。
[0027] 本發(fā)明的局部眼用制劑可以包含一種或多種在儲存過程中防止pH偏移的眼科上 相容的pH調(diào)節(jié)劑或緩沖系統(tǒng)。這類物質(zhì)包括但不限于硼酸、硼酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸、碳酸 氫鈉和各種無機(jī)磷酸鹽緩沖劑如Na 2HP〇4、NaH2P〇4、KH2P〇4及其混合物。由任意這類pH-調(diào)節(jié) 劑引入的極小的離子強(qiáng)度不干擾本發(fā)明的本質(zhì)。
[0028] 而且，本發(fā)明的局部眼用制劑可以包含一種或多種眼科上相容的表面活性劑。表 面活性劑有助于制劑通過眼表面擴(kuò)散，可以是非離子型或陰離子型的。示例性的非離子型 表面活性劑包括泰洛沙泊、聚氧乙烯山梨坦酯、聚氧乙烯蓖麻油、泊洛沙姆、聚氧乙烯/聚氧 丙烯表面活性劑、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧乙烯丙二醇硬脂酸酯、羥基烷基膦酸酯、月桂酸 或棕櫚酸酯和醚、油酸三乙醇胺或上述物質(zhì)的組合或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它物質(zhì)。當(dāng) 包括時(shí)，表面活性劑通常以占組合物的0.02 % (w/v)至0.1 % (w/v)的濃度存在。
[0029] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的局部眼用制劑可以含有一種或多種防腐劑以抑制微 生物生長和延遲架存壽命。示例性的防腐劑包括但不限于苯扎氯銨、依地酸二鈉(EDTA)、聚 季銨鹽-1、聚六亞甲基雙胍和過硼酸鹽。防腐劑的量通常為總組合物的約0.01 % (w/v)以 下。
[0030] 除上述成分外，關(guān)注的是，本發(fā)明的藥物組合物中可以存在各種另外的或可選的 成分，所述可選的成分包括但不限于抗氧化劑如維生素 E或其可購買獲得的衍生物如生育 酚聚乙二醇1 〇〇〇琥珀酸酯(TPGS )、抗壞血酸或焦亞硫酸鈉。
[0031] 本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及用于局部施用的眼用藥物組合物，其包含抗病毒有 效量的作為抗病毒活性成分的i角叉菜膠、乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物(EDTA)、選自甘露 醇或山梨醇的同滲質(zhì)量摩爾濃度調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑或緩沖系統(tǒng)和水，條件是所述組合物在 其即可使用制劑中含有不超過0.5 % w/v的金屬鹵化物鹽。
[0032]上述實(shí)施方案的組合物所含有的卜角叉菜膠的濃度為即可使用制劑的0.05%-1 %重量、優(yōu)選為即可使用制劑的0.1-0.5%、優(yōu)選0.1-0.4%重量、最優(yōu)選0.2-0.4%重量。 [0033] 乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物(EDTA)以0.05%-0.2%(w/v)的濃度存在，優(yōu)選以 0.1 % (w/v)的濃度存在。
[0034] pH調(diào)節(jié)劑或緩沖系統(tǒng)包括但不限于硼酸、硼酸鈉、檸檬酸鉀、檸檬酸、碳酸氫鈉和 各種無機(jī)磷酸鹽緩沖劑如Na2HP〇4、NaH2P〇4、KH2P〇4及其混合物，優(yōu)選Na 2HP〇4/檸檬酸的混合 物。
[0035]本實(shí)施方案的眼用藥物組合物具有10-50mPa.s的粘度、6-8.0范圍的pH值和280-320m0sm/kg范圍的同滲質(zhì)量摩爾濃度。
[0036]本發(fā)明的另一個實(shí)施方案涉及眼用藥物組合物，其包含:濃度為即可使用制劑的 0.2%_0.4%重量的作為抗病毒活性成分的^角叉菜膠、濃度為0.1%(w/v)的乙二胺四乙酸 二鈉鹽二水合物(Η)ΤΑ)、濃度為3%-4%重量的甘露醇或山梨醇和Na 2HP〇4/檸檬酸混合物， 條件是所述組合物在其即可使用制劑中含有不超過〇.5%w/v的金屬鹵化物鹽。
