8000g離屯、15s，棄下層液體；
[0034] 3)加700ul Buffer RWT至RNA提取柱，4°C8000g離屯、15s，棄下層液體；
[00；35] 4)加500ul Buffer RPE至RNeasy Mini column,4°C8000g離屯、15s，棄下層液體；
[0036] 5)重復(fù)步驟4);
[0037] 6)轉(zhuǎn)移RNeasy Mini column至一新2ml收集管，4°C1000g離屯、Imin,棄下層液體；
[0038] 7)轉(zhuǎn)移RNeasy Mini column至一新2ml collection 1:ube，加3〇-50ul Nase-free water，4°C8000g離屯、15s，收集下層液體于新EP管，測(cè)RNA濃度，-80°C保存。
[0039] 4.反轉(zhuǎn)錄 PCR
[0040] 1)微小收集管管中配制下列模板RNA/引物混合液；
[0042] 2)65°C保溫5分鐘后迅速置于冰上I分鐘W上；
[0043] 3)離屯、數(shù)秒，使模板RNA/引物的變性溶液聚集于Micro化be管底部；
[0044] 4)在上述Micro化be管中配制加入下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液；
[0046] 5)混勻各組分，37°C保溫2分鐘后冰上冷卻；
[0047] 6)加入Iul M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，輕輕吹打混勻；
[004引7) 37°C保溫2分鐘，70°C保溫15分鐘，4°C保溫，樣本收于-20°C。
[0049] 5.Real-time PCR
[0050] 配置Real-time PCR反應(yīng)體系如下：
[0052] Rea]_-time PCR反應(yīng)體系如下：
[0054] 實(shí)施例3
[00巧]Western Blot
[0056] 1、細(xì)胞總蛋白的提取
[0057] I)棄培養(yǎng)基，用4°C預(yù)冷的5ml PBS漂洗細(xì)胞兩次，加入5ml PBS后，用細(xì)胞刮下培 養(yǎng)皿中的細(xì)胞，收于15ml離屯、管，1100巧m離屯、6min;棄上清，加入1ml PBS重懸細(xì)胞，收于EP 管，7200巧m離屯、2min;
[0058] 2)棄上清，Wl:5(細(xì)胞：裂解液）體積比加裂解液（lOOul RIPA+lul PMSF+ lulPIC)，冰上 15min，每2-3min混懸一次；
[0059] 3)4°C，14000巧m離屯、15min，收集上清液于新EP管中，-80°C保存。
[0060] 2、化曰壯ord法測(cè)定蛋白濃度
[0061] 1)BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按說(shuō)明依次用雙蒸水稀釋，使終濃度分別為1000iig/ml，75化g/ ml，SOOji邑/ml，250]i邑/ml，125]i邑/ml，62. Su邑/ml，Ou邑/ml;
[0062] 2)根據(jù)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量，按每孔加200ul IX考馬斯亮藍(lán)液，取Iul樣品和標(biāo)準(zhǔn)品 加入96孔板中，室溫解育5min，設(shè)副孔和空白孔；
[0063] 3)測(cè)定595nm波長(zhǎng)的吸光度;根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度；
[0064] 4)根據(jù)蛋白濃度計(jì)算上樣體積，每組蛋白的上樣量為25yg。
[0065] 3、聚丙締酷胺凝膠電泳
[0066] 1)準(zhǔn)備預(yù)成膠；
[0067] 2)變性:每孔25iig蛋白量上樣，用蒸饋水將待測(cè)樣本體積稀釋至20ul，每樣本加入 5ul loading buffe;r(漠酪藍(lán)），95°C加熱IOmin;
[0068] 3)上樣，W80V電壓電泳至漠酪藍(lán)電泳至分離膠，將電壓調(diào)到lOOV，直至漠酪藍(lán)到 達(dá)分離膠底部，終止電泳。
[0069] 4、轉(zhuǎn)膜
[0070] 1)準(zhǔn)備預(yù)成膜；
[0071] 2)將電泳膠轉(zhuǎn)移至預(yù)成膜中，使用BioRad半干轉(zhuǎn)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；
[0072] 3)取出PVDF 膜，TBST 漂洗 5min。
[0073] 5,Western blot濾膜雜交
[0074] 1)將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜用5 %脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1小時(shí)；
[007引 2)TBST漂洗10minX3次；
[0076] 3)將濾膜取出，放入5%脫脂奶粉稀釋的一抗稀釋液中，4°C搖床過(guò)夜；
[0077] 4) TBST 洗膜，IOmin X 3次；
[0078] 5)將濾膜放入5%脫脂奶粉稀釋的HRP標(biāo)記的二抗中，室溫?fù)u床解育1小時(shí)；
[0079] 6) TBST 洗膜，IOmin X 3次。
[0080] 6、顯色
[0081] 將PVDF膜膠面朝上放在保鮮膜上，加入1:1混合的顯影液，使其均勻覆蓋膜，暗室 曝光，掃描。
[0082] (4HGFBP2對(duì)廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化功能影響的體外研究，發(fā)現(xiàn)IGFBP2促進(jìn) 廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化
