使用il-28和組合物的疫苗和免疫治療及其使用方法
【專利說明】
[00011 本申請是申請?zhí)?00980112452.6,申請日為2009年4月6日,名為"使用IL-28和組 合物的疫苗和免疫治療及其使用方法"的發(fā)明專利申請的分案申請。母案的全部內容在此 通過引用全文納入本文用于所有目的。
技術領域
[0002] 本發(fā)明涉及改進的疫苗、改進的用于預防性地和/或治療性地賦予個體對免疫原 的免疫力的方法以及改進的免疫治療組合物和改進的免疫療法。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 本申請要求于2008年4月4日提交的美國臨時申請No. 61/042,674的優(yōu)先權,其內 容以引用方式并入本文。
[0005] 免疫治療是指調節(jié)人的免疫應答以賦予有利的治療效果。免疫治療劑是指這樣的 組合物:當給藥于個體時,其通過增加有利的免疫應答來調節(jié)個體的免疫系統(tǒng)至足以最大 程度地減少與不利的免疫應答相關的癥狀或者足以最大程度地減輕癥狀。在一些情況下, 免疫療法是這樣的接種方案的一部分,在該接種方法中,將一種疫苗給藥于個體,該疫苗將 個體暴露于免疫原,對于該免疫原,個體產生免疫應答,在這些情況下,免疫治療增加免疫 應答和/或選擇性地增強免疫應答的一部分(例如,細胞性手臂或者體液性手臂),所述免疫 應答有利于治療或者預防特定的癥狀、感染或者疾病。
[0006] 以引用方式并入本文的美國專利No. 7,135,170披露了人類IL-28A和人類IL-28B 的核酸和氨基酸序列及將IL-28A或者IL-28B蛋白給藥于感染病毒的個體。
[0007] 以引用方式并入本文的美國專利如.7,491,391披露了與幾-23?19結合的抗體。描 述了包含該抗體的組合物和包括將該抗體與其他試劑聯(lián)合給藥的用途,其中包括將抗-IL-23pl9抗體與包括IL-28在內的任一白細胞間介素蛋白聯(lián)合。
[0008] 以引用方式并入本文的美國專利申請公開No. 20050037018披露了將HCV疫苗與抗 病毒劑聯(lián)合以治療感染HCV的個體。用于治療感染HCV的個體的抗病毒化合物列表中包括 IL-28蛋白,該IL-28蛋白與披露的HCV疫苗聯(lián)合使用。
[0009] 以引用方式并入本文的美國專利申請公開No. 20060165668披露了以編碼兩種或 多種治療蛋白的核酸分子轉染的癌細胞和通過將這種癌細胞供給患癌的個體來對其進行 治療。所列的治療蛋白中包括細胞因子,并且細胞因子列表中包括IL-28。
[0010] 以引用方式并入本文的美國專利申請公開No. 20060263368披露了包括癌細胞靶 向部分和抗細胞增殖部分的抗癌化合物及使用這種化合物來治療癌并預防或者逆轉癌細 胞的化學抗性的用途。所列的癌細胞靶向部分中包括激素,并且激素列表中包括IL-28。 [0011]以引用方式并入本文的美國專利申請公開No. 20070066552披露了用于傳遞編碼 治療蛋白的核酸分子的制劑。被描述為治療蛋白的蛋白列表中包括IL-28。
[0012]可以通過傳遞調節(jié)人的免疫應答以誘導改進的免疫應答的試劑來改進疫苗方案。 在一些接種方法(其中將一種疫苗給藥于個體,該疫苗將個體暴露于免疫原,對于該免疫 原,個體產生免疫應答)中,提供增加免疫應答和/或選擇性地增強免疫應答的一部分(例 如,細胞性手臂或者體液性手臂)的試劑,所述免疫應答有利于治療或者預防特定的癥狀、 感染或者疾病。
