用于偵測膠原蛋白沈淀。圖2例示A組及B組肝細胞天郎星紅染 色切片的代表顯微照片，其中圖2 (A)及2 (C)是50倍放大，而圖2 (B)及2 (D)是200倍放 大。如圖2(A)及2(B)所示，A組天郎星紅染色顯示膠原蛋白堆積在中央靜脈、膽管及變性 肝細胞周圍。如圖2(C)及2(D)所示，B組（測試化合物，化合物1)處理后膠原蛋白堆積 在中央靜脈及膽管周圍的現(xiàn)象減少。
[0119] 第三型膠原蛋白染色用于偵測膠原蛋白纖維的分布。圖3例示A組及B組肝細 胞第三型膠原蛋白免疫染色切片的代表顯微照片，其中圖3 (A)及3 (C)是50倍放大，而圖 3(B)及5(D)是400倍放大。如圖3(A)及3(B)所示，在A組載劑對照組的第三型膠原蛋白 染色顯示，膠質(zhì)纖維是于類洞內(nèi)皮區(qū)域（sinusoidalarea)及膽管周圍及中央靜脈處堆積。 如圖3(C)及3(D)所示，B組（測試化合物，化合物1)處理后在類洞內(nèi)皮區(qū)域的膠原蛋白 纖維的厚度及/或長度有減少的現(xiàn)象。
[0120] 圖4顯示A組及B組全血葡萄糖濃度（mg/dL)。如圖4所示，相較于A組的結(jié)果， B組（測試化合物，化合物1)處理后全血葡萄糖量有下降的趨勢（A組：636±137mg/dL，B 組：580±122mg/dL)。
[0121] 圖5顯示A組及B組三酸甘油脂（TG)的濃度（mg/dL)。如圖5所示，相較于A組的結(jié) 果，B組（測試化合物，化合物1)處理在血漿TG濃度上表現(xiàn)出明顯下降（A組：643±402mg/ dL，B組：229±144mg/dL)。
[0122] 天門冬胺酸轉(zhuǎn)胺酶（AST)及丙胺酸轉(zhuǎn)胺酶（ALT)乃人類器官，諸如肝臟、心臟、肌 肉等，合成氨基酸所需的重要酵素。臨床上測量AST及ALT-般作為評估肝細胞損傷的診 斷指標，進而決定肝臟的健康程度。在正常的情況下，血清中這些酵素的含量較低。AST及 ALT明顯升高可能表示肝臟受到損傷。圖6及7分別顯示A組及B組血漿AST及血漿ALT 的濃度（U/dL)。如圖6所示，相較于A組（載劑）的處理，B組（測試化合物，化合物1)的 處理在血漿AST值上表現(xiàn)出略為下降（A組：202±177U/L，B組：141±35U/L)。如圖7所 示，相較于A組（載劑）的處理，B組（測試化合物，化合物1)的處理在血漿ALT值上表現(xiàn) 出略為下降（GroupA:64±64U/L，GroupB:34±10U/L)〇
[0123] 由此可見，經(jīng)測試化合物處理后，可降低血漿TG濃度、傾向于抑制血糖濃度，并略 為降低血漿AST及ALT值。所述測試化合物同時也降低發(fā)炎細胞浸潤及肝小葉中的脂肪沈 淀。此外，如天郎星紅染色及第三型膠原蛋白染色可見，所述測試化合物傾向于抑制膠原 蛋白沈淀，顯示所述測試化合物對于肝纖維化肝炎具有抗纖維變性（anti-fibrotic)的功 效。
[0124] 非化學性損傷所致肝炎的纖維化
[0125] 圖8至14例示測試化合物（化合物1)可有效地降低非化學性損傷所致肝炎的肝 細胞纖維化。彼等減少藉由諸如染色、天狼星紅染色及膠原蛋白免疫染色等組織學分 析，及進一步以諸如血糖、血漿丙胺酸轉(zhuǎn)胺酶及血漿天門冬胺酸轉(zhuǎn)胺酶等血漿生化標記，從 而評估肝纖維化所致肝臟損傷程度而得。
[0126] 圖8例示A組及B組肝細胞HE染色切片的代表顯微照片，其中圖8 (A)及8 (C)是 50倍放大，而圖8 (B)及8 (D)是200倍放大。如圖8 (A)及8 (B)所示，A組（載劑）肝臟切 片中可見發(fā)炎細胞浸潤、巨-及微-多孔脂肪沈淀、膽管增生及肝細胞膨脹。如圖8(C)及 8(D)所示，相較于A組，B組（測試化合物，化合物1)處理后趨向減少巨-多孔脂肪沈淀。
[0127] 圖9顯示A組及B組肝細胞天郎星紅染色切片的代表顯微照片，其中圖9(A)及 9 (C)是50倍放大，而圖9 (B)及9 (D)是200倍放大。如圖9 (A)及9 (B)所示，A組天郎星 紅染色顯示膠原蛋白堆積在中央靜脈、膽管及變性肝細胞周圍。在A組處理中觀察到中央 對中央橋接纖維化現(xiàn)象（central-t〇-centralbridgingfibrosis)，此即顯示在肝臟細胞 中嚴重纖維化。如圖9(C)及9(D)所示，B組（測試化合物，化合物1)處理后膠原白堆積 在中央靜脈及膽管周圍的現(xiàn)象減少。
