藤石松提取物在制備抗菌消炎天然藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及藤石松功能研究領(lǐng)域，具體設(shè)及藤石松活性成分對金黃色葡萄球菌、 大腸桿菌和產(chǎn)氣大腸桿菌的抑制作用，同時設(shè)及藤石松活性成分在抗菌消炎天然藥物中的 作用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物是生物活性化合物的巨大天然寶庫，據(jù)統(tǒng)計，地球上的植物至少有50萬種，其 中許多植物具有抑菌或殺菌作用。我國植物資源豐富，植物的次生代謝產(chǎn)物已超過40萬種， 并且還具有對環(huán)境兼容性好等特點，從中發(fā)現(xiàn)活性強的植物源殺菌劑是當今藥物研究的一 個重要課題，也是現(xiàn)代抗菌藥物的發(fā)展方向之一。植物次生代謝產(chǎn)物是植物在長期協(xié)同進 化過程中，通過次生代謝途徑產(chǎn)生的能抵御病蟲害侵入、抑制其他物種生長，從而在競爭生 長過程中處于相對有利地位的化學物質(zhì)，而其成分天然，經(jīng)過長期的衍化，可W進入天然能 量代謝系統(tǒng)，毒性低，對環(huán)境污染小。
[0003] 近年來抗生素和化學合成藥物廣泛應(yīng)用于人類疾病、養(yǎng)殖和種植等多方面的防 治，效果非常顯著，但長期大量使用會使細菌產(chǎn)生耐藥性，而且其本身具有毒副作用，對人 類生存和環(huán)境造成威脅。中草藥是我國特有的中醫(yī)藥理論與實踐的產(chǎn)物，因具有藥用、保 健、營養(yǎng)無副作用等功效，并具有低毒、低殘留、耐藥性發(fā)生率低和資源豐富等多種因素，而 愈來愈受國內(nèi)外研究者的重視。
[0004]目前國內(nèi)外對植物抑菌的研究研究非常活躍。藤石松化ycopodium japonicum Thunb)，多年生攀援草本，長可達4m。主莖下部有葉疏生，葉鉆狀披針形，先端長漸尖，膜質(zhì)， 灰白色，向上的葉較小，綠色，厚革質(zhì)，有早落的膜質(zhì)尖尾。藤石松為石松科植物石松的干燥 全草。性味微甜、辛、溫、無毒，歸肝、脾、腎經(jīng)，有桂風除濕、舒筋活絡(luò)等多種功效，主要用于 治療關(guān)節(jié)酸痛、屈伸不利等癥。其臨床應(yīng)用歷史悠久，療效確切，全國大部分地區(qū)都盛產(chǎn)，資 源豐富。作為一味重要的中藥，人們越來越關(guān)注藤石松的各方面性能，對其進行了大量研 究，但關(guān)于藤石松提取物的抗菌特異效果，尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過藤石松提取物對細菌抑制作用的 研究，而提供一種藤石松提取物的應(yīng)用。
[0006] 為達上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種藤石松提取物在抑制細菌中的 應(yīng)用，其中，所述藤石松提取物為藤石松的水提取液;所述細菌為制金黃色葡萄球菌、大腸 桿菌或產(chǎn)氣大腸桿菌。
[0007] 本發(fā)明同時提供一種藤石松提取物在制備抗菌消炎天然藥物中的應(yīng)用，其中，所 述藤石松提取物為藤石松的水提取液，所述菌是指金黃色葡萄球菌、大腸桿菌或產(chǎn)氣大腸 桿困。
[000引上述提及的藤石松的水提取液是取干燥的藤石松粉碎，按Ig藤石松干粉加20- 35ml超純水的比例，于藤石松粉中加入超純水，浸泡2-4h后，先于100°C加熱30min，再于60-90°C加熱1-化，離屯、過濾，得上清液，殘渣再按Ig殘渣加25ml超純水的比例加入超純水，于 l00°C加熱30-60min，離屯、過濾，合并濾液，提取液再加熱濃縮至濃度為0.25-0.75g/ml。
[0009] 上述藤石松的水提取液使用前先于120°c滅菌30min或采用22微米微孔無菌過濾 器除菌。