[0013] 疫苗有用于使個體對諸如變態(tài)反應原、病原體抗原或者與涉及人類疾病的細胞相 關的抗原之類的靶抗原免疫。與涉及人類疾病的細胞相關的抗原包括與癌相關的腫瘤抗原 和與涉及自身免疫性疾病的細胞相關的抗原。
[0014] 在設計這種疫苗時,已經認識到,在已接種疫苗的個體的細胞中生產靶抗原的疫 苗對于誘導免疫系統(tǒng)的細胞性手臂是有效的。具體地說,減毒活疫苗、使用無毒性載體的重 組疫苗和DNA疫苗均造成在已接種疫苗的個體的細胞中生產抗原,這引起了誘導免疫系統(tǒng) 的細胞性手臂。另一方面,僅包含蛋白的已殺死的疫苗或者滅活的疫苗和亞單位疫苗不會 誘導有益的細胞免疫應答,盡管他們確實誘導了有效的體液應答。
[0015] 細胞免疫應答對于提供針對病原體感染的保護及提供對治療病原體感染、癌或者 自身免疫性疾病有效的免疫介導的療法往往是必需的。因此,往往優(yōu)選諸如減毒活疫苗、使 用無毒性載體的重組疫苗和DNA疫苗之類的在已接種疫苗的個體的細胞中生產靶抗原的疫 苗。
[0016] 盡管這種疫苗對于預防性地或者治療性地賦予個體對病原體感染或者人類疾病 的免疫力往往是有效的,但仍需要改進的疫苗。需要產生增強的免疫應答的組合物和方法。
[0017] 同樣,盡管一些免疫療法對于調節(jié)患者的免疫應答是有用的,但仍需要改進的免 疫治療劑組合物和方法。
[0018] 發(fā)明概述
[0019] 本發(fā)明涉及一種組合物,該組合物包含編碼免疫原的分離的核酸分子及編碼IL-28或其功能片段的分離的核酸分子。
[0020] 本發(fā)明還涉及一種組合物,該組合物包含既編碼免疫原又編碼IL-28或其功能片 段的分尚的核酸分子。
[0021] 本發(fā)明涉及一種可注射的藥物組合物,該可注射的藥物組合物包含編碼免疫原的 分尚的核酸分子及編碼IL-28或其功能片段的分尚的核酸分子。
[0022] 本發(fā)明涉及一種可注射的藥物組合物,該可注射的藥物組合物包含既編碼免疫原 又編碼IL-28或其功能片段的分離的核酸分子。
[0023] 本發(fā)明還涉及一種在個體中誘導針對免疫原的免疫應答的方法,該方法包括將這 樣的組合物給藥于所述個體,該組合物包含編碼免疫原的分離的核酸分子及編碼IL-28或 其功能片段的分離的核酸分子。
[0024] 本發(fā)明還涉及一種在個體中誘導針對免疫原的免疫應答的方法,該方法包括將這 樣的核酸分子給藥于個體,該核酸分子編碼免疫原,并且編碼IL-28或其功能片段。
[0025] 本發(fā)明還涉及一種重組疫苗,該重組疫苗包含編碼可操作地連接于調節(jié)元件的免 疫原的核苷酸序列和編碼IL-28或其功能片段的核苷酸序列;并且本發(fā)明還涉及一種在個 體中誘導針對免疫原的免疫應答的方法,該方法包括將這種重組疫苗給藥于個體。
[0026] 本發(fā)明還涉及一種減毒活病原體,其包含編碼IL-28或其功能片段的核苷酸序列; 并且本發(fā)明還涉及一種在個體中誘導針對免疫原的免疫應答的方法,該方法包括將這種減 毒活病原體給藥于個體。
[0027] 附圖簡述
[0028]圖1示出測定小鼠脾細胞的γ干擾素應答試驗的數(shù)據(jù),并將其與采用Gag質粒在存 在有IL-2共處理或不存在IL-2共處理的情況下免疫化的小鼠進行比較。
[0029]圖2示出在存在有IL-2處理或不存在IL-2處理的情況下使用流式細胞計量術對脾 細胞進行分析的數(shù)據(jù)。
[0030] 圖3示出實施例3所描述的試驗的數(shù)據(jù)。采用3yg恒河猴IL-28B(macIL-28B)或者空 載體轉染RD細胞。轉染后48小時,通過ELISA檢測上清液以確定是否存在有獼猴IL-28B(恒 河猴 IL-28B)。
