紫金龍中生物堿及抗炎有效組分的制備篩選方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及紫金龍抗炎有效組分的制備及其應用技術領域，具體涉及一種紫金龍 中的生物堿及抗炎有效組分的制備篩選方法及其在預防和治療炎癥疾病藥物方面的用途。
【背景技術】
[0002] 紫金龍，為毛茛科植物深裂黃草烏Aconitum vilmorinianum Kom var.altifidum W. T. Wang的干燥塊根。是貴州省苗族習用藥材，收載于《貴州省中藥材、民族藥質(zhì)量標準》 2003年版。具有驅(qū)風除濕，溫經(jīng)止痛的功效。用于跌撲損傷、腰膝疼痛、瘡毒等的治療。但 是，有關紫金龍在中醫(yī)臨床、藥理作用、化學成分、藥效物質(zhì)基礎、作用機理等各方面研究的 報道均較少。到目前為止，對紫金龍化學成分的研究報道甚少。僅有張嘉岷等利用硅膠柱色 譜對紫金龍?zhí)崛∥镞M行分離純化，分離得到3個化合物，分別為二帖類生物堿，其中1個位C-19骨架類型，另2個位C-20骨架類型。然而，已有的文獻只是針對紫金龍?zhí)崛∥镞M行分離純 化得到3個二帖類生物堿，缺乏對紫金龍有效組分的制備及其應用的研究，因此，本發(fā)明利 用合理的提取、分離和檢測手段，最終提供一種有效提取、分離富集紫金龍生物堿以及紫金 龍有效組分的制備方法，并將該類組分應用于預防和治療炎癥疾病藥物方面的用途。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供紫金龍生物堿的制備方法以及紫金龍有效組分在制備預防 和治療炎癥疾病相關藥物中的用途。
[0004] 本發(fā)明的技術方案，包括如下幾個方面： 首先，本發(fā)明提出了紫金龍藥材中生物堿的制備方法，其方法分為兩種： 第一種生物堿制備方法的步驟是:取紫金龍藥材分別加入不同倍量的60%乙醇回流提 取3次，合并提取液，減壓回收乙醇、濃縮藥液;將濃縮液加樣于裝有D101大孔吸附樹脂的柱 體中進行柱層析，依次用水、60%乙醇以及95%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，并將60%乙醇組分 及95%乙醇組分合并，分別得到水組分H20 Fr.和合并的乙醇組分EtOH Fr.;進一步將合并 的乙醇組分濃縮后進行生物堿成分的富集。其中，前述的加入不同倍量的60%乙醇回流提取 3次是取紫金龍藥材分別加入10倍、8倍、6倍量60%乙醇回流提取3次，每次2小時。前述的進 行生物堿成分的富集是將合并的乙醇組分濃縮液經(jīng)中性氧化鋁柱層析，然后依次用氯仿、 氯仿-甲醇進行洗脫，收集、合并洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，獲得紫金龍生物堿組分。
[0005] 第二種生物堿制備方法的步驟是:紫金龍藥材中生物堿的制備方法，其特征在于： 取紫金龍藥材分別加入不同倍量的60%乙醇回流提取3次，每次2小時，合并提取液，減壓回 收乙醇回收乙醇得濃稠浸膏；浸膏用適量水溶散，1%稀硫酸調(diào)pH為3,用石油醚萃取3次，將 萃取后水部分用l%NaOH調(diào)pH為9，用氯仿萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮，冷凍干燥，獲得紫 金龍生物堿組分。該方法獲得的生物堿與第一種方法獲得的生物堿相同。
