胞。
[0187] 用OVA作過敏原攻擊后，腹膜內(nèi)給予SEQ ID NO 16所示膚顯著降低嗜中性粒細(xì)胞、 淋己細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的CXCR4依賴性滲透入小鼠的氣道。運(yùn)種治療也顯著降低巨隧細(xì) 胞的浸潤。相反，不與CXCR4相互作用的ALB409-423沒有顯著影響。因此，SEQ ID NO 16所示 膚是體內(nèi)有效的CXCR4括抗劑，其在小鼠模型中動員干細(xì)胞并施加抗炎效果。
[018引業(yè)已發(fā)現(xiàn)，SEQ ID NO 16所示膚W劑量依賴性方式抑制銅綠假單胞菌（一種革蘭 氏陰條件致病菌），在>5μΜ的濃度下80%有效。相比較而言，對金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽 性細(xì)菌病原體），或白色念珠菌(其是二倍體真菌和條件性口腔和生殖器感染的致病因子） 僅觀察到中等的作用。因此，SEQ ID 16所示膚不僅抑制X4HIV-1菌株，還發(fā)揮特異性抗細(xì)菌 作用。
[0189] SEQ ID NO 16所示膚與CXCR4的相互作用是高度特異性的，因?yàn)榇罅康钠渌麲PCR 的活性并沒有受到影響，并且該膚與CXCR4的第二細(xì)胞外環(huán)相互作用。SEQ ID NO 16所示膚 結(jié)合CXCR4的確切過程仍有待確定。據(jù)報(bào)道，CX化12最初與CXCR4的N-末端相互作用W誘導(dǎo) 構(gòu)象變化，隨后允許所述配體與GPCR的第二和第Ξ胞外環(huán)相互作用(Brelot等.，2000;Zhou 等.，2001;Huang等.，2003)。
[0190]
[0191] *由于IC5於50μΜ，不是本發(fā)明的膚 實(shí)施例
[0192] 膚
[0193] SEQ ID NO 16所示膚及其各種衍生物可通過常規(guī)的固相合成，采用已知的Fmoc化 學(xué)方法，利用膚合成儀9050(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）合成。該膚通過RP色譜法純化，其身份和純 度通過分析型RP-HPLC和MLDI-MS測定。
[0194] 病毒原液
[01M]通過憐酸巧法(化IPhos?哺乳動物轉(zhuǎn)染試劑盒，克隆技術(shù)公司-Clontech)，用前病 毒DNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞來產(chǎn)生輔助受體嗜性不同的HIV-1、HIV-2和SIV分子克隆。溫育過 夜后，轉(zhuǎn)染混合物替換為補(bǔ)充有10%FCS的DMEM培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)收獲病毒原液。隨后， W3000巧m離屯、培養(yǎng)上清液5分鐘W去除細(xì)胞碎片。通過p24化IV)或p27蛋白（SIV)抗原 ELISA定量測定得到的病毒原液。病毒原液立即使用或在-80°C下W等分試樣儲存。
[0196] TZM-bl感染測定
[0197] 將含有HIV-1啟動子控制下的LacZ報(bào)道基因的TZM-bl報(bào)道細(xì)胞接種在96孔F-底微 量滴定板(GB0公司-Greiner Bio-One)。在接下來的一天，將細(xì)胞與SEQ ID NO 16所示膚或 其衍生物的各種稀釋液預(yù)培育1小時(shí)，隨后用HIV-UHIV-2和SIV作感染。2天后，根據(jù)制造商 的推薦，利用一步化opix Ga^Screen試劑盒測定感染率。
[019引 PBMC感染測定
[0199] 采用Ficoll密度離屯、，從源自DRK-Blutspendedienst (己登-符騰堡州-黑森州-Baden-Wiirttemberg-胎ssen)的血沉棟黃層分離外周血單核細(xì)胞。用llμg/ml植物凝血素 (PHA, Oxoid, #3085280)和 lOng/ml 白介素-2(Ik2，Strathmann ,#9511192)刺激每毫升 IX 106PBMCS天。此后，將細(xì)胞沉淀，并重懸在含比-2的培養(yǎng)基中。將2X105PBMC接種于96孔F-底微量滴定板中，加入膚并用X4或R5嗜性病毒的lO-lOOpg p24抗原感染細(xì)胞。感染后每2-3 天獲取含子代病毒的上清液。通過p24抗原化ISA(NIH AIDS試劑程序)測定病毒產(chǎn)量。從一 式Ξ份感染±標(biāo)準(zhǔn)偏差獲得平均p24抗原值(ng/ml)。
