白術(shù)提取物及其在抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方面應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種白術(shù)提取物及其在抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方面應(yīng)用，涉及中藥醫(yī)療領(lǐng)域，該提取物的制備方法為取白術(shù)藥材或飲片粉碎清洗后，浸泡，離心，烘干，加入過氧化氫水溶液攪拌后，濾取白術(shù)處理粉末，烘干，在白術(shù)處理粉末中摻入抗壞血酸，用乙醇溶液先超聲微波提取，再回流提取，抽濾，回收濾液，過0.2μm微濾膜進行微濾澄清，濾液減壓濃縮，經(jīng)過體內(nèi)外實驗證明，所述白術(shù)提取物可以單獨用于抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌也可以用于抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方面的抗生素的增敏劑。
【專利說明】白術(shù)提取物及其在抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方面應(yīng)用 技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及中藥醫(yī)療領(lǐng)域，具體涉及一種白術(shù)提取物及其在抗耐甲氧西林金黃色 葡萄球菌方面應(yīng)用。 【背景技術(shù)】
[0002] 白術(shù)為菊科植物白術(shù)的干燥根莖。白術(shù)中含有多糖、蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯、揮發(fā)油、氨 基酸及樹脂等成分，其對調(diào)節(jié)胃腸運動、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老都具有一定的 藥理作用。白術(shù)非極性部位提取物，包括揮發(fā)油，具有很強的生物活性，目前主要用于制成 抗腫瘤的藥物或保健品等，還少有用于抑菌治療方面的報道。
[0003] 申請?zhí)枮?01510770416.6的發(fā)明申請公開了"具有抗帕金森作用的白術(shù)內(nèi)酯提取 物、制備方法及其應(yīng)用，提取出白術(shù)中的有效成分白術(shù)內(nèi)酯用于治療帕金森，其中加入了雙 氧水對白術(shù)進行氧化，用鋅粒保護氧化的產(chǎn)物，這種提取白術(shù)內(nèi)酯的方法有可取之處，但 是，并沒有考慮到雙氧水易揮發(fā)，高溫易分解，分解產(chǎn)物為大量的氧氣具有危險性等問題， 而鋅粒在提取物中雖然起到保護作用，但是由于鋅粒為固體，在提取過程中容易堵塞提取 管道，不方便流動，也沒有其他影響功效，使用不方便，如需使用，需要對該方法進行改進。
[0004] 金黃色葡萄球菌是臨床十分常見的病原菌之一，自1961年研究人員首次分離出耐 甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)以來，其臨床檢出率逐年上升，20世紀80年代后期已成為 全球性的病原菌，居于醫(yī)院感染病原菌首位。由其引起的感染與乙型肝炎、艾滋病并列為世 界范圍內(nèi)的三大難以解決的感染性疾病。由于其致病力強，傳播速度快，常出現(xiàn)多重耐藥 性，在醫(yī)院內(nèi)播散可導(dǎo)致病區(qū)內(nèi)的暴發(fā)流行。當人體抵抗力低下時趁虛而入，對人體組織器 官造成化膿性炎癥甚至?xí)鹉X膜炎、心內(nèi)膜炎和敗血癥等危重的致死性疾病。尤其是近 幾年來，對糖肽類抗生素萬古霉素和替考拉寧的敏感性降低，因此十分迫切的需要研發(fā)可 替代抗生素的藥物。