[0037]該實(shí)施方案的眼用藥物組合物具有10-50mPa.s的粘度、6-8.0范圍的pH值和280-320m0sm/kg的同滲質(zhì)量摩爾濃度。
[0038]出人意料地，EDTA的存在調(diào)節(jié)了包含t-角叉菜膠的局部眼用組合物的粘度;特別 地，EDTA降低了隨^-角叉菜膠的量增加而增加的組合物的粘度。
[0039] EDTA的這種作用允許制備具有高濃度的I-角叉菜膠和適當(dāng)粘度以確保組合物對 于患者而言是舒適的和不引起視力模糊的局部眼用組合物。
[0040] 存在EDTA的另一個作用是含有EDTA的制劑具有的抗病毒活性高于不含EDTA的相 應(yīng)制劑。
[0041] 上文報(bào)道的眼用組合物的一個優(yōu)點(diǎn)是：受感染的人眼具有高流淚率，通常局部施 用的治療被非?？斓叵吹?，因此具有高濃度I-角叉菜膠的制劑允許將有效劑量的I-角叉菜 膠運(yùn)輸至受感染的眼。
[0042] 本發(fā)明的藥物組合物通常以無菌形式提供用于局部施用于眼的前部，優(yōu)選針對需 要其的個體自我施用進(jìn)行調(diào)整。在一個實(shí)施方案中，制劑是不含顆粒的滴眼劑。適于將液體 通過管嘴以個體在自我施用所述滴眼劑期間可以容易控制的方式逐滴分配至眼表面的各 種容器是本領(lǐng)域已知的。優(yōu)選地，設(shè)計(jì)了典型的容器+管嘴系統(tǒng)以維持滴眼劑在反復(fù)使用期 間的無菌性。
[0043] 本發(fā)明范圍內(nèi)的其它蓋侖制劑包括眼科上可接受的拭子、軟膏劑或可作為噴霧劑 或氣霧劑應(yīng)用于眼的凝膠或可以施用入結(jié)膜囊的凝膠。對于每種這類制劑，被設(shè)計(jì)成將這 類制劑分配于眼前部而沒有給眼表面帶來機(jī)械損害風(fēng)險(xiǎn)的各種產(chǎn)品或應(yīng)用系統(tǒng)是本領(lǐng)域 已知的。
[0044] 對于專門應(yīng)用，本申請的藥物組合物還可以被配制入控釋裝置中，所述控釋裝置 可以短暫地放入結(jié)膜囊或原位溶解、此時(shí)它們釋放出本發(fā)明的角叉菜膠制劑。
[0045] 附圖簡述
[0046]圖1是實(shí)施例6的試驗(yàn)結(jié)果的示意圖，其中對眼內(nèi)感染禽流感病毒A/H7N7的小鼠的 存活率測試了 t-角叉菜膠的抗病毒作用;使10只小鼠/組感染A型流感/土耳其/德國/R11/ 01H7N7并歷經(jīng)10天期限、每日兩次治療，分別使用實(shí)施例4所述的藥物組合物或使用安慰 劑。在感染后立即開始治療。
[0047] 在X-軸上給出存活時(shí)間（天），在y-軸上給出存活小鼠的％; I = t角叉菜膠制劑(黑 色線）;P =安慰劑(虛線）。
[0048] 實(shí)施例1
[0049]測定對腺病毒而言的IC5Q值的方法
[0050]將A549細(xì)胞以1.7*104個細(xì)胞/孔的細(xì)胞密度接種入96孔板，在含4.5g/l葡萄糖的 標(biāo)準(zhǔn)DMEM組織培養(yǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)24小時(shí)。制備含有不同量的角叉菜膠聚合物和NaCl的病毒混 懸液，溫育20分鐘的最低時(shí)間。用含有指定濃度的測試物質(zhì)（=角叉菜膠聚合物）的病毒混 懸液以1.3*10 3個感染單位/孔的病毒滴度感染細(xì)胞。感染后1小時(shí)，取出病毒接種物，加入 含2.5%w/v羧甲基纖維素(CMC)、角叉菜膠聚合物和待測試量的NaCl鹽濃度的半液體覆蓋 物。將細(xì)胞于37°C溫育5天。隨后除去上清液，用PBS將細(xì)胞洗滌3次，并用冰冷的甲醇/丙酮 (1:1)混合物固定用于免疫染色。將細(xì)胞用封閉緩沖液(Biolegend)進(jìn)一步溫育45分鐘，與 小鼠抗-腺病毒抗體一起以1:1000稀釋進(jìn)行溫育。溫育1小時(shí)后，將細(xì)胞再次用含0.1 % TWeen20的洗滌緩沖液洗滌3次，然后與HRP綴合的抗-小鼠 IgG抗體一起以1:1000稀釋溫育1 小時(shí)。隨后用PBS將細(xì)胞洗滌3次，然后加入TMB底物(Biolegend)。在10分鐘反應(yīng)時(shí)間后，通 過添加1N硫酸終止反應(yīng)。