[0006] 通過HPLC獲得化學組分液相色譜信息，以及薄層色譜點板展開，碘化鉍鉀專屬顯 色反應顯示，獲得富含不同極性的生物堿。紫金龍藥材中的生物堿成分有效地富集在了氯 仿及氯仿-甲醇兩個組分，其中氯仿組分主要富含小極性生物堿，氯仿-甲醇組分則主要富 集到的是中高極性的生物堿，因此，本發(fā)明的方法獲得的生物堿組分是氯仿組分CHChFr.、 氯仿-甲醇組分CHCl3-MeOHFr.。
[0007] 本發(fā)明進一步提出了以上兩種方法獲得的紫金龍生物堿組分在制備治療炎癥疾 病的藥物中的應用。該應用是將獲得的紫金龍生物堿組分為活性成分制成的藥用制劑，因 此，本發(fā)明還提出了紫金龍生物堿組分加入藥用添加劑按照藥劑學允許的制備方法制成的 藥用制劑。
[0008] 以上生物堿組分，使紫金龍能夠在制備抗炎藥物中應用，但是，本發(fā)明進行了進一 步的研究，提出了除上述生物堿組分以外，還有其它組分可以在制備抗炎藥物中應用。為了 獲得紫金龍藥材中抗炎有效組分及篩選出最佳組分，本發(fā)明提出了紫金龍藥材中抗炎有效 組分的篩選方法，其步驟是：取紫金龍藥材以60%乙醇提取后經(jīng)D101大孔樹脂柱層析，依次 用水、60%乙醇以及95%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，并將60%乙醇組分及95%乙醇組分合并， 分別得到水組分出0 Fr.和合并的乙醇組分EtOH Fr.;然后將合并的乙醇組分濃縮后進行 生物堿成分的富集，將其合并的濃縮液經(jīng)中性氧化鋁柱層析，然后依次用氯仿、氯仿-甲醇 以及甲醇-水作為洗脫液進行洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥，分別獲得氯仿組分 CHChFr.、氯仿-甲醇組分CHCh-MeOH Fr.和甲醇-水組分Me0H-H20 Fr.。
[0009] 本發(fā)明提出了按照該篩選方法篩選出的紫金龍藥材中抗炎有效組分為乙醇組分 EtOH Fr.、氯仿組分CHCl3Fr.、氯仿-甲醇組分CHCl3-MeOH Fr.或甲醇-水組分Me0H-H20 Fr.。其中，最佳組分為氯仿-甲醇組分CHCl3-MeOH Fr.。
[0010] 基于上述方法篩選出的有效組分，本發(fā)明還提出了紫金龍藥材中抗炎有效組分 CHCl3-Me0H Fr.在制備治療炎癥疾病的藥物中的應用。它是利用紫金龍抗炎有效組分 CHCh-MeOH Fr.為活性成分制成的藥用制劑，因此，本發(fā)明還提出了紫金龍抗炎有效組分 CHCh-MeOH Fr.加入藥用添加劑按照藥劑學允許的制備方法制成的藥用制劑。
[0011] 通過以上幾個方面的創(chuàng)新，本發(fā)明通過對紫金龍藥材中的生物堿的制備和富集， 進一步篩選出紫金龍在治療炎癥疾病中的有效組分，并明確了紫金龍治療炎癥疾病的最佳 有效組分為CHC13-Me0H Fr.，同時提出了上述生物堿和抗炎有效組分在制備治療炎癥疾病 中的應用。本發(fā)明生物堿的制備和篩選方法，僅采用了簡單的大孔樹脂柱層析和中性氧化 柱層析的方法，可大大提高廣泛運用的可操作性，制備出的有效組分在安全濃度范圍內(nèi)治 療炎癥疾病方面的效果好、用量低，為該藥材的深入開發(fā)提供了一定的科學依據(jù)。
[0012]
【附圖說明】：已經(jīng)修改 圖1紫金龍生物堿組分作用RAW 264.7細胞24h后對生長的影響； 圖2紫金龍生物堿組分對RAW 264.7細胞N0釋放量的影響； 圖3紫金龍生物堿組分對RAW 264.7細胞TNF-α釋放量的影響； 圖4是紫金龍藥材組分制備流程圖； 圖5是紫金龍CHC13 Fr.組分作用RAW 264.7細胞2處后對生長的影響； 圖6是紫金龍CHC13 Fr.組分對RAW 264.7細胞N0釋放量的影響； 圖7是紫金龍CHC13 Fr.