[0031] 圖4示出實施例3所描述的試驗的數(shù)據(jù)。單獨采用編碼HIV Pol的質?;蛘呓M合使 用編碼HIV Pol的質粒與編碼獼猴IL-28B的質粒將恒河猴免疫化2次。通過IFN γ ELI斑點檢 測時,macIL-28B的加入將抗原的特異性免疫應答提高了約3倍。
[0032]圖5A和5B示出免疫日程表和質粒圖。圖5A顯示,在第0天和第14天采用多進化枝的 HIV Gag構建物并使用或不使用佐劑對小鼠進行免疫化處理,然后在每次免疫化處理之后 使用CELLECTRA?適合性恒流設備進行電穿孔。在第21天,殺死小鼠,分離并分析淋巴 細胞。圖5B示出鼠科IL-28B和IL-12構建物的質粒圖。
[0033] 圖6A和6B示出鼠科IL-12和鼠科IL-28B的體外表達和分泌。圖6A示出轉染后48小 時由Western印跡法得到的得自HEK 293T細胞溶解產物的鼠科IL-12p40和鼠科IL-28蛋白 的數(shù)據(jù)。模擬轉染的細胞接受空P VAX載體。圖6B示出由ELISA得到的數(shù)據(jù),其示出活性IL-12p35/p40異源雙體以及IL-28蛋白分泌物至轉染的細胞的上清液中。
[0034] 圖7A和7B示出分離的脾細胞中的HIV Gag特異性的IFNy和IL-4ELI斑點。圖7A示 出細胞因子佐劑對Thl應答的誘導的影響,通過使用抗原特異性的IFN γ ELI斑點對分離的 脾細胞進行測量。對采集自小鼠的脾細胞進行ELI斑點測量,所述小鼠接受IL-12作為佐劑 或者接受IL-28B作為佐劑(η = 4),并且對IFNy成斑單元(SFU)進行計數(shù)。圖7Β示出細胞因 子佐劑對Th2應答的誘導的影響,通過使用IL-4ELI斑點以同樣的方式進行測量。
[0035]圖8A、8B和8C示出已接種疫苗的動物的血清中HIV Gag特異性的IgG。免疫化后一 周通過ELISA檢測來自對比例(pVAX)或者免疫的動物(n = 4)的血清中是否存在HIV Gag特 異性的抗體。(圖8A示出總IgG。圖8B示出IgGl。圖8C示出IgG2a。)
[0036]圖9A和9B示出免疫過程中對調節(jié)性的T細胞和TGFP分泌物的不同誘導。從分離的 脾細胞由所有組(n = 4)通過流式細胞計量術檢測調節(jié)性的T細胞(CD4+/CD25hi/FoxP3+)的 存在(圖9A)。流式細胞計量術的分析示出TReg群體的差異,而對這些細胞的細胞因子分泌 物的分析示出TGFP釋放的差異(圖9B)。p值反映僅采用Gag4Y接種的小鼠與采用Gag4Y和IL-12或者IL-28B接種的小鼠的比較。
[0037]圖10A、IOB和IOC示出⑶8+T細胞數(shù)、粒度和脫粒的變化。通過流式細胞計量術對脾 臟和腸系膜淋巴結中的CD8+T細胞(CD3+/CD8+)的百分率進行估計(圖10A)。采用流式細胞 計量術,通過將未受激的細胞(NP)與使用HIV Gag肽(Peptide)刺激過的細胞進行比較,對 CD8+T細胞中的穿孔素的抗原特異性的誘導進行分析。示出了單一試驗的結果(圖10B),并 圖示了所有試驗的平均值(圖10C)。通過使用肽在存在有對于CD107a的抗體的情況下進行 刺激,然后通過流式細胞計量術分析,測量了抗原特異性的溶細胞脫粒(圖10C)值反映僅 采用Gag4Y接種的小鼠與采用Gag4Y和IL-12或者IL-28B接種的小鼠的比較。