[0051 ] 在450nm測量吸光度。將未經(jīng)處理的受感染細(xì)胞的吸光度設(shè)定為100%，而將未受 感染的經(jīng)處理的細(xì)胞的吸光度設(shè)定為0%。使用標(biāo)準(zhǔn)擬合軟件ExcelFit計(jì)算IC5Q值。平行地， 通過將細(xì)胞用含4%甲醛的結(jié)晶紫溶液染色和固定來測定該方法對未受感染細(xì)胞的作用。 未檢測到所述聚合物和不同的測試鹽濃度對未受感染細(xì)胞有顯著負(fù)性作用。
[0052]
[0053] 表1:1-角叉菜膠對3種類型的腺病毒的IC5Q值依賴于NaCl濃度。所有值以μg/ml計(jì) [MA =甘露醇]
[0054]如表1中所示，當(dāng)氯化鈉以生理濃度存在時(shí)，t-角叉菜膠對于對抗腺病毒8、19和37 是無效的。在0.5 %NaCl濃度下，可檢測到抗病毒效力。在沒有NaCl存在下，t-角叉菜膠的 IC50為29-38ygi-角叉菜膠/lml實(shí)驗(yàn)覆蓋物溶液。
[0055] 當(dāng)加入甘露醇至達(dá)到摩爾滲透壓濃度為20〇111〇8111〇1/1(0%似(：1+20〇111〇8111/1]\^) 時(shí)，抗病毒效力得以保持。為了達(dá)到表1所示的結(jié)果，向含1.2mg/mU-角叉菜膠的溶液中以 36.4mg/ml的濃度加入甘露醇，相當(dāng)于193m0sm/kg的同滲質(zhì)量摩爾濃度。
[0056] 實(shí)施例2:
[0057]測定對A型流感病毒H7N7而言的IC5Q值的方法
[0058]采用含2.25%羧甲基纖維素 (CMC)的半液體覆蓋物培養(yǎng)基，以具有病毒和實(shí)驗(yàn)測 試樣品的預(yù)防性預(yù)溫育、細(xì)胞感染和感染后處理的方案對MDCK細(xì)胞進(jìn)行本試驗(yàn)。試驗(yàn)基質(zhì) 由比例為2:1 (由儲備溶液的初始1:3稀釋獲得)的培養(yǎng)基和樣品基質(zhì)組成。
[0059] 本試驗(yàn)設(shè)定為對于每個測試樣品濃度和對于感染和未感染對照進(jìn)行6次重復(fù)試 驗(yàn)。一式三份進(jìn)行模擬感染(毒性對照）。最終的i -角叉菜膠濃度為400、120、36、10.8、3.2、 0.97、0.3、0.09μg/ml (1:3.33系列稀釋）。將1.7xl04個細(xì)胞接種入96孔組織培養(yǎng)板，以便它 們在24-48小時(shí)后達(dá)到約90%匯合。將等體積的雙重濃縮病毒稀釋液和雙重濃縮測試樣品 稀釋系列混合，并于室溫溫育10分鐘。分別向感染和未感染對照中僅加入病毒w/o測試樣品 和培養(yǎng)基。將板于室溫溫育45分鐘。然后將接種物稀釋，在5ml圓底試管中分配lml等分試 樣，每個測試樣品濃度制備1支試管。將4ml CMC培養(yǎng)基/試驗(yàn)板轉(zhuǎn)入50ml錐形管以制備用于 感染和未感染對照的覆蓋物培養(yǎng)基。
[0060] 將儲備溶液用補(bǔ)充有胰蛋白酶的試驗(yàn)培養(yǎng)基稀釋至SOOyg/mh-角叉菜膠，得到比 例為1:2的培養(yǎng)基和樣品基質(zhì)的含1:500胰蛋白酶的混合料。隨后進(jìn)行系列稀釋，保持基質(zhì) 條件固定。將lml測試樣品稀釋液加入到lml CMC培養(yǎng)基中并劇烈渦旋。將用于感染/未感染 對照的CMC培養(yǎng)基與等體積的含1:500胰蛋白酶的試驗(yàn)培養(yǎng)基和基質(zhì)1: 2混合料合并，并劇 烈混合。將覆蓋物培養(yǎng)基保持在37°C水浴中。臨用前將溶液簡單渦旋并傾入深孔板的各孔 中。最終的覆蓋物培養(yǎng)基:含4mM L-谷氨酰胺、ABAM、胰蛋白酶1:1000和2.25%CMC的Opti-Pro。在沒有病毒的存在下進(jìn)行相同操作作為毒性對照。