[0005] 中草藥治療細菌性感染疾病，其最大的優(yōu)點就是不易產(chǎn)生耐藥性，并且中藥的毒 副作用較小，抑菌作用廣泛，被機體吸收后能夠增進機體抵抗病原微生物的能力。雖然對治 療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的藥物中含有白術(shù)，但是對于采用不同的提取方法從白 術(shù)得到提取物也是不同的。使用本發(fā)明的提取方法得到白術(shù)提取物對金黃色葡萄球菌進行 摸索性的體內(nèi)外的抑菌研究，期望白術(shù)提取物未來可以抗菌藥物治療金黃色葡萄球菌引起 的疾病。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的問題是提供一種白術(shù)提取物及其在抗耐甲氧西林金黃色葡萄 球菌方面應(yīng)用。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:一種白術(shù)提取物，該提取物的制備 方法包括：
[0008] (1)取白術(shù)藥材或飲片粉碎過60目篩，20-30°C條件下用雙蒸水沖洗干凈，離心得 到固體，并加入雙蒸水浸泡6-12h，再離心后，得到的固體經(jīng)恒溫箱內(nèi)干燥，溫度控制在40-50°C，得到白術(shù)粉末；
[0009] (2)室溫下，向白術(shù)粉末中加入1-3倍體積的過氧化氫水溶液和0.1-0.5%的焦磷 酸鈉攪拌〇. 5-lh后，抽濾濾取白術(shù)處理粉末；
[0010] ⑶將步驟⑵中得到的白術(shù)處理粉末置于通風(fēng)櫥內(nèi)用紫外燈進行照射，連續(xù)照射 10次，每次l-3min，每次照射后對白術(shù)處理粉末進行翻攤；
[0011] (4)將步驟(3)中的得到的粉末通過減壓干燥的方法在真空干燥箱中進行烘干，烘 干的溫度為40-50 °C;
[0012] (5)在白術(shù)處理粉末中摻入10-20 %抗壞血酸，加入1-2倍30-50 %乙醇溶液進行超 聲微波提取10_30min，功率為200-300W;
[0013] (6)將步驟5中所得到的提取液可采用色譜法、回流法進行分離純化；
[0014] 具體提取步驟如下：
[0015] 色譜法：將提取液過聚酰胺樹脂柱，依次用2-4倍柱體積的水、3-5倍柱體積的 20 % -40 %乙醇、2-3倍柱體積的60 % -90 %乙醇洗脫，控制洗脫液流速為1 -2倍柱體積/h;合 并洗脫液。
[0016] 回流法:將提取液用5-12倍30-50 %乙醇溶液60-70 °C回流提取6-8h，抽濾，回收濾 液。
[0017] (7)將步驟6中得到白術(shù)提取液可采用低溫重結(jié)晶法、減壓濃縮法得到最終的白術(shù) 提取物。
[0018] 具體提取步驟如下：
[0019] 低溫重結(jié)晶法:加入1-2倍體積的加熱至沸騰的乙醇，加到白術(shù)提取液中，用冰水 冷卻乙醇，有結(jié)晶析出，過濾，收集析出的晶體，得到白術(shù)提取物。
[0020] 減壓濃縮法:將白術(shù)提取液用0.2μπι微濾膜進行微濾澄清，將分離液減壓濃縮，冷 凍干燥，得到白術(shù)提取物。
[0021 ]優(yōu)選的，該提取物的最優(yōu)制備方法：
[0022] (1)取白術(shù)藥材或飲片粉碎過60目篩，25°C條件下用雙蒸水沖洗干凈，離心得到固 體，并加入雙蒸水浸8h，再離心后，得到的固體經(jīng)恒溫箱內(nèi)干燥，溫度控制在40°C，得到白術(shù) 粉末；
[0023] (2)室溫下，向白術(shù)粉末中加入3倍體積的過氧化氫水溶液和0.2%的焦磷酸鈉攪 拌lh后，抽濾濾取白術(shù)處理粉末；
[0024] (3)將步驟(2)中得到的白術(shù)處理粉末置于通風(fēng)櫥內(nèi)用紫外燈進行照射，連續(xù)照射 10次，每次2min，每次照射后對白術(shù)處理粉末進行翻攤；
[0025] (4)將步驟(3)中的得到的粉末通過減壓干燥的方法在真空干燥箱中進行烘干，烘 干的溫度為40 °C;
[0026] (5)在白術(shù)處理粉末中摻入10 %抗壞血酸，加入2倍40 %乙醇溶液進行超聲微波提 取30min，功率為300W;
