027] 下面，說明本發(fā)明的組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽提取物的制造方法。
[0028] 本發(fā)明包括：(a)將組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽在選自純凈水、C1~C4的醇、以 及C1~C5的多元醇中的一種以上的提取溶劑中浸漬3~30天而形成浸漬溶液的步驟；以 及（b)過濾所述浸漬溶液而獲得組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽提取物的步驟。
[0029] 所述（a)步驟中使用的上述組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽優(yōu)選為干燥狀態(tài)。而且 所述（a)步驟的浸漬時間優(yōu)選為10~20天。
[0030] 相對于所述干燥的組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽的重量，所述提取溶劑優(yōu)選以 10~20倍的重量比（w/w)使用。
[0031 ] 所述C1~C4的醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等，特別優(yōu)選為乙醇（Ethyl alcohol)。另外，所述Cl~C5的多元醇優(yōu)選為選自烷撐二醇、1,3-丁二醇、丙二醇及戊二 醇中的一種以上。
[0032] 另外，所述提取溶劑為所述醇與烷撐二醇的混合溶劑時，其混合比（w/w)優(yōu)選為 6:4~9:1 (即，相對于醇和烷撐二醇的全部混合溶劑的總重量，醇的含量優(yōu)選為60~90 重量％ )。所述醇與烷撐二醇的混合溶劑的含量在所述范圍時，具有對僅提取所需有效成 分更有效的極性。在這里，所述醇與烷撐二醇的混合溶劑中使用的醇的濃度優(yōu)選為60%~ 100%〇
[0033] 另外，所述提取溶劑也可以為所述純凈水與所述烷撐二醇的混合溶劑，其混合比 優(yōu)選為3:7~1:9(即，相對于純凈水和烷撐二醇的全部混合溶劑的總重量，烷撐二醇的含 量優(yōu)選為70~90重量％ )。
[0034] 所述提取溶劑為單一溶劑時優(yōu)選為乙醇。并且，提取溶劑為混合溶劑時可以使用 乙醇與烷撐二醇的混合溶劑，優(yōu)選使用乙醇與1，3-丁二醇、乙醇與丙二醇、或者乙醇與戊 二醇的混合溶劑，更優(yōu)選可以使用乙醇與1，3-丁二醇的混合溶劑、或者乙醇與戊二醇的混 合溶劑。
[0035] 另外，所述（b)步驟優(yōu)選進(jìn)一步包括除去提取溶劑的步驟。
[0036] 本發(fā)明提供包含由所述制造工序獲得的組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽提取物為 有效成分的化妝品組合物。在這里，通過以下幾個步驟來確認(rèn)根據(jù)本發(fā)明的組織培養(yǎng)的澳 洲拉沃爾菊幼芽提取物的功效，其中，包括：用所述組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽提取物對 人成纖維細(xì)胞進(jìn)行處理，調(diào)查對皮膚刺激的細(xì)胞毒性效果的步驟；用所述組織培養(yǎng)的澳洲 拉沃爾菊幼芽提取物對人成纖維細(xì)胞進(jìn)行處理，調(diào)查對外部刺激的細(xì)胞保護效果的步驟； 通過對所述組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽提取物進(jìn)行脂氧合酶（Lpoxgenase)活性抑制及 氧化氮的生成抑制能力試驗，調(diào)查抗炎效果的步驟；通過過氧化物陰離子的（SUPER0XIDE ANION)消除活性及自由基（HYDROXYRADICAL)消除活性能力，調(diào)查抗氧化效果的步驟；調(diào) 查酪氨酸酶抑制帶來的皮膚美白改善效果的步驟。
[0037] 而且，根據(jù)本發(fā)明的化妝品組合物并不限于下面例示的劑型，能夠采用本技術(shù)領(lǐng) 域所熟知的劑型。本發(fā)明的化妝品組合物能夠在不損害本發(fā)明的目的及效果的范圍內(nèi)在所 述提取物中能夠配合通常在化妝品中配合的其他成分。
[0038] 下面舉出根據(jù)本發(fā)明的制造例、試驗例及劑型例進(jìn)行更具體的說明，但這些只是 為了例示本發(fā)明，本發(fā)明的范圍并不限定于此。
[0039] [制造例1~制造例4、以及比較制造例1~比較制造例4]:組織培養(yǎng)的澳洲拉沃 爾菊幼芽提取物的制造
[0040] 將組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽及天然澳洲拉沃爾菊分別水洗，用紗布除去水 后，干燥及切碎。在這里，本制造例中使用的"組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽"是由忠北大 學(xué)的尖端園藝技術(shù)開發(fā)研究中心提供的，它是將從新西蘭進(jìn)口的澳洲拉沃爾菊種子在無菌 條件下利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)幼芽，以營養(yǎng)液培養(yǎng)而成的。
[0041] 將準(zhǔn)備好的組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽及澳洲拉沃爾菊在以表1中記載的含 量存在的混合溶劑中浸漬2周，進(jìn)行熟化。其后以濾紙（日本ToyoroshiKaisha，Ltd.銷售 的5C，185_)過濾，蒸發(fā)乙醇，獲得濾液狀的組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽提取物與澳洲 拉沃爾菊提取物。