[0061 ] 對于免疫染色，將覆蓋物培養(yǎng)基用100μ1 PBS稀釋并抽吸。向各孔加入100μΙ PBS。 在微量培養(yǎng)板振蕩器上以最大速度對板進(jìn)行短暫劇烈攪拌，然后抽吸PBS。如果CMC晶體仍 然靜止在細(xì)胞層上，重復(fù)洗滌兩次或更多次。加入1〇〇μ1冷甲醇/丙酮固定劑，將板于-20°C 溫育20-30分鐘，除去固定劑后放置干燥。
[0062] 在與100μΙ封閉緩沖液一起溫育1小時(shí)后，將板用PBS洗滌1次，與50μ1抗體稀釋液 (抗-ΝΡ 1: 500) -起于室溫溫育1小時(shí)。洗滌后加入檢測抗體(稀釋1:1000)，于室溫保持接 觸1小時(shí)，然后排空板，再次用洗滌緩沖液洗滌3次和用PBS洗滌1次。加入100μΙ底物。向6個 孔w/o(=無)細(xì)胞中填充底物并用作空白。10-15分鐘后，用100μΙ 1Ν硫酸終止反應(yīng)。轉(zhuǎn)移 100μΙ至96孔平底板，于450nm測量吸光度。
[0063] 評價(jià):從所有測量值和所計(jì)算的6次重復(fù)試驗(yàn)的平均值(原始數(shù)據(jù)）中減去空白樣 品的平均值。從所有測量值中減去未感染樣品的平均值。將數(shù)值對感染樣品的平均值進(jìn)行 標(biāo)準(zhǔn)化，從100中減去所得到的值，得到以未感染樣品的百分比表示的抑制。在示意圖中，將 抑制和空白校正的原始數(shù)據(jù)對I-角叉菜膠稀釋液的濃度繪圖。如上所述計(jì)算了對腺病毒的 IC50 值。
[0064]
[0065] 表2:ι-角叉菜膠對流感H7N7病毒的IC5Q值依賴于NaCl濃度。所有值以μg/ml計(jì)[MA =200m0sm/L 甘露醇]
[0066]實(shí)施例3:用于治療眼感染的抗病毒滴眼劑制劑 [0067] t-角叉菜膠：2.4mg/ml
[0068] 甘露醇：36 · 4mg/ml
[0069] 摩爾滲透壓濃度:200m0sm/L(同滲質(zhì)量摩爾濃度：192m0sm/kg)
[0070] 粘度:76mPa.s
[0071] 水加至 100%
[0072] 實(shí)施例4:用于治療眼感染的滴眼劑抗病毒制劑
[0073] t-角叉菜膠：1.2mg/ml
[0074] 甘露醇：36.4mg ml
[0075] 摩爾滲透壓濃度:200m0sm/L(同滲質(zhì)量摩爾濃度：193m0sm/kg)
[0076] 粘度:8-15mPa.s
[0077] 水加至 100%
[0078] 實(shí)施例5:
[0079] 男性志愿者患有角膜結(jié)膜炎約連續(xù)10天?；颊邎?bào)告有眼睛發(fā)紅、流淚量增加、雙眼 瘙癢和灼感，最可能因病毒感染導(dǎo)致。用實(shí)施例3的滴眼劑溶液以每天3次、每只眼5滴、持續(xù) 5天的劑量方案治療志愿者。在第一天后，志愿者報(bào)告癥狀如瘙癢和發(fā)紅減輕。在治療期間 病理狀態(tài)持續(xù)改善，在第5天因臨床相關(guān)癥狀完全消失而中斷治療。在14天觀察期內(nèi)未出現(xiàn) 復(fù)發(fā)。
[0080] 實(shí)施例6:1-角叉菜膠對角膜內(nèi)感染禽流感病毒A/H7N7的小鼠的抗病毒作用
[0081 ] H7N7型流感病毒主要通過眼感染進(jìn)入體內(nèi)。已經(jīng)證實(shí)H7N7型對人和小鼠是高度致 病的。在最嚴(yán)重的病例中，如果病毒從原發(fā)感染部位擴(kuò)散至肺，可隨后發(fā)生致死性后果。在 C57BL6小鼠中，眼內(nèi)感染流感病毒H7N7A/土耳其/德國/R11/01導(dǎo)致致死性后果。該模型用 于測試實(shí)施例4中所述的藥物組合物。
[0082] 用5μ1含有1.5xl05個流感病毒H7N7A/土耳其/德國/R11/01的噬斑形成單位(pfU) 的混懸液使3周齡C57BL6小鼠（10只/組）眼內(nèi)感染。在感染后立即用含36.4mg/ml甘露醇的 安慰劑制劑或?qū)嵤├?中所述的制劑開始治療。小鼠歷經(jīng)10天的時(shí)間分別用^-角叉菜膠制 劑或安慰劑進(jìn)行治療，每日2次。14天后，安慰劑治療的小鼠有80%死亡。相反-角叉菜膠 治療的小鼠有50%存活并且從感染中恢復(fù)(參見圖1)。使指數(shù)系列檢定(Prism 55.02版)進(jìn) 行統(tǒng)計(jì)學(xué)評價(jià)揭示2組之間存在顯著性差異，p-值為0.0492。因此，可以得出如下結(jié)論:用如 實(shí)施例4所述的角叉菜膠制劑眼內(nèi)治療小鼠在用致死劑量的流感H7N7病毒眼內(nèi)感染的小 鼠的存活率中產(chǎn)生了顯著的作用。