[0027] (6) 12倍40 %乙醇溶液65 °C回流提取6h，抽濾，回收濾液；
[0028] (7)將白術(shù)提取液用0.2μπι微濾膜進行微濾澄清，將分離液減壓濃縮，冷凍干燥，得 到白術(shù)提取物。
[0029] 優(yōu)選的，所述白術(shù)提取物可為口服制劑或者皮膚外用制劑。
[0030] 優(yōu)選的，這種白術(shù)提取物可應(yīng)用于抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方面。
[0031] 優(yōu)選的，所述白術(shù)提取物的研究方法包括體外抑菌實驗和動物實驗。
[0032] 優(yōu)選的，所述體外抑菌實驗包括采用牛津杯法測定抗菌活性，采用二倍稀釋法測 定最低抑菌濃度MIC。
[0033] 優(yōu)選的，所述動物實驗采用豚鼠中耳炎模型。
[0034] 優(yōu)選的，所述白術(shù)提取物可以單獨用于抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。
[0035] 優(yōu)選的，所述白術(shù)提取物可以用于抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方面的抗生素的 增敏劑。
[0036]優(yōu)選的，所述抗生素為氧氟沙星。
[0037] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明的優(yōu)點之一在于公開白術(shù)提取物的提取制備方 法，本發(fā)明采用對白術(shù)進行先氧化再保護氧化產(chǎn)物的方法提高白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯的含量，選 用乙醇水溶液進行提取其中有效成分，而不是乙酸乙酯、石油醚這樣的有機溶劑，這樣的提 取方法投入市場時，既可以單獨投入處理好的白術(shù)中藥，這種具有較便宜，藥效提高的優(yōu) 點，也可以制成西藥劑型，這種具有雖然價格較高，但方便使用，劑型的安全性高的優(yōu)點，通 過這樣的處理實現(xiàn)了中藥方劑和西藥中的劑型的合理融合，靈活性大，可調(diào)節(jié)性強。
[0038] 其中，加雙蒸水浸泡，可以去除部分多糖，提高白術(shù)提取物的純度，另外過氧化氫 水溶液的使用可將白術(shù)中的蒼術(shù)酮等物質(zhì)氧化成白術(shù)內(nèi)酯類化合物，針對過氧化氫存在易 揮發(fā)，高溫易分解，分解產(chǎn)物為大量的氧氣具有危險性等缺點，在氧化反應(yīng)過程中加入常用 的食品添加劑焦磷酸鈉，在反應(yīng)中起到穩(wěn)定劑的作用，在氧化后，通風(fēng)條件下用紫外燈短波 照射分解多余的過氧化氫同時對白術(shù)進行二次氧化，提高產(chǎn)率，同時過氧化氫水溶液還具 有殺菌消毒的作用，特別是作為中藥進行市場投放時，可以減少長期放置的白術(shù)的微生物 的滋生。
[0039] 通過天然的抗氧化劑抗壞血酸保護生成的白術(shù)提取物，使其避免被進一步氧化而 降解，抗壞血酸為水溶性的維生素，安全可靠，直接添加在白術(shù)提取物中，無需二次處理，也 可以增強人體的抵抗力，過量使用可以通過血液循環(huán)排出，不會影響人體的健康。
[0040] 優(yōu)點之二在于研究白術(shù)提取物在抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方面的體內(nèi)外作 用，并對提取物中的細節(jié)進行優(yōu)化，意圖開發(fā)出更高活性的提取物用于抗菌抗炎方面。
[0041] 優(yōu)點之三在于研究白術(shù)提取物對其他藥物抗菌的增敏效果，減少西藥的使用量， 減少其副作用，同時也克制現(xiàn)在抗生素濫用所致的細菌耐藥性。
[0042] 為使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合 【具體實施方式】，進一步闡述本發(fā)明。 【附圖說明】
