。
[0062][試驗(yàn)例2]:組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊提取物的細(xì)胞保護(hù)效果測(cè)定
[0063] 進(jìn)行對(duì)制造例1與比較制造例1的SDS(十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodecyl sulfate))細(xì)胞毒性的細(xì)胞保護(hù)效果實(shí)驗(yàn)。
[0064] 以添加有10%胎牛血清（FBS)、1%青霉素-鏈霉素的頂DM在37°C、5% 0)2培 養(yǎng)器中培養(yǎng)人成纖維細(xì)胞。將培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞以IX1〇4細(xì)胞/孔分別分在96孔板 中，培養(yǎng)24小時(shí)。以2%FBS培養(yǎng)基替換培養(yǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)基，將SDS(Sodiumdodecyl 81!1€&仏)0.002%預(yù)處理1個(gè)小時(shí)后，以各自處理濃度分別以培養(yǎng)基稀釋制造例1及比 較制造例1，并行處理后，在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。在新培養(yǎng)基中10倍稀釋溶解在 PBS(phosphatebufferedsaline)中的MTT保存溶液（5mg/ml)，將其溶液分別添加各 100μ1到已結(jié)束培養(yǎng)的細(xì)胞的各自孔中，在37°C反應(yīng)4小時(shí)。因?yàn)榉磻?yīng)后活著的細(xì)胞的 線粒體中的脫氫酶而黃色水溶性基質(zhì)MTT[3-(4, 5-dimethylthiazol_2-yl)-2, 5-dipheny ltetrazolium-bromide]還原為非水溶性的MTT-甲I雞（MTT-formazan)結(jié)晶，檢測(cè)其量就 能測(cè)定細(xì)胞的存活率。除去培養(yǎng)上清液，在各孔中添加DMS0 200μ1來(lái)溶解細(xì)胞中生成的 ΜΤΤ-甲晶體后，以吸收分光光度儀（UVmax，MolecularDevice,USA)測(cè)定能夠使甲總怕 吸光度最大的測(cè)試濾光片540nm波長(zhǎng)的0.D值與標(biāo)準(zhǔn)濾光片630nm波長(zhǎng)的0.D值，以其差 值求出吸光度。（參考文獻(xiàn)TheΕΜΒ0Journal(2002) 21，2407-2417外多數(shù)）。細(xì)胞保護(hù)效 果以吸光度的百分比示出。
[0065] 細(xì)胞生存率（％) =(試樣處理組吸光度/無(wú)處理組吸光度）X100
[0066] 以原始（Raw)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)計(jì)算無(wú)處理組的吸光度與試樣處理組的吸光度的平均 值，算出標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0067][表 4]
[0068]
[0069] 如表4所示，可知，對(duì)于外部刺激，本發(fā)明的制造例1的細(xì)胞保護(hù)效果與比較制造 例1相比，更能促進(jìn)細(xì)胞保護(hù)效果。
[0070][試驗(yàn)例3]:組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽提取物的抗炎效果的測(cè)定
[0071] 測(cè)定制造例1與比較制造例1對(duì)脂氧合酶活性和一氧化氮生成量而進(jìn)行抗炎效果 實(shí)驗(yàn)。
[0072] 炎癥反應(yīng)是人體為了維持恒常性，對(duì)外部刺激的生物防御反應(yīng)。生成刺激引起的 炎癥的酶的途徑以脂氧合酶活性途徑及環(huán)氧合酶（cycloxygenase)活性途徑為代表。脂 氧合酶催化不飽和脂肪酸的氫過(guò)氧化（hydroperoxidation)，生成脂肪過(guò)氧化氫（fatty hydroperoxides)，這些物質(zhì)再生成環(huán)氧化物（epoxide)、羥基、酮、醛等分解產(chǎn)物。脂氧合酶 從由亞麻酸（linolenicacid)生物合成的花生四稀酸（arachidonicacid)生成與生物體 內(nèi)炎癥反應(yīng)或過(guò)敏等相關(guān)的多種化學(xué)介質(zhì)（chemicalmediator)。因此，阻礙脂氧合酶的物 質(zhì)顯出抑制與各種炎癥反應(yīng)或過(guò)敏等相關(guān)的化學(xué)介質(zhì)（chemicalmediators)的生成的結(jié) 果。雖然由以炎癥反應(yīng)為媒介的酶等的活性化而生成的一氧化氮（NO)在免疫反應(yīng)中起重 要作用，但是過(guò)多的一氧化氮會(huì)引起炎癥反應(yīng)，給免疫體系帶來(lái)異常。
[0073][試驗(yàn)例3-1]:氧化氮的生成抑制能力的測(cè)定