[0083] 實(shí)施例7 (f 2)
[0084] 用于治療眼感染的抗病毒滴眼劑制劑 [0085] t-角叉菜膠：2.4mg/ml
[0086] 甘露醇：23.50mg/ml
[0087] Na2HP〇4 ： 3.67mg/ml
[0088] 梓樣酸：0 · 46mg/ml
[0089] 乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物(EDTA): lmg/ml
[0090] 水加至 100 %
[0091 ] 摩爾滲透壓濃度：195m0sm/kg
[0092] 粘度：7.9mPa.s
[0093] pH=6.8
[0094] 實(shí)施例 8(f4) _5] 用于治療眼感染的抗病毒滴眼劑制劑 [0096] t-角叉菜膠：2.4mg/ml
[0097] 甘露醇：38 · 4mg/ml
[0098] Na2HP〇4：3.67mg/ml
[0099] 梓樣酸:0.46mg/ml
[0100] 乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物(EDTA): lmg/ml
[0101] 水加至 100%
[0102] 摩爾滲透壓濃度：291m0sm/kg
[0103] 粘度：12.4mPa.s
[0104] ρΗ=6·70
[0105] 實(shí)施例 9(f4S)
[0106] 用于治療眼感染的抗病毒滴眼劑制劑 [0107] t-角叉菜膠：2.4mg/ml
[0108] 山梨醇：40.0 mg/ml
[0109] Na2HP〇4：3.67mg/ml
[0110] 梓樣酸:0.46mg/ml
[0111] 乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物(EDTA): lmg/ml
[0112] 水加至 100%
[0113] 摩爾滲透壓濃度：291mOsm/kg
[0114] 粘度：15.7mPa.s
[0115] pH=6.79
[0116] 實(shí)施例 10(f5d)
[0117] 用于治療眼感染的抗病毒滴眼劑制劑
[0118] t-角叉菜膠：3.20mg/ml [0119]甘露醇：38 · 4mg/ml
[0120] Na2HP〇4：3.67mg/ml
[0121] 梓檬酸:0.46mg/ml
[0122] 乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物(EDTA): lmg/ml
[0123] 水加至 100%
[0124] 摩爾滲透壓濃度：290m0sm/kg
[0125] 粘度:44.8mPa.s
[0126] ρΗ=6·77
[0127] 實(shí)施例ll(f5S)
[0128] 用于治療眼感染的抗病毒滴眼劑制劑
[0129] t-角叉菜膠:3.2mg/ml
[0130] 山梨醇:40.0 mg/ml
[0131] Na2HP〇4：3.67mg/ml
[0132] 檸檬酸:0.46mg/ml
[0133] 乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物(EDTA): lmg/ml
[0134] 水加至 100%
[0135] 摩爾滲透壓濃度：289mOsm/kg
[0136] 粘度:43.6mPa.s
[0137] 實(shí)施例12
[0138] 用于制備制劑的通用方法
[0139] 將^-角叉菜膠在恒定攪拌下溶于水中，得到2.4mg/ml溶液。然后加入所有另外的 化合物，并在恒定攪拌下溶解。將最終溶液加熱至約80°C，通過帶有玻璃纖維預(yù)濾膜的0.22 Mi醋酸纖維素膜進(jìn)行無菌過濾。
[0140]制劑粘度的測量
