抗癌組合的制作方法
【專利說明】抗癌組合
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年7月3日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/842,749的優(yōu)先權(quán)，該申 請(qǐng)以引用的方式整體并入本文。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 晚期胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC)經(jīng)常不宜手術(shù)，且僅短暫地對(duì)現(xiàn)有療法有反應(yīng)。吲哚胺 2, 3-加雙氧酶（ID0)在PDAC中的過表達(dá)在通過抑制抗腫瘤免疫性來促進(jìn)疾病進(jìn)展方面發(fā) 揮重要作用。當(dāng)前的ID0抑制劑不適當(dāng)?shù)啬孓D(zhuǎn)免疫抑制，而全身靶標(biāo)外效應(yīng)促成其毒性。因 此，需要提供另外的癌癥療法，其靶向與腫瘤及腫瘤微環(huán)境有關(guān)的免疫抑制機(jī)制。本文提供 解決本領(lǐng)域中的這些及其他問題的方法。
[0005] 發(fā)明概述
[0006] 本文提供包含細(xì)菌細(xì)胞和腫瘤滲透劑的組合物和試劑盒。還提供治療受試者的癌 癥的方法，其包括向受試者施用有效量的細(xì)菌細(xì)胞和腫瘤滲透劑的步驟。提供刺激受試者 的免疫系統(tǒng)的方法。該方法包括向受試者施用有效量的細(xì)菌細(xì)胞和腫瘤滲透劑。還提供增 強(qiáng)抗癌劑向腫瘤細(xì)胞的遞送的方法，其包括將腫瘤細(xì)胞與細(xì)菌細(xì)胞、腫瘤滲透劑及抗癌劑 接觸的步驟。
[0007] 附圖簡(jiǎn)述
[0008] 圖 1 示出 了表示shID〇-ST、PEGPH20?、及shID〇-ST與PEGPH20?的組合在正位 KPC-luc模型小鼠中的作用的一系列圖像。使用活體成像系統(tǒng)（IVIS)在腫瘤植入之后的所 示時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠成像。用shID〇-ST與PEGPH20?的組合治療觀察到腫瘤縮小。
[0009] 圖2A和2B示出了表示具有shID〇-ST與PEGPH20?的組合治療在不同給藥方案下 的作用的一系列圖像。使用活體成像系統(tǒng)（IVIS)在腫瘤植入之后的所示時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠成 像。shID0-ST(5Mcfu)與PEGPH20?(45yg)的組合造成受控的腫瘤生長(zhǎng)以及在3只小鼠 中的2只中，KPC-luc胰腺腫瘤的完全消除。PEGPH20?與對(duì)照細(xì)菌shScr-ST的組合還示出 了在早期時(shí)間點(diǎn)時(shí)顯著的腫瘤生長(zhǎng)控制，但所有小鼠最終都死于腫瘤進(jìn)展。
[0010] 圖3是示出了圖2A和2B的IVIS的定量的曲線圖。對(duì)由圖2中成像的小鼠發(fā)射 的光子進(jìn)行定量。來自用shID〇-ST與PEGPH20?治療且各自在特定劑量下的小鼠的腫瘤比 所有其他組顯著更受控制。
[0011] 圖 4 示出 了表示shID〇-ST與PEGPH20?、shScr-ST與PEGPH20?、吉西他濱與 PEGPH20?及試劑單獨(dú)對(duì)KPC-luc腫瘤的作用的一系列圖像。在用shIDO-ST與PEGPH20 ?治 療的小鼠中觀察到顯著的腫瘤縮小，而所有其他治療方案都與快速的腫瘤進(jìn)展有關(guān)。
[0012] 圖5是示出了圖4的IVIS的定量的曲線圖。對(duì)由圖4中成像的小鼠發(fā)射的光子 進(jìn)行定量。來自用shID〇-ST與PEGPH20?治療的小鼠的腫瘤比所有其他組顯著更受控制， 且小鼠在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)還是活的。
[0013] 圖6是示出了治療不顯著地改變小鼠重量的曲線圖。圖4中的小鼠在每個(gè)成像點(diǎn) 被稱重。在任何組中都未觀察到小鼠重量的減輕。
[0014] 圖7示出了表示PEGPH20?與shArg-ST或?qū)φ誷hScr-ST組合在正位KPC-luc模 型小鼠中的作用的一系列圖像。使用活體成像系統(tǒng)（IVIS)在腫瘤植入之后的所示時(shí)間點(diǎn) 對(duì)小鼠成像。用shArg-ST與PEGPH20?的組合治療及shScr-ST與PEGPH20 ?的組合治療觀 察到腫瘤縮小。