[0043] 圖1為實施例6中白術(shù)提取物對MRSA致中耳炎模型豚鼠中耳腔內(nèi)金黃色葡萄球菌 含量的影響；
[0044] 圖2為實施例7中白術(shù)提取物對MRSA致中耳炎模型豚鼠中耳腔內(nèi)金黃色葡萄球菌 含量的影響；
[0045] 圖3為實施例8中白術(shù)提取物對MRSA致中耳炎模型豚鼠中耳腔內(nèi)金黃色葡萄球菌 含量的影響。 【具體實施方式】
[0046] 實施例1:
[0047]制備白術(shù)提取物
[0048] (1)取300g白術(shù)藥材或飲片（合肥百姓緣大藥房提供)粉碎過60目篩，25°C條件下 用雙蒸水沖洗干凈，離心得到固體，并加入雙蒸水浸泡12h，再離心后，得到的固體經(jīng)恒溫箱 內(nèi)干燥，溫度控制在45 °C，得到白術(shù)粉末；
[0049] (2)室溫下，向白術(shù)粉末中加入3倍體積的過氧化氫水溶液和0.1 %的焦磷酸鈉攪 拌〇. 5h后，抽濾濾取白術(shù)處理粉末；
[0050] (3)將步驟(2)中得到的白術(shù)處理粉末置于通風(fēng)櫥內(nèi)用紫外燈進行照射，連續(xù)照射 10次，每次2min，每次照射后對白術(shù)處理粉末進行翻攤；
[0051] (4)將步驟(3)中的得到的粉末通過減壓干燥的方法在真空干燥箱中進行烘干，烘 干的溫度為45 °C;
[0052] (5)在白術(shù)處理粉末中摻入20 %抗壞血酸，加入2倍50 %乙醇溶液進行超聲微波提 取20min，功率為250W;
[0053] (6) 12倍50 %乙醇溶液70 °C回流提取7h，抽濾，回收濾液；
[0054] (7)將白術(shù)提取液用0.2μπι微濾膜進行微濾澄清，將分離液減壓濃縮，冷凍干燥，得 到白術(shù)提取物，所得的白術(shù)提取物的收率為6.45 %。
[0055] 實施例2:
[0056]制備白術(shù)提取物
[0057] (1)取300g白術(shù)藥材或飲片（合肥百姓緣大藥房提供)粉碎過60目篩，25°C條件下 用雙蒸水沖洗干凈，離心得到固體，并加入雙蒸水浸8h，再離心后，得到的固體經(jīng)恒溫箱內(nèi) 干燥，溫度控制在40 °C，得到白術(shù)粉末；
[0058] (2)室溫下，向白術(shù)粉末中加入3倍體積的過氧化氫水溶液和0.2%的焦磷酸鈉攪 拌lh后，抽濾濾取白術(shù)處理粉末；
[0059] (3)將步驟(2)中得到的白術(shù)處理粉末置于通風(fēng)櫥內(nèi)用紫外燈進行照射，連續(xù)照射 10次，每次2min，每次照射后對白術(shù)處理粉末進行翻攤；
[0060] (4)將步驟(3)中的得到的粉末通過減壓干燥的方法在真空干燥箱中進行烘干，烘 干的溫度為40 °C;
[00611 (5)在白術(shù)處理粉末中摻入10 %抗壞血酸，加入2倍40 %乙醇溶液進行超聲微波提 取30min，功率為300W;
[0062] (6) 12倍40 %乙醇溶液65 °C回流提取6h，抽濾，回收濾液；
[0063] (7)將白術(shù)提取液用0.2μπι微濾膜進行微濾澄清，將分離液減壓濃縮，冷凍干燥，得 到白術(shù)提取物，所得的白術(shù)提取物的收率為9.50%。
[0064] 實施例3:
[0065]制備白術(shù)提取物
[0066] (1)取300g白術(shù)藥材或飲片（合肥百姓緣大藥房提供)粉碎過60目篩，25°C條件下 用雙蒸水沖洗干凈，離心得到固體，并加入雙蒸水浸8h，再離心后，得到的固體經(jīng)恒溫箱內(nèi) 干燥，溫度控制在40 °C，得到白術(shù)粉末；
[0067] (2)室溫下，向白術(shù)粉末中加入3倍體積的過氧化氫水溶液和0.2%的焦磷酸鈉攪 拌lh后，抽濾濾取白術(shù)處理粉末；
[0068] (3)將步驟(2)中得到的白術(shù)處理粉末置于通風(fēng)櫥內(nèi)用紫外燈進行照射，連續(xù)照射 10次，每次2min，每次照射后對白術(shù)處理粉末進行翻攤；
