胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2在促進(jìn)脂肪組織再生中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及膜島素樣生長因子結(jié)合蛋白2在促進(jìn)脂肪 組織再生中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪組織可分為白色和棟色脂肪組織，棟色脂肪組織分布有限，主要功能是產(chǎn)生 熱量，白色脂肪組織廣泛分布于全身皮下組織及腹腔內(nèi)，除用于膽存能量外，尚具有廣泛而 復(fù)雜的內(nèi)分泌功能。脂肪組織可分泌眾多激素和脂肪細(xì)胞因子如瘦素、IGFUIGFBP3和抵抗 素等，運(yùn)些細(xì)胞因子形成復(fù)雜的信號通路網(wǎng)絡(luò)，作用于腦、肝臟、骨骼肌等全身器官組織，調(diào) 節(jié)機(jī)體的脂肪形成及代謝平衡、免疫功能等。先天及后天脂肪組織缺失，如獲得性部分脂肪 營養(yǎng)不良、外傷等，臨床表現(xiàn)為脂肪組織的喪失，嚴(yán)重影響患者的美觀和身屯、健康。目前治 療方法有限主要包括歴復(fù)體、整形美容手術(shù)等方法，但運(yùn)些傳統(tǒng)治療方法尚不能使喪失的 脂肪組織獲得理想的再生。隨著干細(xì)胞、組織工程技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用為脂肪組織的生物性 再生提供了更為有效的手段。組織工程技術(shù)是利用可降解生物材料、各種類型的種子細(xì)胞 及細(xì)胞因子相互復(fù)合，移植后可在宿主體內(nèi)重建具有正常結(jié)構(gòu)及功能的組織器官。
[0003] 干細(xì)胞發(fā)展及應(yīng)用為組織生物性再生提供了更為有效的手段。研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干 細(xì)胞具有自我更新、多向分化等能力，可W分化為組織修復(fù)所需的各種組織如脂肪組織、骨 組織等，與生物材料復(fù)合應(yīng)用具有良好的修復(fù)自身缺損和改建周圍組織的功能。近年來越 來越多的研究報道表明，間充質(zhì)干細(xì)胞除免疫原性低、具備再生和修復(fù)功能外，還有較強(qiáng)的 免疫抑制及調(diào)節(jié)作用，并已安全和成功地用于臨床，或結(jié)合組織工程技術(shù)進(jìn)行組織再生，或 直接應(yīng)用間充質(zhì)干細(xì)胞對自身免疫疾病進(jìn)行細(xì)胞治療，是脂肪組織再生理想的治療手段和 良好的種子細(xì)胞。
[0004] 研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)作為經(jīng)典的用于組織再生的間充質(zhì)干細(xì)胞，其應(yīng)用最為廣泛。然而研究發(fā)現(xiàn)成人 BMSCs細(xì)胞數(shù)量及分離效率隨供者年齡的增大而下降，同時自體間充質(zhì)干細(xì)胞采集須行骨 髓穿刺術(shù)，其細(xì)胞來源較有限。自體脂肪干細(xì)胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)來源廣泛，然而需二次手術(shù)增加了患者的額外痛苦。廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞 (Wharton's jelly of umbilical cord stem cells,WJCMSCs)是存在于新生兒廝帶組織 中的一種多功能干細(xì)胞，具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一致的自我更新、克隆形成、多向分化和 免疫調(diào)節(jié)能力，具有來源廣泛、取材方便、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，不存在倫理學(xué)限制W及免疫原 性低等優(yōu)點(diǎn)，正逐漸成為間充質(zhì)干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。目前已廣泛應(yīng)用于自身免疫病治 療，其安全性使得在科學(xué)研究和臨床應(yīng)用的前景更為廣闊。
[000引膜島素樣生長因子系統(tǒng)由膜島素、受體及膜島素樣生長因子結(jié)合蛋白組成，膜島 素樣生長因子結(jié)合蛋白作為膜島素樣生長因子軸的重要組成，共有6條單鏈多膚，在組織和 細(xì)胞中廣泛表達(dá)，參與機(jī)體諸多病生理過程。IGFBP2(膜島素樣生長因子結(jié)合蛋白2， Insulin-like growth factor binding protein 2)是膜島素樣生長因子系統(tǒng)的重要組 成，大量存在于外周循環(huán)和骨髓腔中，與IGF有較高的親和力。在新生兒快速生長期和骨堆 積高峰期，IGFBP2表達(dá)水平升高。研究表明IGFBP2基因敲除的小鼠有明顯的骨組織形成缺 陷，然而IGFBP2在間充質(zhì)干細(xì)胞成脂方面的作用少有研究。
[0006] 膜島素樣生長因子結(jié)合蛋白2(IGFBP2)是由處于分化期的白色脂肪前體細(xì)胞分 泌，運(yùn)提示IGFBP2可能與脂肪組織形成及分化密切相關(guān)。有研究顯示，過表達(dá)IGFBP2的轉(zhuǎn)基 因大鼠，其體脂肪百分比顯著增多。LLeng等研究表明IGFBP2基因是影響雞脂肪形狀的主 要因素之一。但I(xiàn)GFBP2對間充質(zhì)干細(xì)胞成脂肪分化的作用及機(jī)制不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供膜島素樣生長因子結(jié)合蛋白2(IGFBP2)在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞 介導(dǎo)的脂肪組織再生中的應(yīng)用。本發(fā)明還設(shè)及IGFBP2在制備促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的脂肪 組織再生的藥物中的應(yīng)用，W及IGFBP2過表達(dá)的間充質(zhì)干細(xì)胞在制備治療脂肪組織再生的 藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案是：