[0015] 圖8示出了表示shArg-ST與PEGPH20?的組合治療在不同的給藥方案下的作 用的一系列圖像。使用活體成像系統(tǒng)（IVIS)在腫瘤植入之后的所示時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠成像。 shID〇-ST與PEGPH20?的組合造成腫瘤生長(zhǎng)的控制。PEGPH20 ?與對(duì)照細(xì)菌shScr-ST的組 合再次示出了腫瘤生長(zhǎng)的衰減。
[0016] 圖9示出了表示shIDO-ΑΤ與PEGPH20?的組合治療的作用的一系列圖像。使用活 體成像系統(tǒng)（IVIS)在腫瘤植入之后的所示時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠成像。shID〇-ST與PEGPH20?的 組合造成小鼠的腫瘤消退及存活率延長(zhǎng)。
[0017] 圖10是在腫瘤植入后的不同時(shí)間點(diǎn)腫瘤負(fù)荷的定量的曲線圖。具體來說，為圖9 中所示的小鼠組的IVIS成像發(fā)射出的光子定量。shIDO-ST與PEGPH20?的組合造成腫瘤 在統(tǒng)計(jì)上顯著的控制，而所有其他組未展現(xiàn)持久的控制。
[0018] 圖11是示出了在曲線圖所示的每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處圖9中所示的小鼠組的重量的曲線 圖。圖11示出了使用shIDO-ST與PEGPH20?組合療法的PDAC腫瘤消除不導(dǎo)致重量減輕。
[0019] 圖12示出了用PEGPH20?治療的帶有腫瘤的小鼠的透明質(zhì)素（HA)染色的圖像。 在用PEGPH20?治療之后48小時(shí)，觀察到透明質(zhì)酸的顯著耗盡。
[0020] 圖13示出了在用PEGPH20?治療的小鼠的腫瘤中的開放血管（openvessel)的圖 像。將來自未治療或用PEGPH20?治療的小鼠的14天腫瘤的切片用抗CD31抗體染色以定 位腫瘤塊內(nèi)的血管的橫截面。在用PEGPH20?治療的小鼠的腫瘤中觀察到更多的開放血管。
[0021] 圖14示出了鼠傷寒沙門氏菌（ST)和嗜中性白細(xì)胞（PMN)流入用shIDO-ST與 PEGPH20?組合療法治療的腫瘤中的圖像。
[0022] 圖 15 示出 了在用PEGPH20?/shScr-ST或PEGPH20?/shID0-ST治療之后 96 小時(shí)針 對(duì)PMN進(jìn)行分析的外科手術(shù)除去的腫瘤的圖像。
[0023] 圖16示出了顯示在shID0-ST/PEGPH20?組合療法治療的腫瘤的核心中腫瘤細(xì)胞 的壞死的圖像。
[0024] 圖17示出了在12周時(shí)從正常BL/6小鼠或用shID0-ST/PEGPH20?組合療法治療 的KPC-Brcal小鼠取走的脾臟和胰臟的圖像。
[0025] 圖18示出了為了確定shID0-ST/PEGPH20?組合療法是否在控制自發(fā)的胰腺腫瘤 中具有功效的KPC-Brcal小鼠的治療的示意圖。
[0026] 圖 19 示出了來自用PEGPH20?/shScr-ST或PEGPH20?/shID0-ST治療的小鼠或?qū)?照同窩出生仔畜的胰臟的圖像。
[0027] 發(fā)明詳述
[0028] 本文提供包含細(xì)菌細(xì)胞和腫瘤滲透劑的組合物和試劑盒。還提供治療受試者的癌 癥的方法，其包括向受試者施用有效量的細(xì)菌細(xì)胞和腫瘤滲透劑的步驟，其中施用治療受 試者的癌癥。
[0029] 提供刺激受試者的免疫系統(tǒng)的方法。該方法包括向受試者施用有效量的細(xì)菌細(xì)胞 和腫瘤滲透劑，其中施用刺激受試者的免疫系統(tǒng)。還提供增強(qiáng)抗癌劑向腫瘤細(xì)胞的遞送的 方法，其包括將腫瘤細(xì)胞與細(xì)菌細(xì)胞、腫瘤滲透劑及抗癌劑接觸的步驟，其中腫瘤細(xì)胞與細(xì) 菌細(xì)胞和腫瘤滲透劑的接觸增強(qiáng)抗癌劑向腫瘤細(xì)胞的遞送。