[0083] 取廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞W2 X IO^cm2的濃度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融 合后，用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液將廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞在體外向成脂方向分化誘導(dǎo)，每2天換1次液， 在光鏡下觀察脂滴形成情況。檢測(cè)0周和誘導(dǎo)3周后油紅0染色（圖2A)，并測(cè)定OD值（圖2B)來(lái) 檢測(cè)其成脂分化能力。分別在0周、1周、2周的不同時(shí)間點(diǎn)收獲細(xì)胞，在mRNA水平檢測(cè)成脂分 化的指標(biāo):PPARg(圖2C)、LPL(圖2D)。結(jié)果表明過(guò)表達(dá)IGFBP2促進(jìn)廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外成 脂分化。
[0084] 油紅0染色：
[0085] 油紅0儲(chǔ)存液:將150mg油紅0溶于50ml異丙醇中，37°C，30min;
[0086] 油紅0工作液：用雙蒸水稀釋儲(chǔ)存液，比例為水:儲(chǔ)存液=4:6，過(guò)濾使溶液呈清澈 枯紅色方可使用；
[0087] 甲醒巧固定液:40%甲醒IOml,CaCl22.Og,雙蒸水90ml;
[008引染色步驟：
[0089] 1)細(xì)胞誘導(dǎo)后，去培養(yǎng)基，用PBS洗2次；
[0090] 2)甲醒-巧室溫固定15min;
[0091] 3) PBS洗2次；
[0092] 4)60% 異丙醇媒染 Imin;
[0093] 5)去異丙醇，油紅0工作液室溫染色30min;
[0094] 6 )60%異丙醇浸洗一次；
[009 引 7)PBS洗2次；
[0096] 8)鏡下觀察，甘油S脂脂滴染成紅色；
[0097] 9)拍片；
[0098] 10)用100%異丙醇沖洗油紅0,作用lOmin。用槍吹打幾次，使油紅0充分溶解于異 丙醇中。將其移到1.5ml EP管中，讀500nm的吸光度值(用作定量分析），用100%異丙醇作為 空白對(duì)照。
[0099] 實(shí)施例4
[0100] Real-time RT-PCR:(步驟如上）
[0101] 1. RT-PCR 引物序列：
[0106] W上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái) 說(shuō)，在不脫離本發(fā)明所述原理的前提下，還可W作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，運(yùn)些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2在促進(jìn)脂肪組織再生中的應(yīng)用。2. 胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的脂肪組織再生中的應(yīng)用。3. 胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2在制備促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的脂肪組織再生的藥物 中的應(yīng)用。4. 胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2在制備治療脂肪組織再生的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及本發(fā)明的目的是提供胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2(IGFBP2)在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的脂肪組織再生中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及IGFBP2在制備促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的脂肪組織再生的藥物中的應(yīng)用，以及IGFBP2過(guò)表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療脂肪組織再生的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2(IGFBP2)具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的作用，進(jìn)而利用IGFBP2增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞再生脂肪組織的能力，并可預(yù)計(jì)能夠應(yīng)用于治療修復(fù)先天及后天性脂肪組織缺損。
【IPC分類】A61P3/00, A61K38/18
【公開(kāi)號(hào)】CN105521484
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510932455
【發(fā)明人】賈智, 王月君, 劉大勇, 王松靈, 范志朋, 王穎鋮謠, 魏媛媛
【申請(qǐng)人】天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院
【公開(kāi)日】2016年4月27日
【申請(qǐng)日】2015年12月14日