[0069] (4)將步驟(3)中的得到的粉末通過減壓干燥的方法在真空干燥箱中進行烘干，烘 干的溫度為40 °C;
[0070] (5)在白術(shù)處理粉末中摻入10 %抗壞血酸，加入2倍40 %乙醇溶液進行超聲微波提 取30min，功率為300W;
[0071] (6)將提取液過聚酰胺樹脂柱，依次用3倍柱體積的水、4倍柱體積的30%乙醇、3倍 柱體積的60 %乙醇洗脫，控制洗脫液流速為1.5倍柱體積/h;合并洗脫液；
[0072] (7)加入1.5倍加熱至沸騰的乙醇，加到白術(shù)提取液中，用冰水冷卻乙醇，有結(jié)晶析 出，過濾，收集析出的晶體，得到白術(shù)提取物，所得的白術(shù)提取物的收率為8.03%。
[0073] 實施例4:
[0074]抗菌活性檢測
[0075] 采用牛津杯法測定抗菌活性，牛津杯法的實驗步驟為吸取菌懸液O.lmL均勻涂布 后，在平板上等距離放入4個經(jīng)滅菌后的牛津杯，逐一加入100yL的白術(shù)提取物。37°C恒溫培 養(yǎng)24h，觀察抑菌情況，用游標卡尺記錄抑菌圈直徑大小，結(jié)果以_表示。各菌重復(fù)3次。其中 當抑菌直徑2 20為極敏感，15mm <抑菌直徑<20mm為高敏，10mm <抑菌直徑<15mm為中敏，抑 菌直徑〈10mm為低敏或者無效。
[0076] 表1對實施例1-3中的白術(shù)提取物進行抗菌活性檢測結(jié)果比較
[0077]
[0078] 注:選用ATCC29213作為菌液，菌液的濃度為50mg/mL
[0079] 實驗結(jié)果說明白術(shù)提取物可以用于治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的疾病。
[0080] 實施例5:
[0081] 分別對實施例1-3中得到的白術(shù)提取物稀釋成不同的濃度
[0082] 采用二倍稀釋法測定最低抑菌濃度。抑菌能力的測定以平板菌落計數(shù)法配終濃度 約為0.5 X 107CFU/mL的菌懸液。其中，以白術(shù)提取物為例，最低抑菌濃度測定方法的具體步 驟為將白術(shù)提取物分別稀釋到100、50、25、12.5、6.25、3.125、1，562、0.781、0.390、 0.195mg/mL，在每個牛津杯內(nèi)加入100yL的不同濃度的稀釋液，在37 °C下培養(yǎng)24h，觀察各菌 生長情況。在沒有抑菌圈即菌落被完全抑制的最高稀釋度提取物濃度為MIC。
[0083] 表2白術(shù)提取物的最低抑菌濃度
[0084]
[0085] 注："+"說明出現(xiàn)抑菌圈，說明沒有出現(xiàn)抑菌圈。
[0086]其中實施例1中得到最低抑菌濃度為1.562mg/mL;實施例2中得到最低抑菌濃度為 0.78111^/1111^實施例3中得到最低抑菌濃度為0.78111^/111]^。
[0087] 統(tǒng)計比較白術(shù)提取物、氧氟沙星以及和最低抑菌濃度的白術(shù)提取物混合的氧氟沙 星對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度。
[0088] 表3白術(shù)提取物、氧氟沙星以及和最低抑菌濃度的白術(shù)提取物混合的氧氟沙星的 最低抑菌濃度
[0089]
[0090] 注:A1表不實施例1中的白術(shù)提取物;A2表不實施例2中的白術(shù)提取物;A3表不實施 例3中的白術(shù)提取物;B表示氧氟沙星。
[0091] 結(jié)果表明：白術(shù)提取物具有抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌作用，而且白術(shù)提取物 與氧氟沙星進行混合后，與氧氟沙星有協(xié)同作用，使得氧氟沙星對耐甲氧西林金黃色葡萄 球菌具有增敏作用，可以使得氧氟沙星的最低抑菌濃度降低。另外，通過比較實施例1、2和 3,可以看到最優(yōu)條件下的實施例2提取的白術(shù)提取物較實施例1和實施例3中白術(shù)提取物藥 效更穩(wěn)定更強效，對不同抗藥性的菌種抵抗性更強。