[0030] 如本文所用，術(shù)語"腫瘤滲透劑"是指能夠滲透腫瘤和/或腫瘤細(xì)胞的試 劑。因此，腫瘤滲透劑可滲透腫瘤細(xì)胞本身或滲透腫瘤細(xì)胞周圍的區(qū)域，例如細(xì) 胞外基質(zhì)。舉例來說，腫瘤滲透劑通過崩解或降解腫瘤細(xì)胞周圍的細(xì)胞外基質(zhì)來 滲透腫瘤?；蛘撸[瘤滲透劑通過進(jìn)入腫瘤細(xì)胞本身來滲透腫瘤。所提供的組合 物和方法中使用的腫瘤滲透劑的實(shí)例包括但不限于透明質(zhì)酸酶多肽、吡非尼酮、 Saridegib(IPI-926)、納米顆粒、白蛋白納米顆粒、葡聚糖、脂質(zhì)體及細(xì)胞滲透肽。此 類腫瘤滲透劑（包括制造和使用該試劑的方法）是已知的且描述于例如以下文獻(xiàn)中： 美國(guó)專利號(hào) 7, 767, 429 ;7, 829, 081 ;7, 846, 431 ;7, 871，607 ;8, 105, 586 ;8, 202, 517; 8, 257, 699 ;8, 431，380 ;及 8, 450, 470;Kozono等人，CancerRes. 73 (7) : 2345-56 (2013); Olive等人，Science324(5933):1457-61 (2009) ;Marrache,等人，Curr.Med. Chem. 20(28) :3500-14(2013)Jung,等人，Curr.Med.Chem. 20(28) :3488-3499(2013); Mattheolabakis等人，Nanomedicine(London)7(10):1577-1590(2012) ;Malam,等 人，TrendsPharmacol.Sci·，30(11):592-599 (2009) ;Varshoaz,ExpertOpin.Drug Deliv·，9(5):509-23(2012);MacEwan和Chilkoti，WileyInterdiscipRevNanomedNa nobiotechnol.，5(1) :31-48(2013)，其以引用的方式整體并入本文中。任選地，透明質(zhì)酸 酶多肽包含SEQIDN0:1或SEQIDN0:2或其片段。任選地，透明質(zhì)酸酶多肽是修飾的 透明質(zhì)酸酶多肽。任選地，透明質(zhì)酸酶多肽是聚乙二醇化的。任選地，透明質(zhì)酸酶多肽是 PEGPH20? (Halozyme,Inc. ,SanDiego,CA)〇
[0031] "核酸"是指以單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物、以及 其互補(bǔ)序列。該術(shù)語包括含有已知的核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或連接物的核酸，其 是合成的、天然存在的、以及非天然存在的，其具有與參照核酸類似的結(jié)合性質(zhì)，并且其以 類似于參照核苷酸的方式代謝。這種類似物的實(shí)例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、 膦酸甲酯、手性膦酸甲酯、2-0-甲基核糖核苷酸、肽-核酸（PNA)。
[0032] 除非另有陳述，否則特定的核酸序列還隱含地包括其保守修飾的變體（例如簡(jiǎn)并 密碼子取代）及互補(bǔ)序列以及明確指示的序列。具體來說，簡(jiǎn)并密碼子取代可通過生成如 在其一個(gè)或多個(gè)選擇的（或所有）密碼子的第三位由混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代 的序列而實(shí)現(xiàn)（Batzer等人，NucleicAcidRes. 19:5081(1991) ;0htsuka等人，J.Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);Rossolini等人，Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。術(shù)語核 酸可與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸、以及多核苷酸互換地使用。
[0033] 特定的核酸序列還隱含地包括"剪接變體"。類似地，由核酸編碼的特定蛋白隱含 地包括由那個(gè)核酸的剪接變體編碼的任何蛋白。"剪接變體"顧名思義是基因的選擇性剪接 的產(chǎn)物。在轉(zhuǎn)錄之后，初始核酸轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可被剪接以使得不同（選擇性）核酸剪接產(chǎn)物編 碼不同的多肽。用于產(chǎn)生剪接變體的機(jī)制可變化，但包括外顯子的選擇性剪接。此定義也 包括通過通讀轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的來源于相同核酸的可變多肽。剪接反應(yīng)的任何產(chǎn)物，包括剪接產(chǎn) 物的重組形式，都被歸入此定義中。鉀通道剪接變體的實(shí)例論述于Leicher等人，J.Biol. Chem. 273 (52) : 35095-35101 (1998)中。