[0200] 細(xì)胞活力
[0201 ]為評估細(xì)胞毒性作用，將TZM-bl細(xì)胞或刺激前PBMC與濃度漸增的膚一起溫育。根 據(jù)制造商的推薦，利用CellTiter-Glo發(fā)光細(xì)胞活力測定(普洛麥格公司-PR0MEGA，G7571) 測定細(xì)胞活力。數(shù)值來自一式Ξ份的測量。相對于含細(xì)胞(100 % )的PBS(無膚）中的ATP水平 計(jì)算活力率。加入試劑后10分鐘，使用光度計(jì)記錄數(shù)據(jù)。
[0202] SEQ ID NO 16所示膚阻斷感染的早期步驟。
[0203] 配體-受體相互作用的實(shí)時(shí)巧光監(jiān)測
[0204] 抗人CXCR4(克隆12G5，IgG2a)或抗人CXCR7(克隆9C4)的單克隆抗體(mAb)購自R&D 系統(tǒng)（明尼阿波利斯，明尼蘇達(dá)州）。使用PE-偶聯(lián)的山羊抗小鼠 F(ab'）2Ab(化ko,格洛斯楚 普，丹麥)來顯示未偶聯(lián)的抗CXCR7和抗CXCR4mAb的結(jié)合，利用FACS化libur流式細(xì)胞儀(BD 生物科學(xué)公司-BD Biosciences) W及Cell Quest軟件進(jìn)行分析。人趨化因子CXCL12和 CX化12-德克薩斯紅如（化lenzuela-Fernandez等，2001)所述合成。人趨化因子CX化11購自 臨床科學(xué)公司-Clinisciences SAS(法國）。
[0205] 利用懸浮在皿PES-牛血清白蛋白緩沖液（lOmM HEPES，137.5mM化Cl，1.25mM MgCl2，1.25mM CaCl2,6mM KCl，10mM葡萄糖，0.4mM 化出P〇4,0，l%牛血清白蛋白（w/v)，pH 7.4)中、穩(wěn)定表達(dá)eGFP的-CXCR4的細(xì)胞(通常是106細(xì)胞/毫升)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2rC，利用巧光分 光光度計(jì)基于時(shí)間記錄在51化m(在470皿激發(fā))發(fā)射的巧光，每0.3秒取樣。在30s，向1ml細(xì) 胞懸液中加入lOOnM CX化12-TR來啟動巧光結(jié)合測量。對于競爭性實(shí)驗(yàn)，表達(dá)EGFP-CXCR4的 細(xì)胞在沒有或有各種濃度的未標(biāo)記藥物存在下預(yù)溫育10分鐘。然后，加入CX化12-TR (100碰），并記錄巧光直至達(dá)到平衡（3003)。利用1(曰161(1曰旨^地3.08軟件（協(xié)同軟件公司-Synergy Software,雷下市，賓夕法尼亞州，美國）分析數(shù)據(jù)。
[0206] EGFP-CXCR4 或 EGFP-CXCR7 的內(nèi)在化
[0207] 將人CXCR7cDNA與EGFP-cDNA克隆融合入經(jīng)修飾的pIRES Hyg3載體（克隆技術(shù)公 司）。憐酸巧-DNA共沉淀法產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)EGFP-CXCR7的肥K 293T細(xì)胞，并在沒有或有l(wèi)OOnM CX化12的存在下評估9C4mAb的結(jié)合。如參考文獻(xiàn)化achet-Haas等.，2008)所述，采用EGFP的 細(xì)胞表面標(biāo)記，利用單克隆小鼠抗-GFP(羅氏分子生物化學(xué)公司-Roche Molecular Biochemicals; 1/100稀釋）作為一抗和R-陽-偶聯(lián)的Aff ini化re F(ab'）2片段山羊抗小鼠 IgG(免疫技術(shù)公司-Immunotech; 1/100)作為二抗記錄受體的內(nèi)在化。通過流式細(xì)胞術(shù)分析 (10,000個(gè)細(xì)胞每份樣品），利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器巧4〔5。曰1化111',抓公司-136(31:〇]1-0;[。1^]13〇]1) 定量測定CXCR4或CXCR7染色。利用CE化Quest (抓公司）軟件計(jì)算CXCR4或CXCR7巧光強(qiáng)度的 平均值。
[020引流式細(xì)胞術(shù)