[0092]其中，在實施列4、5中的菌株來源:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(編號為M01-10)臨 床分離株10株，金黃色葡萄球菌標準菌株(ATCC29213)均有合肥艾迪康臨床檢驗所有限公 司提供并確認其耐藥性。
[0093] 實施例6:
[0094] 中耳炎模型中對MRSA的作用
[0095]動物模型構(gòu)建:選取正常健康豚鼠100只，潔凈環(huán)境下，一名實驗人員用雙手固定 豚鼠，使之不能隨意擺動。另一名實驗人員在耳內(nèi)窺鏡幫助下用注射器針頭于豚鼠一側(cè)鼓 膜前下象限穿刺并注入O.lmL菌液，2日后取中耳腔分泌物接種于LB固體培養(yǎng)基上，37°C培 養(yǎng)，24h后觀察結(jié)果，若LB固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)菌斑則造模成功。
[0096]其中，所述正常健康豚鼠，為SPF級，雌雄兼用，體重（200 ± 20)g。模型制備前適應(yīng) 飼養(yǎng)1周，實驗前24h用放大鏡及手電筒檢查豚鼠耳朵有無異常。金黃色葡萄球菌（批號： ATCC29213)實驗前將各菌株接種于LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)24h后，挑選單個菌落接種于 TSB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)18-24h，備用。
[0097]實驗結(jié)果：100只實驗豚鼠中91只豚鼠的中耳分泌物在LB固體培養(yǎng)基中均出現(xiàn)菌 斑，菌落密集，量多，豚鼠耳鼓膜周圍充血明顯，有明顯分泌物，炎性癥狀明顯。在整個試驗 周期內(nèi)，造模成功的豚鼠初期躁動不安，騷耳，耳朵中出現(xiàn)化膿癥狀，精神狀態(tài)輕度萎靡不 振，缺乏活力，進食量和飲水量都較少，隨著藥物治療時間延長，逐漸恢復(fù)正常，精神狀態(tài)有 所好轉(zhuǎn)，耳朵中出現(xiàn)結(jié)痂，進食和飲水量都有所增加。
[0098]動物模型分組給藥:選取24只造模成功的豚鼠分為6組，分別為白術(shù)提取物高劑量 組、白術(shù)提取物中劑量組、白術(shù)提取物低劑量組、氧氟沙星滴耳液組5g/L、萬古霉素組100g/ L和空白模型組，所述空白模型組中給藥物質(zhì)為滅菌生理鹽水，進行滴耳給藥，每日3次，每 次1滴，連續(xù)給藥7天。
[0099]其中白術(shù)提取物采用實施例1的實驗方法進行提取，所述白術(shù)提取物高劑量組、白 術(shù)提取物中劑量組、白術(shù)提取物低劑量組中白術(shù)提取物的劑量分別為MIC的8倍、4倍和2倍。 [0100]動物模型分組給藥:選取24只造模成功的豚鼠分為6組，分別為白術(shù)提取物高劑量 組、白術(shù)提取物中劑量組、白術(shù)提取物低劑量組、氧氟沙星滴耳液組5g/L、萬古霉素組100g/ L和空白模型組，所述空白模型組中給藥物質(zhì)為滅菌生理鹽水，進行滴耳給藥，每日3次，每 次1滴，連續(xù)給藥7天。
[0101 ]所述白術(shù)提取物尚劑量組、白術(shù)提取物中劑量組、白術(shù)提取物低劑量組中白術(shù)提 取物的劑量分別為MIC的8倍、4倍和2倍。
[0102] 菌落計數(shù):每天給藥前用乙醇對豚鼠外耳道進行用棉棒沾取75%乙醇消毒后，用 少量滅菌生理鹽水清洗中耳腔，收集清洗液，稀釋后均勻涂布于瓊脂平板上，37 °C培養(yǎng)24h， 計數(shù)，繪制計數(shù)曲線，如圖1所示。圖1中，橫坐標為用藥天數(shù)，縱坐標為菌落數(shù)量(單位：X 103CFU/mL)〇