[0141] 使用粘度計(jì)Rheoplus/32V3.4021004590-33024測定粘度。每份樣品使用兩次不同 測量進(jìn)行分析，各自包括3個記錄時(shí)間點(diǎn)（20、40和60秒）。
[0142] 實(shí)施例13
[0143] 實(shí)施例7-11的制劑對抗腺病毒8和19 (AdV8和AdVl 9)的抗病毒活性評價(jià)
[0144] 通過AdV8和AdV19的體外復(fù)制抑制測試了制劑7-11的抗病毒活性。
[0145] 在(f2)、（f4)、（f4S)、（f5)和(f5S)制劑的存在下用AdV感染A549細(xì)胞，與含有測試 制劑的半流體覆蓋物一起進(jìn)一步溫育5天。感染在50%相應(yīng)制劑基質(zhì)的存在下進(jìn)行，溫育在 17%相應(yīng)制劑基質(zhì)的存在下進(jìn)行。根據(jù)通過免疫染色檢測的AdV蛋白質(zhì)的相對量評價(jià)了對 病毒復(fù)制的抑制。
[0146] 試驗(yàn)在96孔板中進(jìn)行，對每個測試樣品溶液和感染和未感染對照重復(fù)5次試驗(yàn)。將 病毒和樣品稀釋液在100%相應(yīng)安慰劑中溫育，用培養(yǎng)基稀釋，然后將混合物加入細(xì)胞中用 于感染。感染后，培養(yǎng)基由在具有ABAM和2 %FBS的DMEM中的17 %相應(yīng)安慰劑組成，并且補(bǔ)充 有2.5%CMC(含L-谷氨酰胺(DMEM)與10%胎牛血清(FBS)的高葡萄糖）。卜角叉菜膠濃度為 400-2 · 3μg/ml (稀釋1:1 · 77)。
[0147] 感染后5天，根據(jù)通過免疫染色檢測的所生成的AdV蛋白質(zhì)的相對量評價(jià)了對病毒 復(fù)制的抑制。
[0148] 用未感染細(xì)胞平行進(jìn)行了毒性對照。
[0149] 細(xì)胞：
[0150] 在試驗(yàn)前24小時(shí)，將1.7xl04個細(xì)胞接種至96孔組織培養(yǎng)板。
[0151] 測試樣品稀釋：
[0152] 在相應(yīng)安慰劑中制備測試樣品的4-倍濃縮的1:1.77稀釋系列。
[0153] 預(yù)防性治療和感染：
[0154] 將病毒儲備液的等分試樣在冷自來水中解凍，在渦旋器上簡單攪拌。在相應(yīng)安慰 劑中制備4-倍濃縮的病毒。
[0155] 將等體積的4-倍濃縮的系列稀釋測試樣品或相應(yīng)安慰劑（對于陽性對照=感染 的，陰性對照=未感染的）和4-倍濃縮的病毒稀釋液混合，于RT溫育30分鐘。用等體積的 DMEM+ABAM+2 % FBS稀釋病毒和樣品混合物或安慰劑(感染的，未感染的對照）。將等體積的 樣品稀釋液和特定基質(zhì)混合用于毒性對照。
[0156] 用培養(yǎng)基+ABAM w/o FCS洗滌細(xì)胞，然后向細(xì)胞中加入30μ1病毒（1500(AdV8)或 1300(AdV19)TCID50)/樣品混合物、僅病毒(感染的，inf)或基質(zhì)w/o病毒(未感染的，ni)或 樣品w/o病毒（tox)。試驗(yàn)基質(zhì)為在含有ABAM和2%FBS的DMEM中的50%安慰劑。將板于37°C 溫育1小時(shí)。然后將接種物用1〇〇μ1培養(yǎng)基+ABAM+2 % FBS稀釋并抽吸。
[0157] 感染后治療：
[0158] 通過合并等體積的雙重濃縮系列稀釋測試樣品或稀釋培養(yǎng)基(感染的，未感染的 對照)制備了覆蓋培養(yǎng)基。將細(xì)胞與1 〇〇μ1覆蓋培養(yǎng)基一起于37 °C溫育5天。
[0159] 免疫染色：
[0160] 將覆蓋培養(yǎng)基用100μ1 PBS(Dulbecco's PBS w/o Ca，Mg)稀釋并抽吸。通過在微 量培養(yǎng)板振動器上以900rpm短暫攪拌將板用100μ1 PBS洗滌2次。通過在紙巾上輕拍板除去 殘留液體，然后向細(xì)胞中加入1〇〇μ1冷甲醇/丙酮混合物。將板于-20 °C溫育20-30分鐘。然后 抽吸固定劑，將板放置干燥。