[0209] 利用商品化的抗-人CXCR4mAb(抓P公司-BD Pahrmingen，克隆：12G5 ;或1D9)和 CCR5mAb(抓P公司，克隆：CD195)，通過流式細(xì)胞術(shù)分析(FACSCalibur;抓公司）評估SEQ ID NO 16所示膚在CXCR4上的結(jié)合位點(diǎn)。4°C，將2xl05Jurkat T細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中與膚溫 育30分鐘。溫育后，利用FACS緩沖液(PBS+1%FCS)，通過離心洗涂細(xì)胞，然后在4°C用陽標(biāo)記 的抗-人CXCR4mAb或CCR5mAb順次染色。洗涂后，在室溫下用FACS緩沖液配制的4 %低聚甲醒 固定細(xì)胞5分鐘，然后用流式細(xì)胞儀分析。利用CE化卵EST(抓公司）處理數(shù)據(jù)。為分析SEQ ID NO 16所示膚的受體偏愛性，如上所述利用細(xì)胞解離溶液(無酶lx;Sigma:巧914)收集血影 細(xì)胞(親本，X4，化)并制備W供FACS分析。
[0210] [35s]gTP[引結(jié)合分析
[0211] 重組桿狀病毒的產(chǎn)生：編碼人CXCR4、大鼠 G蛋白α?2亞基和人G蛋白βι亞基和牛G蛋 白丫 3亞基的桿狀病毒的產(chǎn)生如(Moepps等.，1997)所述。從美國沃爾瑟姆的巧金埃爾默公 司（Perkin-Elmer)獲得[ 35s]GTP[S] XX化12獲自美國羅基希爾的PT公司（PeproTech)。
[0212] 昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)和膜制備：27°C，在59cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在補(bǔ)充了10%胎牛血清和 0.5mg/ml慶大霉素的TNM-FH培養(yǎng)基（西格瑪公司-SigmaJ 1032)中培養(yǎng)Sf9細(xì)胞。為產(chǎn)生充 足受體和異質(zhì)Ξ聚體Gi2，將細(xì)胞培養(yǎng)到約60%的密度，27°C，在含重組桿狀病毒的2ml/皿的 培養(yǎng)基中溫育1小時(shí)。然后在27°C，給細(xì)胞補(bǔ)充9ml/皿的新鮮培養(yǎng)基，并在該培養(yǎng)基中維持 48小時(shí)。為制備粗制膜組分，離屯、沉淀細(xì)胞，重懸在60化1/皿的含20mM Tris-肥1，抑7.5， ImM抓TA，3μΜ GDP，化g/ml大豆膜蛋白酶抑制劑，ΙμΜ胃蛋白酶抑制劑，ΙμΜ亮膚素 ，100μΜ PMSF和化g/ml抑膚酶的冰冷卻裂解緩沖液中。通過迫使懸液經(jīng)過連接于一次性注射器的 0.5mmx23mm針頭將細(xì)胞勻漿。在冰上靜置30分鐘后，W2，450xg離屯、裂解液45秒W除去未破 裂的細(xì)胞和核。4°C，W26,000xg離屯、30分鐘將粗制膜組分與得到的上清液分離。沉淀物用 300μ1裂解緩沖液清洗，重懸在30化1新鮮的裂解緩沖液中，在液氮中快速冷凍并儲存于-80 °C〇
[0213] 如(Moepps等.，1997)所述測定[35S]GTP[引與桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞的膜的結(jié) 合情況。簡言之，在30°C，將膜（lOyg蛋白/樣品）在含有50mM^乙醇胺/HC1，pH 7.4，1. OmM EDTA，5. OmM MgCb，ΙΟμΜ GDP和 1.05nM[35s]GTP[S] (1250Ci/mmol)的混合物（100μΙ)中溫育 60分鐘。經(jīng)0.45μηι孔徑硝酸纖維素膜(先進(jìn)微裝置公司-Advanced Microdevices,安己拉卡 蘭，印度)快速過濾終止溫育。膜經(jīng)洗涂、干燥，通過液體-閃爍計(jì)數(shù)測定保留的放射性。非特 異性結(jié)合定義為100μΜ未標(biāo)記GTP[S]未競爭的結(jié)合。
[0214] SEQ ID NO 16所示膚的GPCR括抗劑篩選
[0215] SEQ ID NO 16所示膚和衍生物對細(xì)胞遷移的作用