[0038] 圖IlAUlB和IlC示出在致命的流感攻擊中免于死亡的保護。圖IlA示出IL-12和 IL-28B對Thl應答的誘導的影響,通過使用抗原特異性的IFN γ ELI斑點對分離的脾細胞進 行測量。圖IlB示出試驗數(shù)據(jù),在該試驗中,在第O天和第14天采用流感NP構建物并使用或不 使用佐劑對小鼠 (η = 8 )進行免疫化處理,然后在每次免疫化處理之后使用 CELLECTRA?適合性恒流設備進行電穿孔。在第42天,用10LD50的A/PR/8/34(-種 HlNl流感菌株)對小鼠經鼻攻擊。在為期14天的過程中跟蹤與流感感染相關的死亡率(圖 11Β)〇
[0039]優(yōu)選實施方案詳述
[0040]本文所用的術語"IL-28"指白細胞間介素28蛋白,它是一種干擾素 λ,包括干擾素 λ 的不同變種,例如,但不限于,IL-28A、IL-28B和IL-28C。
[0041] 本文所用的術語"功能片段"意指這樣的IL-28片段,當將該片段和免疫原一起傳 遞時,與沒有該片段而傳遞免疫原時所誘導的免疫相比,該片段提供增加的免疫應答。該片 段的長度通常為10個或者多個氨基酸。
[0042] 本文所用的術語"靶蛋白"意指由本發(fā)明的基因構建物編碼的肽和蛋白,該肽和蛋 白在免疫應答中起靶蛋白的作用。術語"靶蛋白"和"免疫原"可交換使用,均指可以引起免 疫應答的蛋白。靶蛋白是免疫原性蛋白,它與病原體的蛋白或不利的細胞類型(例如癌細 胞)的蛋白或涉及免疫應答需要抵御的自身免疫疾病的細胞的蛋白共用至少一個表位。針 對靶蛋白的免疫應答會保護個體抵御和/或治療該個體的與該靶蛋白相關的特定感染或疾 病。在一些實施方案中,靶蛋白為來自HCV的病毒蛋白或其片段。在一些實施方案中,靶蛋白 為來自除HCV以外的病毒蛋白或其片段。
[0043] 本文所用的術語"基因構建物"指DNA或RNA分子,該DNA或RNA分子包含編碼靶蛋白 或免疫調節(jié)蛋白的核苷酸序列。該編碼序列包括可操作地連接于調節(jié)元件的起始和終止信 號,包括能夠指導個體細胞(對該個體細胞施用有所述核酸分子)中的表達的啟動子和聚腺 苷酸化信號。
[0044] 本文所用的術語"可表達形式"指基因構建物,其含有操作性連接于編碼靶蛋白或 免疫調節(jié)蛋白的編碼序列的必需調節(jié)元件,使得當該編碼序列存在于個體的細胞中時會被 表達。
[0045] 本文所用的術語"共用一個表位"指蛋白含有與另一蛋白的一個表位相同或基本 上相似的至少一個表位。
[0046] 本文所用的術語"基本上相似的表位"意指具有這樣的結構的表位,該結構雖然與 某一蛋白的表位不同,但能引起與該蛋白交叉反應的細胞或體液免疫應答。
[0047] 本文所用的術語"胞內病原體"意指病毒或病原生物體,它們的復制周期或生命周 期的至少一部分在宿主細胞中,并能在宿主細胞中產生病原蛋白或導致病原蛋白的產生。
[0048] 本文所用的術語"過度增殖性疾病"意指以細胞過度增殖為特征的那些疾病和病 癥。
[0049] 本文所用的術語"過度增殖相關蛋白"意指與過度增殖性疾病相關的蛋白。
[0050] 本發(fā)明產生于這樣的發(fā)現(xiàn):當作為疫苗的一部分傳遞時,編碼IL-28及其功能片段 及它們的組合的核酸分子調節(jié)免疫應答。因此,編碼IL-28及其功能片段及它們的組合的核 酸分子可被作為免疫治療劑傳遞,其與疫苗組合或者作為疫苗的成分。
[0051 ]編碼這種蛋白的IL-28蛋白和核酸分子披露于美國專利No . 7,135,170和No . 7, 157,559,它們均以引用方式并入本文。此外,美國專利如.6,927,040和如.7,038,032均以 引用方式并入本文。類似干擾素的蛋白Zcyto21 (Kotenko等,Nat · Immunol · 4( I): 69-77, 2003和Sheppard等,Nat · Tmmunol ·4( 1):63-68,2003)也以引用方式并入本文。