[0074] 氧化氮（N0)的生成程度以格林等的方法（GreenLC,WagnerDA,GlogowskiJ,et al.1982.Analysisofnitrate,nitrite,and[15N]nitrateinbiologicalfluids. AnalBiochem126:131-138.)測(cè)定作為氧化氮（NO)生成指標(biāo)的培養(yǎng)基中生成的硝酸鹽 的量，進(jìn)行分析。即，處理試樣，培養(yǎng)30分鐘后，添加LPS(lipopolysaccharide, 1μg/ mL)，培養(yǎng)24小時(shí)而得到Raw264. 7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液，在該Raw264. 7巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液的 100μL培養(yǎng)基上清液中添加50μL的1 %磺胺（溶解在5 %磷酸（phosphoricacid)中 的磺胺（sulphanilamide))與 50μL的 0· 1 % 萘二胺二鹽酸鹽（naphthylenediamine dihydrochloride)，在室溫反應(yīng)10分鐘后，在540nm測(cè)定吸光度。用于所述抗炎活性效果 試驗(yàn)的對(duì)照組采用了單獨(dú)處理LPS的實(shí)驗(yàn)組。
[0075] ※勵(lì)抑制率（％) =(對(duì)照組的N0量-各提取物的N0量/對(duì)照組的N0量）X100
[0076] 以原始（Raw)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)計(jì)算平均值，求出標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0077][表 5]
[0078]
[0079]LPS引起的氧化應(yīng)激中發(fā)生的N0的生成抑制能力如所述表5所示的結(jié)果那樣，制 造例1與比較制造例1相比，顯示出約1. 5~2倍的N0生成抑制效果。
[0080] [試驗(yàn)例3-2]:測(cè)定脂氧合酶（Lipoxygenase)的活性抑制
[0081] 實(shí)施作為對(duì)外部刺激的炎癥生成因素的代表性的酶的脂氧合酶的活性抑制 試驗(yàn)。向ImM亞麻酸（Sigma-aldrich,USA)lml中混合待測(cè)試樣0.lml與脂氧合酶 (Sigma-aldrich，USA)0. 9ml，進(jìn)行禍震蕩（voltexing)后，在 25°C反應(yīng) 10 分鐘。而后加 入 20%三氯乙酸（trichloroaceticacid)0.5ml與 0.6%硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid)lml，在熱水中反應(yīng)10分鐘后，在冰水中冷浸2-3分鐘，加入丁醇（butanol) 2ml，禍震 蕩20秒以上后，以3500rpm離心分離5分鐘，以UV分光光度計(jì)（spectrophotometer)在 513nm測(cè)定0.D值，根據(jù)下述數(shù)學(xué)式2算出脂氧合酶的活性抑制率，在表6中示出。測(cè)定試 驗(yàn)分3批（batch)實(shí)施了 3次，以原始（Raw)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)計(jì)算吸光度的平均值，求出標(biāo)準(zhǔn)偏 差。
[0082]
[0085] 如表6所示，制造例1的組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽提取物與無(wú)處理的對(duì)照組 比較時(shí)，依賴(lài)濃度抑制脂氧合酶，能夠確認(rèn)與比較制造例1相比，對(duì)引起炎癥的酶的活性抑 制效果更出色。
[0086][試驗(yàn)例4]組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽提取物的抗氧化效果測(cè)定
[0087] 實(shí)施了制造例1與比較制造例1的抗氧化效果試驗(yàn)。
[0088][試驗(yàn)例4_1]DPPH(1, 1-二苯基_2_苦基餅（1，l-diphenyl_2picrylhydrazyl)) 自由基引起的抗羥基自由基活性（％)測(cè)定
[0089] 活性氧引起的反應(yīng)幾乎大部分是自由基反應(yīng)，包含自動(dòng)氧化反應(yīng)過(guò)程。在生物體 內(nèi)抗氧化劑負(fù)責(zé)阻斷自動(dòng)氧化反應(yīng)的作用。作為給電子能力的還原能力越強(qiáng)，越能成為強(qiáng) 抗氧化劑。測(cè)定抗氧化劑的還原能力的試劑有1,1-二苯-2-苦基肼（l，l-diphenyl-2-pi crylhydrazyl:DPPH)自由基。DPPH在化合物內(nèi)以氮為中心的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的自由基形態(tài)存在。 在517nm顯示最大吸收，被還原后517nm的吸收消失。將DPPH(D9132,SIGMA)溶解于乙醇 與蒸餾水的6:4 (v/v)的混合溶劑中，調(diào)整所述DPPH溶液使其在513nm的吸光度為0. 6左 右。根據(jù)濃度稀釋的試樣lml中分別添加DPPH溶液2ml，進(jìn)行混合。常溫下放置約1個(gè)小 時(shí)后，使用吸收分光光度儀（UVmax，MolecularDevice，USA)測(cè)定513nm的吸光度，將其結(jié) 果示于表7。
[0090][表7]
[0091]
[0092] 如表7所示，制造例1顯示出了優(yōu)異的抗氧化效果。
[0093][試驗(yàn)例4-2] :ABTS自由基引起的抗-羥基自由基活性（％ )測(cè)定
[0094] 利用米勒[Milleretal. (1993)]的方法測(cè)定提取物的總抗氧化能力。以7mM 的濃度將2, 2' -連氮基-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯）（2, 2' -Azino-bis(3-ethyl benzothiazoline-6-sulfonate))溶于蒸餾水，向其中以最終濃度為2. 45mM的方式添加過(guò) 硫酸鉀（Potassi