[0161] 與100μ1封閉緩沖液一起溫育45分鐘后，將板用洗滌緩沖液洗滌1次，隨后與50μ1 抗體稀釋液（1:1000,在洗滌緩沖液中）一起于RT溫育1小時(shí)。然后排空板，用洗滌緩沖液洗 滌3次，然后加入檢測抗體(在洗滌緩沖液中1:1000稀釋）。于RT 1小時(shí)后，排空板，用洗滌緩 沖液洗滌2次，用PBS洗滌2次。加入100μ1底物。向6個孔w/o( =無)細(xì)胞中填充底物并用作空 白。10分鐘后，用1〇〇μ1 1N硫酸終止反應(yīng)。轉(zhuǎn)移100μ1至96孔平底板，于450nm測定吸光度。
[0162] 將未經(jīng)處理的受感染細(xì)胞的吸光度設(shè)定為100%，而將未受感染的經(jīng)處理的細(xì)胞 的吸光度設(shè)定為0%。使用標(biāo)準(zhǔn)擬合軟件ExcelFit計(jì)算IC50值。
[0163] 基于抑制曲線，計(jì)算了測試制劑的達(dá)到50%病毒抑制所必需的角叉菜膠濃度 (IC5Q)，結(jié)果概括在表3中。
[0164]
[0165] 95 % Cl = 95 %置信區(qū)間，95 %的置信區(qū)間觀察值將保持參數(shù)的真實(shí)值。
[0166] 實(shí)施例14: EDTA對抵抗ADV8的抗病毒活性的影響
[0167] 在研究AdV8抑制的體外試驗(yàn)中比較了含EDTA(f2/EDTA)的制劑對比于相應(yīng)的不含 Η)ΤΑ的制劑(f2w/o EDTA)的抗病毒活性。
[0168] 測試制劑：
[0169] (f2/EDTA)：
[0170] t-角叉菜膠:2.4mg/ml
[0171] 甘露醇：23.50mg/ml
[0172] Na2HP〇4：3.67mg/ml
[0173] 檸檬酸:0.46mg/ml
[0174] 乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物(EDTA) :lmg/ml
[0175] 水加至 100%
[0176] (f2w/o EDTA)：
[0177] t-角叉菜膠:2.4mg/ml
[0178] 甘露醇：23.50mg/ml
[0179] Na2HP〇4：3.67mg/ml
[0180] 檸檬酸:0.46mg/ml
[0181] 水加至 100%
[0182] 按照實(shí)施例14中所述的方法并略微修改方案，進(jìn)行本試驗(yàn)。
[0183] 在本試驗(yàn)設(shè)置中，將病毒在制劑的存在下溫育10分鐘，所述制劑在相應(yīng)的安慰劑 中稀釋，其在培養(yǎng)基中的終濃度為33 %制劑基質(zhì)。因此，在處于培養(yǎng)基中的17 %制劑基質(zhì)的 存在下用腺病毒(AdV8)感染A549細(xì)胞，進(jìn)一步與含有測試制劑（同樣是處于培養(yǎng)基中的 17%制劑基質(zhì)）的半液體覆蓋物一起溫育5天。根據(jù)通過免疫染色檢測的所生成的AdV蛋白 質(zhì)的相對量評價(jià)了對病毒復(fù)制的抑制。
[0184] 基于抑制曲線，計(jì)算了測試制劑的達(dá)到50%病毒抑制所必需的角叉菜膠濃度 (IC5Q)，結(jié)果概括在表4中。結(jié)果顯示:在滴眼劑制劑中添加 EDTA導(dǎo)致抗病毒活性高于相應(yīng)的 不含EDTA的制劑。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 藥物組合物，包含抗病毒有效量的I角叉菜膠作為抗病毒活性成分，該藥物組合物用 作用于預(yù)防性或治療性局部處置由D亞型的腺病毒或H7亞型的A型流感病毒引起的病毒性 眼感染的藥劑，條件是其即可使用制劑形式的該組合物含有不超過〇.5%w/v的金屬鹵化物 鹽。2. 權(quán)利要求1的用于所述用途的組合物，其中該組合物含有不超過0.1%w/v的所述金 屬鹵化物鹽或基本上不含金屬鹵化物鹽。3. 權(quán)利要求1或2的用于所述用途的組合物，其中金屬鹵化物鹽選自氯化鈉和氯化鉀。4. 權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的用于所述用途的組合物，其中該組合物還包含選自單糖、二 糖、寡糖和低分子量多元醇的同滲質(zhì)量摩爾濃度調(diào)節(jié)劑。5. 