[0034] 核酸當(dāng)將其置于與另一核酸序列處于功能性關(guān)系中時(shí)是"可操作連接的"。例如， 如果被表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白，那么前序列或分泌型前導(dǎo)序列的DNA可操作地連接 到多肽的DNA;如果影響序列的轉(zhuǎn)錄，那么啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可操作地連接到編碼序列；或者 如果被定位以便促進(jìn)翻譯，那么核糖體結(jié)合位點(diǎn)可操作地連接到編碼序列。一般來說，"可 操作地連接"意指連接的DNA序列彼此靠近，并且在分泌型前導(dǎo)序列的情況下是鄰接的且處 于閱讀相中。然而，增強(qiáng)子不必是鄰接的。連接是通過在方便的限制性位點(diǎn)處的連接實(shí)現(xiàn)。 如果這種位點(diǎn)不存在，那么按照常規(guī)操作使用合成的寡核苷酸銜接子或接頭。
[0035] 術(shù)語"同一的"或"同一性"百分比在兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多肽序列的上下文中 是指，兩個(gè)或更多個(gè)相同的或具有指定百分比（即，當(dāng)在比較窗口或指定的區(qū)域上就最大 一致性進(jìn)行比較和比對(duì)時(shí)，在指定的區(qū)域上具有約60 %同一性，優(yōu)選地65 %、70 %、75 %、 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的同一性）的 相同氨基酸殘基或核苷酸的序列或亞序列，如通過使用具有下列描述的缺省參數(shù)的BLAST 或BLAST2. 0序列比較算法或通過人工比對(duì)及目測(cè)（參見，例如NCBI網(wǎng)站等）所測(cè)量的。 這些序列可以說是"基本同一的"。此定義也指或可應(yīng)用于測(cè)試序列的互補(bǔ)序列。該定義還 包括具有缺失和/或添加的序列以及那些具有取代的序列。如下所述，優(yōu)選算法可考慮到 缺口等。優(yōu)選地，同一性存在于長(zhǎng)度為至少約25個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域上，或更優(yōu)選地， 存在于長(zhǎng)度為50-100個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域上。
[0036] 對(duì)于序列比較，通常一個(gè)序列被用作參照序列，將測(cè)試序列與參照序列相比較。當(dāng) 使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參照序列都輸入計(jì)算機(jī)，如果需要，設(shè)定亞序列座標(biāo)，然后 設(shè)定序列算法程序參數(shù)。優(yōu)選地，可使用缺省的程序參數(shù)，或者可設(shè)定選擇參數(shù)。然后，序 列比較算法基于程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參照序列的序列同一性百分比。
[0037] 如本文所用的"比較窗口"包括涉及任何一個(gè)選自由以下組成的組的數(shù)目的 鄰接位置的區(qū)段：20至600,通常約50至約200,更通常約100至約150,其中在兩個(gè)序 列最佳比對(duì)后，可將一個(gè)序列與相同數(shù)目鄰接位置的參照序列比較。用來比較的序列 比對(duì)方法在本領(lǐng)域中是熟知的?？赏ㄟ^以下方法進(jìn)行用于比較的序列最佳比對(duì)：例如 Smith&Waterman，Adv.Appl.Math. 2:482(1981)的局部同源性算法；Needleman&Wunsch，J. Mol.Biol. 48:443 (1970)的同源性比對(duì)算法；Pearson&Lipman，Proc·Nat' 1.Acad. Sci.USA85:2444 (1988)的相似性搜索法；這些算法的計(jì)算機(jī)化執(zhí)行（GAP、BESTFIT、 FASTA及TFASTA，在WisconsinGeneticsSoftwa