[0042] [表 1]
[0043]
[0044](bl:70% 乙醇/b2 :1，3-丁二醇/b3 :丙二醇）
[0045][試驗例1]組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽提取物的細(xì)胞毒性測定
[0046] 通過對制造例1與比較制造例1的細(xì)胞毒性試驗，評價了安全性。
[0047][細(xì)胞培養(yǎng)（Cellculture)]
[0048] 將從ATCC公司購入的(XD-1064sk人成纖維細(xì)胞在10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，以添加有 10%胎牛血清（FBS)、1 %青霉素-鏈霉素（penicillin-streptomycin)的伊思柯夫改良培 養(yǎng)液（Iscove'smodifiedDulbeco'smedium:IMDM) 10ml為培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，使得在 37°C、 5%C02培養(yǎng)器中細(xì)胞融合（confluency)70%~80%。培養(yǎng)基每周更換2次，達(dá)到融合的細(xì) 胞使用胰酶-EDTA(trypsin-EDTA)進(jìn)行胰酶處理（trypsinization)后，以傳代培養(yǎng)維持。 將所述培養(yǎng)的人成纖維細(xì)胞分別以1X1〇4細(xì)胞/孔分在96孔板（96-multiwellplate) 上培養(yǎng)24小時。以2%FBS培養(yǎng)基替換培養(yǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)基，以處理濃度分別用培養(yǎng)基稀 釋制造例1的組織培養(yǎng)的澳洲拉沃爾菊幼芽提取物與比較制造例1的澳洲拉沃爾菊提取物 后，在C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。
[0049][試驗例1-1]:細(xì)胞毒性效果的測定（MTT檢測（assay))
[0050] 將溶解于PBS(磷酸鹽緩沖鹽水（phosphatebufferedsaline))的MTT保存 (stock)溶液（5mg/ml)加入新的培養(yǎng)基中稀釋10倍，將其溶液分別添加100μ1至放有結(jié) 束培養(yǎng)的細(xì)胞的孔中，在37°C反應(yīng)4小時。因為反應(yīng)后活著的細(xì)胞的線粒體中的脫氫酶 而黃色水溶性基質(zhì)MTT[3_(4, 5-dimethylthiazol_2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium-bro mide(3-(4, 5-二甲基-2-噻唑基）-2, 5-二苯基-2H-四氮唑鐨溴化物）]還原為非水溶 性的MTT-甲I馨（MTT-formazan)結(jié)晶，檢測其量就能測定細(xì)胞的存活率。除去培養(yǎng)上清 液，在各孔中添加DMS0 200μ1來溶解細(xì)胞中生成的MTT-甲J聲晶體后，以吸收分光光度 儀（UVmax,MolecularDevice,USA)測定能夠使甲的吸光度最大的測試濾光片（Test fiIter) 540nm波長的0.D值與標(biāo)準(zhǔn)濾光片（Referencefilter) 630nm波長的0.D值，以其 差值求出吸光度（參考文獻(xiàn)TheΕΜΒ0Journal(2002) 21，2407-2417外多數(shù)）。細(xì)胞毒性以 吸光度的百分比示出。
[0051] ※細(xì)胞生存率（％) =(試樣處理組吸光度/無處理組吸光度）X100
[0052] 以原始（Raw)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)計算無處理組的吸光度與試樣處理組的吸光度的平均 值，算出標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0053][表2]
[0054]
[0055][試驗例1-2]:細(xì)胞毒性效果的測定（中性紅檢測（NeutralRedassay))
[0056] 在培養(yǎng)結(jié)束的細(xì)胞的各孔中分別加入中性紅（Neutral Red，Sigma-Aldrich，USA) 50μg/ml，反應(yīng)3小時。中性紅濃縮在完全存活的細(xì)胞或沒有損 傷的細(xì)胞溶酶體內(nèi)。反應(yīng)后，以1.0%福爾馬林/1.0%氯化鉀固定細(xì)胞，然后添加1.0%乙 酸/50%乙醇溶液，提取中性紅。將提取的中性紅利用吸收分光光度儀（UVmax，Molecular Device,USA)測定在540~630nm的各濃度細(xì)胞毒性值，并示于下述表3。細(xì)胞毒性以吸光 度的百分比示出，以3批（lot)實施3回。
[0057] ※細(xì)胞生存率（％) =(試樣處理組吸光度/無處理組吸光度）X100
[0058][表 3]
[0059]
[0060] 以原始（Raw)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)計算無處理組的吸光度與試樣處理組的吸光度的平均 值，算出標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0061] 如表2及表3所示，本發(fā)明的制造粒1的MTT5。、NR5。值在1 %以上，可知與比較制 造例1相比是安全的原料