[0010] 本發(fā)明采用管碟法測定藤石松提取液的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)藤石松水提取液具有較高 的抑菌效果，尤其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及產(chǎn)氣大腸桿菌抑菌效果明顯，說明藤石松 中含有對細菌具有抑制作用的物質(zhì)，是篩選、開發(fā)植物源殺菌劑的前提和基礎(chǔ)，為制備抗菌 消炎天然藥物提供了依據(jù)。
【具體實施方式】
[00川 1.實驗器材
[0012] 供試菌種：大腸桿菌化scherichia coli)，金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus Rosenbach)，產(chǎn)氣大腸桿菌(coli-aerogenes group),為武漢國家菌種中屯、購買。
[0013] 供試植物：藤石松（Lycopodi皿 japoni州m Thunb)。
[0014] 實驗儀器:數(shù)顯恒溫水浴器化H-4)國華電器;氣浴恒溫搖床(??Ζ-820)國旺儀器； 冰箱(容聲BCD-18抓ΚΑ);超凈工作臺（SW-CJ-1FD)蘇凈安泰;生化培養(yǎng)箱(SPX-250B-Z)上海 博訊實業(yè)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器化S-50町)江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；超純水器 (UPWS-I-10T)杭州永潔達凈化有限公司；水浴式電磁爐(GCA16)珠海格力小家電有限公司 等。
[001引 LB液體培養(yǎng)基：蛋白腺lOg、酵母粉5g、NaCl 10g、pH值7.0、加無菌水至1000ml。
[0016] LB固體培養(yǎng)基:蛋白腺lOg、酵母粉5g、化Cl lOg、瓊脂15-20g、pH值7.0、加無菌水 至1000ml。
[0017] 2.實驗方法
[001引 2.1制備中藥提取物
[0019] 藤石松水提液的制備:稱取藤石松干品20g，絞碎后置電磁爐(GCA16)中，加超純水 500ml，浸泡4h后，先于100°C加熱30min，再于70°C加熱1小時，離屯、過濾，得上清液，殘渣再 加500ml水于100°C加熱30min，離屯、過濾，合并濾液，加熱濃縮至濃度為0.5g/ml。水提液置 立式壓力蒸汽滅菌器化S-50町）中高溫高壓（120°C，30min)滅菌后放入超凈工作臺備用。
[0020] 藤石松醇提液的制備:稱取藤石松干品5g，絞碎后置帶塞廣口瓶中，加入75%乙醇 100ml浸泡4她，經(jīng)過濾離屯、，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5ml(濃度為Ig/ml)，醇提液經(jīng)微孔濾 膜(0.22皿)除菌后放入超凈工作臺備用。
[0021] 2.2菌懸液的制備
[0022] 用平板畫線法將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣大腸桿菌分別接種于LB固體培 養(yǎng)基上，用封口膜封好，37°C置生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2地活化細菌，活化后，用接種環(huán)挑取同一 菌落的細菌，接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管內(nèi)，然后置于氣浴恒溫搖床中37°C培養(yǎng)4她， 得Ξ種菌的菌懸液，W用作實驗菌種。
[0023] 3.抑菌試驗
[0024] 3.1提取物抑菌效果的測定
[0025] 采用管碟法。將實驗菌種搖勻，用移液槍移取50ul菌懸液于制好的瓊脂平板上，平 鋪涂勻，3種實驗菌，每種涂10個平板;然后將已滅菌的牛津杯等間距置于瓊脂表面上，每皿 4個，全部排好之后，在超凈臺上靜放10分鐘。用1ml滅菌移液槍吸取藤石松水提取液200ul， 注入擺好的牛津杯中，每皿中3個牛津杯注入水提取液，另一牛津杯注入滅菌的超純水 200ul作對照，然后用封口膜小屯、的封好。一種細菌做一個平板，共得3個水提藥平板。同樣， 醇提液也是如此（W75%乙醇100ml濃縮至5ml為對照液）。之后置于37°C生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 2地，觀察培養(yǎng)皿內(nèi)的細菌生長情況，并用千分尺測量抑菌圈的直徑，每一培養(yǎng)皿中Ξ個藥 物的抑菌圈效果取平均值，并且數(shù)據(jù)精確到小數(shù)點后一位，結(jié)果見下表1。