[0009] -種膜島素樣生長因子結(jié)合蛋白2在促進(jìn)脂肪組織再生中的應(yīng)用。
[0010] 膜島素樣生長因子結(jié)合蛋白2在促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的脂肪組織再生中的應(yīng) 用。
[0011] 膜島素樣生長因子結(jié)合蛋白2在制備促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的脂肪組織再生的藥 物中的應(yīng)用。
[0012] 膜島素樣生長因子結(jié)合蛋白2在制備治療脂肪組織再生的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是：
[0014] 本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)膜島素樣生長因子結(jié)合蛋白2(IGFBP2)具有促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì) 胞成脂分化的作用，進(jìn)而利用IGFBP2增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞再生脂肪組織的能力，并可預(yù)計能 夠應(yīng)用于治療修復(fù)先天及后天性脂肪組織缺損。
【附圖說明】
[0015] 圖1為建立IGFBP2過表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。圖IA為mRNA檢測外源性IGFBP2的表達(dá) 水平結(jié)果，圖IB為蛋白水平檢測外源性IGFBP2的表達(dá)結(jié)果；
[0016] 圖2為IGFBP5過表達(dá)促進(jìn)廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外成脂分化。圖2A為油紅0染色圖， 圖2A-1至圖2A-4為檢測0周和誘導(dǎo)3周后油紅0染色，圖2B為脂滴定量檢測檢測圖，測定OD值 來檢測其成脂分化能力，圖2C為在0周、1周、2周的不同時間點(diǎn)收獲細(xì)胞，在mRNA水平檢測成 脂分化的指標(biāo):PPARg，圖2D為在0周、1周、2周的不同時間點(diǎn)收獲細(xì)胞，在mRNA水平檢測成脂 分化的指標(biāo):LPL。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，但是此說明不會構(gòu)成對本發(fā)明的限制 法。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí) 施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書 所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對運(yùn)些實(shí)施方案 中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[001引實(shí)施例1
[0019] (1巧細(xì)胞的獲取、培養(yǎng)
[0020] 購買廝帶間充質(zhì)干細(xì)胞，將細(xì)胞接種于25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在a-MEM培養(yǎng)基（含 15 %胎牛血清、2mmol/L谷氨酷胺、lOOU/ml青霉素和lOOiig/ml鏈霉素）中37°C、5 % C02培養(yǎng)， 每2~3天換液1次。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。當(dāng)細(xì)胞生長至80%匯合狀態(tài) 時，用0.25 %膜蛋白酶按1:2消化傳代。
[0021 ] (2)構(gòu)建質(zhì)粒病毒。
[0022] 通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢IGFBP2的基因序列，設(shè)計IGFBP2基因全長的PCR引物，用PCR 的方法得到IGFBP2的全長并加表面標(biāo)記Flag化g，將其連接到逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達(dá)載體上， 測序鑒定，最終構(gòu)建成Flag-IGFBP2的質(zhì)粒。然后進(jìn)行病毒包裝、收集，病毒滴度鑒定，分裝 后保存在-80度冰箱。
[0023] (3)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立
[0024] 對照質(zhì)粒及Flag-IGFBP2的病毒轉(zhuǎn)染廝帶干細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時后，用G418篩選10天 得到IGFBP2過表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染廝帶干細(xì)胞，在mRNA(圖1A)和蛋白水平（圖1B)檢測Flag的表 達(dá)鑒定外源性IGFBP2的表達(dá)。結(jié)果表明IGFBP2過表達(dá)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的建立。
[002引實(shí)施例2
[0026] Real-time RT-PCR:
[0027] 1.引物設(shè)計，Primer 3及oligo 6等生物軟件。
[0028] 2. RT-PCR 引物序列：
[0029] IGFBP2-F：CGTTCAAGTGCAAGATGTCTCTGAACG
[0030] IGFBP2-R：GGATCAGCTTCCCGGTGTTG [003。3. RNA 提取
[0032] 1)培養(yǎng)皿細(xì)胞棄上清，PBS沖洗2遍，加700ul QIAZOL，吹打混勻，收于EP管，室溫解 育5min，加140ul氯仿，強(qiáng)力震蕩混勻15s，室溫解育3min，4°C12000g離屯、15min，收上清于新 EP管；
[0033] 2)取700ul樣本至RNeasyRNA提取柱，4°C