組分對RAW 264.7細胞了即-€1釋放量的影響； 圖8是有效組分CHCl3-Me0H Fr.對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌N0的影響； 圖9是有效組分CHCl3-Me0H Fr.對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌PGE2的影響； 圖10是有效組分CHCl3-MeOH Fr.對RAW 264.7細胞了即-€[釋放量的影響(11=5); 圖11是有效組分CHCl3-MeOH Fr.對RAW 264.7細胞11^-10釋放量的影響(11=5); 圖12是有效組分CHCl3-MeOH Fr.對RAW 264.7細胞11^-6釋放量的影響(11=5); 圖13是有效組分CHCh-MeOH Fr.對LPS誘導的RAW264.7細胞TNF-α mRNA水平的影響； 圖14是有效組分CHCh-MeOH Fr.對LPS誘導的RAW264.7細胞IL-Ιβ mRNA水平的影響； 圖15是有效組分CHCh-MeOH Fr.對LPS誘導的RAW264.7細胞IL-6 mRNA水平的影響。
【具體實施方式】
[0013] 為了更加清楚的對本發(fā)明進行說明，以下通過具體實施例對本發(fā)明的具體實施方 式進行更為詳細的說明。但是應該理解，以下所述具體實施例僅用于本發(fā)明進行示例性說 明，而非用于本發(fā)明進行任何性質(zhì)限定，其中所用材料、試劑、儀器及操作條件僅為代表性 的，其并不限于所列舉的情況。
[0014] 所屬技術領域的技術人員通過閱讀以下說明可以對本發(fā)明做出不脫離本發(fā)明權 利要求所限定的保護范圍的改動和改進，這些改動和改進也處于本發(fā)明所要求保護的范圍 內(nèi)。
[0015] 實施例1: 生物堿的制備:取紫金龍藥材分別加入1 〇倍、8倍、6倍量60%乙醇回流提取3次，每次1小 時，合并提取液，減壓回收乙醇、濃縮藥液。將濃縮液加樣于裝有D101大孔吸附樹脂的柱體 中進行柱層析，依次用水(H20 Fr.)、60%乙醇以及95%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，并將60% 乙醇組分及95%乙醇組分合并（EtOH Fr.)，分別得到水組分(H20 Fr.)和合并的乙醇組分 (EtOH Fr.)。進一步將合并的乙醇組分濃縮后進行生物堿成分的富集，將其合并的濃縮液 經(jīng)中性氧化鋁柱層析，然后依次用氯仿、氯仿-甲醇1:1以進行洗脫，收集、合并洗脫液，減壓 濃縮，冷凍干燥，獲得紫金龍生物堿組分。
[0016] 通過HPLC獲得化學組分液相色譜信息，以及薄層色譜點板展開，碘化鉍鉀專屬顯 色反應顯示，獲得富含不同極性的生物堿。紫金龍藥材中的生物堿成分有效地富集在了氯 仿及氯仿-甲醇兩個組分，其中氯仿組分主要富含小極性生物堿，氯仿-甲醇組分則主要富 集到的是中高極性的生物堿。
[0017] 實施例2: 生物堿的制備:取紫金龍藥材分別加入12倍、9倍、6倍量60%乙醇回流提取3次，每次1小 時，合并提取液，減壓回收乙醇、濃縮藥液。將濃縮液加樣于裝有D101大孔吸附樹脂的柱體 中進行柱層析，依次用水(H20 Fr.)、60%乙醇以及95%乙醇進行洗脫，收集洗脫液，并將60% 乙醇組分及95%乙醇組分合并（EtOH Fr.)，分別得到水組分(H20 Fr.)和合并的乙醇組分 (EtOH Fr.)。進一步將合并的乙醇組分濃縮后進行生物堿成分的富集，將其合并的濃縮液 經(jīng)中性氧化鋁柱層析，然后依次用氯仿、氯仿-甲醇1:2以進行洗脫，收集、合并洗脫液，減壓 濃縮，冷凍