ml/g生藥· min,萃取時間700min， 得超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片 重0.35邑。
[0024] 經(jīng)檢測，成品中搬皮素和山奈素的含量為308yg /片。
[0025] 實施例4:山蠟梅葉片抑制嗜銘細胞瘤細胞PC-12細胞增殖的實驗研究資料 1.實驗材料 1.1實驗用細胞株 大鼠嗜銘細胞瘤細胞PC-12細胞，山東大學(xué)實驗室細胞庫，DMEM+10%FBS常規(guī)培養(yǎng)。
[0026] 1.2實驗藥物 研究藥物:本發(fā)明山蠟梅葉片:按實施例1方法制備。
[0027] 藥液儲液：稱取lOOmg山蠟梅葉片，溶于5ml無水乙醇中，0.濾器過濾，500μ Idof f管分裝，-20°C存儲，同時0.化m濾器過濾無水乙醇W備對照組之用。
[0028] 1.3實驗試劑 DMEM( GIBC0公司Cat.No. 12100-061 Lot.No.758137);胎牛血清(浙江天杭生物科技 有限公司Lot. No. 100419); NaHC〇3(上海久億化學(xué)試劑有限公司Cat. No. 11810-033 Lot.No. 1088387) shypsinUMRESCO公司）；抓TAUMRESCO公司）；Penicillin G Sodium SalUAMRESCO公司1);S化eptomycin Sulfate(AMRESCO);無水乙醇（溜博亞杜蘭經(jīng)貿(mào)有限 公司）;MTT (Biosha巧批號：0793) :PBS(實驗室自配）； 1.4實驗器材 萊卡倒置顯微鏡（德國Leica型號:DMIL);可見-紫外光微孔板檢測儀(美國MD公司型 號：S陽CTRAMAX 190) ; C化培養(yǎng)箱(FORMA型號：3111);超凈臺（蘇凈集團安泰公司制造型號： SW-CJ-ZFD);純水儀(美國Spring公司型號：S/N 020579);精密移液器(法國吉爾森公司型 號:P2);電子天平(德國賽多利斯有限公司型號:BT323S);全自動高壓滅菌鍋（日本SANYO公 司型號:MLS-3020);臺式電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海精密實驗設(shè)備公司型號：DHG9123A);冰箱 (西口子公司型號:KG18V21TI);液氮罐(CBS型號：2001);低速離屯、機(上海安亭科學(xué)儀器廠 型號:KA-1000) ;0. 濾器(MILLIP0RE型號：SLGP033RB) ; 1cm培養(yǎng)皿(肥ST公司）、96孔培養(yǎng) 板(肥ST公司）;細胞計數(shù)板;離屯、管、移液管、Tips若干。
[0029] 2.實驗方法 DPC-12細胞用DMEM+10%FBS于37°C、5%C02進行常規(guī)培養(yǎng)（10cm培養(yǎng)皿），當細胞生長至 對數(shù)期時，收集細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS輕洗3遍，加入3ml 0.25%膜蛋白酶-0.04%EDTA，37°C 消化2min后，向其中加入5ml完全培養(yǎng)基中和反應(yīng)，吹打細胞后將其轉(zhuǎn)入離屯、管中，10(K)rpm 離屯、5min，調(diào)整細胞懸液濃度3 X 104個/ml。
[0030] 2)將細胞種入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入細胞懸液18化1，培養(yǎng)板放入細胞培養(yǎng)箱中 (37°C，5%C02)常規(guī)培養(yǎng)。
[0031 ] 3)根據(jù)細胞生長情況，一般長至50%-70%，加入山蠟梅葉片溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。
[0032] 4)2地后加入2化1 MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)地。
[0033] 5)4h后扣板法倒去上清，用吸水紙輕輕拍干，每孔加入20化1二甲基亞諷，置搖床 上低速振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。
[0034] 6)同時設(shè)置本底(不加細胞，只加培養(yǎng)液），對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介 質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞諷），每組設(shè)定6個復(fù)孔。
[0035] 7)結(jié)果W藥物對細胞的抑制率表示:細胞增值抑制率(％)=(對照孔0D值-給藥孔0D 值）、對照孔0D值X 100%。實驗重復(fù)3次。
[0036] 3.統(tǒng)計處理 采用Microsoft Excel 2007軟件中的相關(guān)分析和Student t檢驗，數(shù)據(jù)Wmean±S.D. 表不。
[0037] 4.實驗結(jié)果 MTT法實驗后統(tǒng)計結(jié)果顯示，與對照組比較，當劑量達到5mg/ml時，對PC-12細胞增殖抑 制有差異(P<〇.〇5)，劑量在lOmg/ml時該差異具有顯著性(P<0.01)，當劑量達到15-20mg/ml 時有極顯著性差異(P<〇. 001)。
[003引表1山蠟梅葉片對PC-12細胞增殖抑制影響研究（X±SD)
注：與對照組比較，沖<0.01; *沖<0.001。
[0039] 5.實驗結(jié)論 本發(fā)明的山蠟梅葉片可W抑制PC-12細胞增殖，減少PC-12細胞的細胞生長數(shù)目，該作 用呈劑量依賴性。
【主權(quán)項】
1. 山蠟梅葉片在制備抑制嗜鉻細胞瘤細胞PC-12細胞增殖藥物中的應(yīng)用，所述山蠟梅 葉片由山錯梅葉1500g作為原料藥制成，其特征在于，所述山錯梅葉片的制備方法由下列步 驟組成:取山蠟梅葉，加入到C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的 體積百分比為4-6%，萃取壓力15-30MPa，溫度30-50°C，C02流量l-3ml/g生藥·min，萃取時 間700-800min，得超臨界萃取物，將超臨界萃取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制 成500片，每片重0.35g。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的山蠟梅葉片在制備抑制嗜鉻細胞瘤細胞PC-12細胞增殖藥物 中的應(yīng)用，其特征在于，所述山蠟梅葉片的制備方法由下列步驟組成:取山蠟梅葉，加入到 C02超臨界萃取器中，乙醇作為夾帶劑，夾帶劑占總萃取溶劑的體積百分比為5%，萃取壓力 25MPa，溫度40°C，C02流量2ml/g生藥·min，萃取時間750min，得超臨界萃取物，將超臨界萃 取物加入淀粉，70%乙醇制顆粒，干燥，壓片，制成500片，每片重0.35g。
【專利摘要】本發(fā)明屬于中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種山蠟梅葉片在制備抑制嗜鉻細胞瘤細胞PC-12細胞增殖藥物中的應(yīng)用及山蠟梅葉片的制備方法。所述山蠟梅葉片由山蠟梅葉1500g作為原料藥制成，采用超臨界萃取制備而成，使得槲皮素和山柰素含量有很大提高。
【IPC分類】A61K9/20, A61P35/00, A61K36/185
【公開號】CN105456313
【申請?zhí)枴緾N201510984157
【發(fā)明人】李晶, 楊志華
【申請人】濟南新時代醫(yī)藥科技有限公司
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年12月24日