[0103] 從繪制的計數(shù)曲線中可以看出，與空白模型模型組相比，其他各模型組給藥1天 后，菌落數(shù)量明顯下降，氧氟沙星和萬古霉素組在1天的給藥后，菌落數(shù)量急速下降，與模型 組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<〇.05)，而各種濃度的白術(shù)提取物組在給藥的第2天，菌落數(shù) 量也與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<〇.05)，說明與氧氟沙星和萬古霉素相比，白術(shù)提 取物雖然起效比較慢，但在動物體內(nèi)實驗中對MRSA有效，同時從圖中可以看出，不同濃度的 白術(shù)提取物對MRSA控制效果也有差異，濃度越高，抑菌作用越強，可以推測白術(shù)提取物對 MRSA抗菌作用為濃度依賴性的。
[0104] 實施例7:
[0105] 中耳炎模型中對MRSA的作用
[0106] 動物模型分組給藥:選取實施例6中造模成功的24只豚鼠分為6組，分別為白術(shù)提 取物高劑量組、白術(shù)提取物中劑量組、白術(shù)提取物低劑量組、氧氟沙星滴耳液組5g/L、萬古 霉素組l〇〇g/L和空白模型組，所述空白模型組中給藥物質(zhì)為滅菌生理鹽水，進行滴耳給藥， 每日3次，每次1滴，連續(xù)給藥7天。
[0107] 其中白術(shù)提取物采用實施例2的實驗方法進行提取，所述白術(shù)提取物高劑量組、白 術(shù)提取物中劑量組、白術(shù)提取物低劑量組中白術(shù)提取物的劑量分別為MIC的8倍、4倍和2倍。
[0108] 菌落計數(shù):每天給藥前用乙醇對豚鼠外耳道進行用棉棒沾取75%乙醇消毒后，用 少量滅菌生理鹽水清洗中耳腔，收集清洗液，稀釋后均勻涂布于瓊脂平板上，37 °C培養(yǎng)24h， 計數(shù)，繪制計數(shù)曲線，如圖2所示。圖2中，橫坐標為用藥天數(shù)，縱坐標為菌落數(shù)量(單位：X 103CFU/mL)
[0109] 實施例8:
[0110] 中耳炎模型中對MRSA的作用
[0111] 動物模型分組給藥:選取實施例6中造模成功的24只豚鼠分為6組，分別為白術(shù)提 取物高劑量組、白術(shù)提取物中劑量組、白術(shù)提取物低劑量組、氧氟沙星滴耳液組5g/L、萬古 霉素組l〇〇g/L和空白模型組，所述空白模型組中給藥物質(zhì)為滅菌生理鹽水，進行滴耳給藥， 每日3次，每次1滴，連續(xù)給藥7天。
[0112] 其中白術(shù)提取物采用實施例3的實驗方法進行提取，所述白術(shù)提取物高劑量組、白 術(shù)提取物中劑量組、白術(shù)提取物低劑量組中白術(shù)提取物的劑量分別為MIC的8倍、4倍和2倍。 [0113]菌落計數(shù):每天給藥前用乙醇對豚鼠外耳道進行用棉棒沾取75%乙醇消毒后，用 少量滅菌生理鹽水清洗中耳腔，收集清洗液，稀釋后均勻涂布于瓊脂平板上，37 °C培養(yǎng)24h， 計數(shù)，繪制計數(shù)曲線，如圖3所示。圖3中，橫坐標為用藥天數(shù)，縱坐標為菌落數(shù)量(單位：X 103CFU/mL)
[0114]顯然本發(fā)明具體實現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技 術(shù)方案進行的各種非實質(zhì)性的改進，或未經(jīng)改進將本發(fā)明的構(gòu)思和技術(shù)方案直接應(yīng)用于其 它場合的，均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種白術(shù)提取物，其特征在于，該提取物的制備方法包括： (1) 取白術(shù)藥材或飲片粉碎過60目篩，20-30°C條件下用雙蒸水沖洗干凈，離心得到固 體，并加入雙蒸水浸泡6-12h，再離心后，得到的固體經(jīng)恒溫箱內(nèi)干燥，溫度控制在40-50°C， 得到白術(shù)粉末； (2) 室溫下，向白術(shù)粉末中加入1-3倍體積的過氧化氫水溶液和0.1-0.5%的焦磷酸鈉 攪拌0.5-lh后，抽濾濾取白術(shù)處理粉末； (3) 將步驟（2)中得到的白術(shù)處理粉末置于通風(fēng)櫥內(nèi)用紫外燈進行照射，連續(xù)照射10 