[0052] 人類IL-28A的蛋白序列的GENBANK登錄號為NP_742150和AAR24510,它們均以引用 方式并入本文。
[0053] 人類IL-28B的蛋白序列的GENBANK登錄號為NP_742151和AAR24509,它們均以引用 方式并入本文。
[0054] 人類IL-28C的蛋白序列的GENBANK登錄號為AAQ01561,其以引用方式并入本文。 [0055]以引用方式并入本文的GENBANK登錄號Q8IZJ0是指白細胞間介素-28A前體(IL-28A)(干擾素 λ-2) (IFN-X-2)(細胞因子ZCYT020)。
[0056]以引用方式并入本文的GENBANK登錄號Q8IZI9是指白細胞間介素-28B前體(IL-28B) (IL-28C)(干擾素 λ-3) (IFN-X-3)(干擾素 λ-4) (IFN-lambda-4)(細胞因子ZCYT022)。 [0057]以引用方式并入本文的GENBANK登錄號NM_173065是指智人白細胞間介素28受體, α(干擾素,λ受體)(IL28RA),轉錄體變體3,mRNA。
[0058]以引用方式并入本文的GENBANK登錄號NM_172138是指智人白細胞間介素28A(干 擾素,X2)(IL28A),mRNA。
[0059]以引用方式并入本文的GENBANK登錄號NM_172139是指智人白細胞間介素28B(干 擾素,X3)(IL28B),mRNA。
[0060]以引用方式并入本文的GENBANK登錄號AY129153是指智人白細胞間介素28受體A 接合變體3 (IL28RA)mRNA,全cds;或者是剪接的。
[00611以引用方式并入本文的GENBANK登錄號AY129152是指智人白細胞間介素28受體A 接合變體2 (IL28RA)mRNA,全cds;或者是剪接的。
[0062]以引用方式并入本文的GENBANK登錄號AY129152是指智人白細胞間介素28受體A 接合變體2 (IL28RA)mRNA,全cds;或者是剪接的。
[0063]以引用方式并入本文的GENBANK登錄號AY129151是指智人白細胞間介素28受體A (IL28RA)mRNA,全cds;或者是剪接的。
[0064]以引用方式并入本文的GENBANK登錄號AY129149是指智人白細胞間介素28B (IL28B)mRNA,全cds。
[0065]以引用方式并入本文的GENBANK登錄號AY129148是指智人白細胞間介素28A (IL28A)mRNA,全cds。
[0066] 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案,編碼IL-28或其功能片段的核酸序列的傳遞和與編 碼免疫原的核酸序列組合于個體增強了對免疫原的免疫應答。當編碼轉錄因子的核酸分子 被個體的細胞占據(jù)時,編碼IL-28或其功能片段和免疫原的核苷酸序列在細胞中得以被表 達,由此蛋白被傳遞至個體。本發(fā)明的一些方面提供在單一的核酸分子上傳遞蛋白的編碼 序列的方法、在不同核酸分子上的的傳遞蛋白的編碼序列的方法、傳遞蛋白編碼序列作為 重組疫苗的一部分和減毒疫苗的一部分方法。
[0067] 根據(jù)本發(fā)明的一些方面,提供用于預防性地和/或治療性地賦予個體對病原體或 者異常的、疾病相關的細胞的免疫力的組合物和方法。疫苗可以使任何類型的疫苗,例如, 減毒活疫苗、重組疫苗或者核酸或DNA疫苗。通過傳遞編碼免疫原和IL-28或其功能片段的 核酸分子,可以調節(jié)由疫苗誘導的免疫應答。當通過表達的核酸分子(諸如,例如質粒的部 分或者重組載體的基因組的部分或者減毒病原體的基因組的部分或者細胞的基因組的部 分)傳遞時,IL-28是尤其有用