[0216] 利用含5皿孔過濾器的6.5mm直徑小室(Transwel 1,24-孔細(xì)胞培養(yǎng),Coster,波：t 頓，馬薩諸塞州）分析細(xì)胞（ATCC)的遷移。將2xl05Jurkat細(xì)胞懸浮在200μ1 Optimizer Τ-細(xì)胞擴(kuò)增SFM中，將細(xì)胞懸液加入上部腔室。然后，將60化1 Τ-細(xì)胞擴(kuò)增SFM中 的lOnM CX化12(R&D系統(tǒng))和/或各種濃度的SEQ ID NO 16所示膚加入下部腔室。37°C，將細(xì) 胞培養(yǎng)室在細(xì)胞培養(yǎng)解育箱中溫育150分鐘。溫育后，取出各室，取10化1上清液，利用血球 計(jì)數(shù)器直接計(jì)數(shù)遷移入下部腔室的細(xì)胞，或采用上述Cel ITiter-Glo發(fā)光細(xì)胞活力測定進(jìn) 行分析。所有數(shù)值表示一式Ξ份實(shí)驗(yàn)中相對于僅CX化12處理細(xì)胞的遷移細(xì)胞平均數(shù)±SD。
[0217] 從烏爾姆大學(xué)醫(yī)院的輸血醫(yī)學(xué)研究所（Institute of Transfusion Medicine, University Hospital叫m)獲得通過單采(apheresis)分離的粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)治療個(gè)體的外周造血干(P服)細(xì)胞。在PBS配制的1 /10稀釋10 % ACD-A緩沖液(輸血醫(yī)學(xué) 研究所提供）中小屯、解凍冷凍細(xì)胞。將1χ1〇5/2(Κ)μ1 PHS細(xì)胞置于transwell平板的上部腔 室。然后，將60化1培養(yǎng)基中的lOnM CX化12和/或各種濃度的SEQ ID NO 16所示膚或其衍生 物加入各孔。3小時(shí)后，采用上述Ceimter-Glo發(fā)光細(xì)胞活力測定進(jìn)行檢測趨化作用。所有 數(shù)值表示一式Ξ份實(shí)驗(yàn)中相對于僅CX化12處理細(xì)胞的遷移細(xì)胞平均數(shù)± SD。
[0218] 癌細(xì)胞侵襲測定
[0219] 根據(jù)制造商的推薦，利用Biocoat Ma化igel侵襲室（抓BioCoat? Ma化igel?侵 襲室)現(xiàn)憶癌細(xì)胞的細(xì)胞侵襲。將5X104DU145細(xì)胞(ATCC)懸浮于含0.1%BSA化化)的300μ1 無血清RPMI(Gibco)中，然后加入上部腔室。將含或不含lOOnM CX化12和各種濃度的SEQ ID NO 16所示膚的70化1無血清培養(yǎng)基加入各下部腔室。37°C，在5 % CO2/95 %空氣的潮濕氣氛 中溫育腔室24小時(shí)。通過擦洗從膜的上表面除去非侵襲細(xì)胞。采用上述Ceimter-Glo駁發(fā) 光細(xì)胞活力測定試劑盒定量測定膜底部的侵襲細(xì)胞。
[0220] 巧化12和巧CR4括抗劑對肌動蛋白細(xì)胞骨架的作用
[0221] 37°C，將與培養(yǎng)基、ALB衍生物或AMD3100(均是54扣M)預(yù)溫育的化rkat細(xì)胞經(jīng) 〔乂化12(10〇4旨/1111)刺激所示時(shí)間，在5%低聚甲醒(〔1?公司-〔曰1'11?〇1:1161111^1,卡爾斯魯厄， 德國）中固定并用〇.1%皂巧(〇?公司）透化處理。用416皿。111〇巧68-偶聯(lián)的鬼筆環(huán)膚(分子 探針公司-Molecular Probes,尤金，俄勒岡州）染色F-肌動蛋白，然后對相對染色強(qiáng)度進(jìn)行 流式細(xì)胞術(shù)分析。
[0222] 小鼠中的祖細(xì)胞動員
[0223] 將C57B1/6J小鼠 （Janvier ,Le Genest街.Isle,法國）飼養(yǎng)在法蘭克福歌德大學(xué)醫(yī) 學(xué)中屯、的常規(guī)人工動物園中，隨意進(jìn)食和飲水。小鼠接受腹膜內(nèi)注射含lOmg/mL SEQ ID NO 16所示膚的2(Κ)化水或普通生理鹽水。在仔細(xì)的皮毛消毒后，在注射后的指定時(shí)間從檢查袋 (check pouch)取血。低滲裂解后，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，將白細(xì)胞在細(xì)胞因子消除的市售可得半 固體培養(yǎng)基中（3434,干細(xì)胞技術(shù)公司-Stem Cell Technologies,溫哥華，不列顛哥倫比亞 ?。┮皇絻煞葑鳒赜Ｔ诘?天，如巧onig等.，2006)所述對C即-C作評分。根據(jù)溫育的血液 體積標(biāo)準(zhǔn)化CFU-C。所有的動物研究均在當(dāng)?shù)豂ACUC的許可下，按照AAALA巧旨南實(shí)施。
[0224] 動員細(xì)胞的移植
[0225]