權(quán)利要求4的用于所述用途的組合物，其中同滲質(zhì)量摩爾濃度調(diào)節(jié)劑選自葡萄糖、果 糖、蔗糖、甘露糖、甘油、赤蘚醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、木糖醇、蘇糖醇和麥芽糖醇。6. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的用于所述用途的組合物，其中該組合物還包含至少一種眼科 上相容的添加劑，所述添加劑選自pH調(diào)節(jié)劑、表面活性劑、抗微生物防腐劑和抗氧化劑。7. 用于局部施用的眼用藥物組合物，其包含濃度為即可使用制劑的0.05%-1%重量的 i角叉菜膠，條件是其即可使用制劑形式的該組合物含有不超過〇.5%w/v的金屬鹵化物鹽。8. 權(quán)利要求7的組合物，其中t角叉菜膠的濃度為即可使用制劑的0.1-0.5%重量。9. 權(quán)利要求7或8的組合物，其中該組合物含有不超過0.1 %w/v的所述金屬鹵化物鹽或 基本上不含金屬鹵化物鹽。10. 權(quán)利要求7-9任一項(xiàng)的組合物，其中金屬鹵化物鹽選自氯化鈉和氯化鉀。11. 權(quán)利要求7-10任一項(xiàng)的組合物，其中該組合物還包含選自單糖、二糖、寡糖和低分 子量多元醇的同滲質(zhì)量摩爾濃度調(diào)節(jié)劑。12. 權(quán)利要求11的組合物，其中同滲質(zhì)量摩爾濃度調(diào)節(jié)劑選自葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露 糖、甘油、赤蘚醇、甘露醇、山梨醇、肌醇、木糖醇、蘇糖醇和麥芽糖醇。13. 權(quán)利要求7-12任一項(xiàng)的組合物，其中該組合物還包含至少一種適宜的局部眼用相 容性添加劑，所述添加劑選自pH調(diào)節(jié)劑或緩沖系統(tǒng)、表面活性劑、抗微生物防腐劑和抗氧化 劑。14. 權(quán)利要求7-13任一項(xiàng)的組合物，還包含水。15. 權(quán)利要求14的組合物，其中所述同滲質(zhì)量摩爾濃度調(diào)節(jié)劑選自甘露醇或山梨醇，所 述至少一種眼科上相容的添加劑是pH調(diào)節(jié)劑或緩沖系統(tǒng)，該組合物還包含乙二胺四乙酸二 鈉鹽二水合物(EDTA)。16. 權(quán)利要求15的組合物，其中I-角叉菜膠以0.2-0.4%重量的濃度存在。17. 權(quán)利要求15或16的組合物，其中乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物（EDTA)以0.05%- 0.2% (w/v)的濃度存在。18. 權(quán)利要求16的組合物，其中乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物(EDTA)以0.1 % (w/v)的 濃度存在。19. 權(quán)利要求15-18任一項(xiàng)的組合物，其中所述緩沖系統(tǒng)是Na2HP〇4/檸檬酸的混合物。20. 權(quán)利要求15-19任一項(xiàng)的組合物，具有10-50mPa.s的粘度、6.0-8.0的pH值和280-320m0sm/kg的同滲質(zhì)量摩爾濃度。21. 權(quán)利要求15-20任一項(xiàng)的組合物，其中該組合物還包含一種眼科上相容的添加劑， 所述添加劑選自表面活性劑、抗微生物防腐劑和抗氧化劑。22.權(quán)利要求15-20任一項(xiàng)的組合物，為具有如下組成的滴眼劑形式： i -角叉菜膠:3.2mg/ml 山梨醇:40.0 mg/ml Na2HP〇4： 3.67mg/ml 梓檬酸:〇.46mg/ml 乙二胺四乙酸二鈉鹽二水合物(EDTA): lmg/ml 水加至100 %。
【文檔編號】A61K31/731GK105939720SQ201580005116
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2015年1月20日
【發(fā)明人】E·普里施爾-格拉索爾, M·莫羅庫蒂-庫爾茲, A·格拉索爾, S·納科維奇, A·博登泰希, M·凱尼格-舒斯特, C·科勒, F·皮洛塔茨
【申請人】尼科斯股份有限公司