[0026] 表1藤石松提取液的抑菌效果(單位:mm)
[0027]
[0028] ~由表1中結(jié)果可知，藤石松水提取液的抑菌效果很好，對Ξ種細菌的抑菌作用都很~ 明顯，且效果幾乎相同；而藤石松醇提液對金黃色葡萄球菌略有抑制效果，對大腸桿菌和產(chǎn) 氣大腸肝菌無抑制效果或抑制效果不明顯。
[0029] 3.2不同濃度提取液對抑菌作用影響的測定
[0030] 采用管碟法。W前面2.1節(jié)中制備的提取液作為100%原液，無菌水2倍法稀釋，得 1:2、1:4、和1:8濃度提取液系列。由于兩種方法的提取液對細菌的抑制效果各有不同，分別 選取了兩種抑制效果比較明顯的提取液做稀釋實驗。每一系列都分別接菌并作對照，擺好 牛津杯并注入等體積藥物，置37°C恒培養(yǎng)2地，再測定抑菌圈的大小并記錄，與對照比較抑 菌效果，有效果記為V'，沒有效果記為結(jié)果見下表2。
[0031] 表2藤石松提取液稀釋后的抑菌效果(單位:mm)
[0032]
[0033] ~由上表可知，藤石松提取液要想發(fā)揮抑菌效果，需要控制一定濃度，濃度太低會導 致其抑菌作用無法發(fā)揮而使得誤認為沒有抑菌效果。同時也可W看出，同一種提取液對幾 種細菌的抑制作用大致相同，可見是提取液中含有的某種或多種物質(zhì)對細菌的生長、繁殖 或其本身組織的一個共同特征作用所發(fā)揮的抑菌效果。
【主權(quán)項】
1. 一種藤石松提取物在抑制細菌中的應(yīng)用，其中，所述藤石松提取物為藤石松的水提 取液，該細菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌或產(chǎn)氣大腸桿菌。2. -種藤石松提取物在制備抗菌消炎天然藥物中的應(yīng)用，其中，所述藤石松提取物為 藤石松的水提取液，所述菌是指金黃色葡萄球菌、大腸桿菌或產(chǎn)氣大腸桿菌。3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中，所述藤石松的水提取液是取干燥的藤石松粉碎， 按lg藤石松干粉加20_35ml超純水的比例，于藤石松粉中加入超純水，浸泡2-4h后，先于100 °C加熱30min，再于60-90°C加熱l_2h，離心過濾，得上清液，殘渣再按lg殘渣加25ml超純水 的比例加入超純水，于l〇〇°C加熱30-60min，離心過濾，合并濾液，提取液再加熱濃縮至濃度 為0.25-0.75g/ml。4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中，所述藤石松的水提取液使用前先于120°C滅菌 30min〇5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中，所述藤石松的水提取液使用前先采用22微米微孔無 菌過濾器除菌。
【專利摘要】一種藤石松提取物在制備抗菌消炎天然藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明采用管碟法對藤石松的超純水提取液進行了抑菌活性的研究，發(fā)現(xiàn)藤石松水提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和產(chǎn)氣大腸桿菌的抑制效果較強，說明藤石松水提取液中含有對細菌具有抑制作用的活性成分，是篩選、開發(fā)植物源殺菌劑的前提和基礎(chǔ)，為制備抗菌消炎天然藥物提供了依據(jù)。
【IPC分類】A61K36/11, A61P31/04, A61P29/00
【公開號】CN105456306
【申請?zhí)枴緾N201610053016
【發(fā)明人】鄒一平, 韓成云, 劉智凱
【申請人】宜春學院, 鄒一平
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2016年1月27日