次，每次l_3min，每次照射后對白術(shù)處理粉末進行翻攤； (4) 將步驟(3)中的得到的粉末通過減壓干燥的方法在真空干燥箱中進行烘干，烘干的 溫度為40-50 °C; (5) 在白術(shù)處理粉末中摻入10-20%抗壞血酸，加入1-2倍30-50%乙醇溶液進行超聲微 波提取10_30min，功率為200-300W; (6) 將步驟5中所得到的提取液采用色譜法、回流法進行分離純化，溶劑均為乙醇； (7) 將步驟6中得到白術(shù)提取物采用低溫重結(jié)晶法、減壓濃縮法得到最終的白術(shù)提取 物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種白術(shù)提取物，其特征在于，該提取物的最優(yōu)制備方法： (1) 取白術(shù)藥材或飲片粉碎過60目篩，25°C條件下用雙蒸水沖洗干凈，離心得到固體， 并加入雙蒸水浸8h，再離心后，得到的固體經(jīng)恒溫箱內(nèi)干燥，溫度控制在40°C，得到白術(shù)粉 末； (2) 室溫下，向白術(shù)粉末中加入3倍體積的過氧化氫水溶液和0.2%的焦磷酸鈉攪拌lh 后，抽濾濾取白術(shù)處理粉末； (3) 將步驟（2)中得到的白術(shù)處理粉末置于通風(fēng)櫥內(nèi)用紫外燈進行照射，連續(xù)照射10 次，每次2min，每次照射后對白術(shù)處理粉末進行翻攤； (4) 將步驟(3)中的得到的粉末通過減壓干燥的方法在真空干燥箱中進行烘干，烘干的 溫度為40°C; (5) 在白術(shù)處理粉末中摻入10 %抗壞血酸，加入2倍40 %乙醇溶液進行超聲微波提取 30min，功率為 300W; (6) 12倍40 %乙醇溶液65 °C回流提取6h，抽濾，回收濾液； (7) 將白術(shù)提取液用0.2μπι微濾膜進行微濾澄清，將分離液減壓濃縮，冷凍干燥，得到白 術(shù)提取物。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種白術(shù)提取物，其特征在于，所述白術(shù)提取物可為口服 制劑或者皮膚外用制劑。4. 一種白術(shù)提取物，其特征在于，這種白術(shù)提取物可應(yīng)用于抗耐甲氧西林金黃色葡萄 球菌方面。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種白術(shù)提取物，其特征在于:所述白術(shù)提取物的研究方法包 括體外抑菌實驗和動物實驗。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種白術(shù)提取物，其特征在于:所述體外抑菌實驗包括采用牛 津杯法測定抗菌活性，采用二倍稀釋法測定最低抑菌濃度MIC。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種白術(shù)提取物，其特征在于:所述動物實驗采用豚鼠中耳炎 模型。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種白術(shù)提取物，其特征在于:所述白術(shù)提取物可以單獨用于 抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種白術(shù)提取物，其特征在于，所述白術(shù)提取物可以用于抗耐 甲氧西林金黃色葡萄球菌方面的抗生素的增敏劑。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種白術(shù)提取物，其特征在于，所述抗生素為氧氟沙星。
【文檔編號】A61K36/284GK105832797SQ201610251396
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月20日
【發(fā)明人】胥振國, 蔡玉華, 劉修樹, 范高福, 王鳳華, 方麗波, 袁星, 向敏, 黃鶴春, 宮斌
【申請人】合肥職業(yè)技術(shù)學(xué)院