[0128] 圖10顯示A組及B組肝細胞第三型膠原蛋白免疫染色切片的代表顯微照片，其中 圖10 (A)及10 (C)是50倍放大，而圖10⑶及10⑶是400倍放大。如圖10 (A)及10 (B) 所示，在A組載劑對照組第三型膠原蛋白染色顯示，膠原蛋白纖維是于類洞內(nèi)皮區(qū)域及膽 管周圍及中央靜脈處堆積。如圖10(C)及10(D)所示，B組（測試化合物，化合物1)處理 后在類洞內(nèi)皮區(qū)域的膠原蛋白纖維的厚度及/或長度有減少的現(xiàn)象。
[0129] 圖11圖示A組及B組全血葡萄糖濃度（mg/dL)。如圖11所示，相較于A組的結(jié)果， B組（測試化合物，化合物1)處理后全血葡萄糖量有明顯下降的趨勢（A組：728±109mg/ dL，B組：566 ±65mg/dL)。
[0130] 圖12圖示A組及B組三酸甘油脂（TG)的濃度（mg/dL)。如圖12所示，相較于A組 的結(jié)果，B組（測試化合物，化合物1)處理在血漿TG濃度表現(xiàn)略為下降（A組：758±877mg/ dL，B組：704±450mg/dL)。
[0131] 圖13及14分別圖示A組及B組血漿AST及血漿ALT的濃度（U/dL)。如圖13所 示，相較于A組（載劑）的處理，B組（測試化合物，化合物1)的處理在血漿AST值表現(xiàn)略 為上升，但此變化并不具顯著性（A組：143±42U/L，B組：167±87U/L)。如圖14所示，相 較于A組（載劑）的處理，B組（測試化合物，化合物1)的處理在血漿ALT值表現(xiàn)下降（A 組：47 ± 22U/L，B組：38 ± 11U/L)。
[0132] 綜上，經(jīng)測試化合物（例如化合物1)處理后，可降低血糖值、血漿TG濃度、傾向于 減少肝小葉中的脂肪沈淀及降低ALT值，由此可見本文所提供的環(huán)己烯酮化合物具有改善 脂質(zhì)及碳水化合物代謝的功效，以及對于高脂肪飲食所導致的肝臟損傷亦有保護的功效。 此外，如天郎星紅染色及第三型膠原蛋白染色結(jié)果所示，所例示的環(huán)己烯酮化合物（例如 化合物1)傾向于抑制膠原蛋白沈淀，顯示本文所提供的環(huán)己烯酮化合物對于肝纖維化肝 炎具有抗纖維變性（anti-fibrotic)的功效。
[0133] 綜上所述，本發(fā)明成功地展示測試化合物可有效地減少脂肪肝疾病，以及因代謝 癥候群特別是高脂肪飲食所致的肝臟纖維化的程度。
[0134] 實例3:包含化合物1及麥角固醇的組合物對于脂肪肝狀況的減緩
[0135] 除測試組及處理程序外，"代謝癥候群"模型、組織學分析、全血及血漿生化測試及 非化學性損傷所導致的脂肪肝疾病等所用材料及步驟是類似實例2所述者。對照組（A組） 中，6只老鼠插胃管喂食載劑（玉米油SigmaChemicalCo.)。B組6只老鼠則口服投以載 劑及測試化合物（化合物1)，其劑量為48毫克/公斤，一天兩次（每天96毫克/公斤）以 及麥角固醇，其劑量為12毫克/公斤，一天兩次（每天24毫克/公斤）。C組6只老鼠則 口服投以載劑及測試化合物（化合物1)，其劑量為48毫克/公斤，一天兩次（每天96毫克 /公斤）。
[0136] 表一概述本實驗的時間表。
[0137]表一
[0141] 表二例示處理流程
[0142]表二
[0146]HE染色
[0147] 圖15例示A組至C組肝細胞HE染色切片的代表顯微照片，其中圖15 (A)、15 (C) 及15 (E)是50倍放大，而圖15⑶、15 (D)及15 (F)是200倍放大。如圖15 (A)及15⑶所 示，A組肝臟切片中可見發(fā)炎細胞浸潤、巨-及微-多孔脂肪沈淀、膽管增生及肝細胞膨脹。 如圖15(C)及15(D)所示，測試化合物（化合物1)與麥角固醇的組合減少巨多孔脂肪沈淀 及發(fā)炎細胞浸潤。B組中肝細胞有絲分裂的數(shù)量高于A組。如圖15(E)及15(F)所示，單獨 以測試化合物處理可減少巨多孔脂肪沈淀，但不影響發(fā)炎細胞浸潤。
[0148] 從圖15可見，測試化合物（化合物1)與麥角固醇的組合（B組）具有降低巨多孔 脂肪沈淀的能力。相較于僅單獨使用測試化合物（C組），測試化合物與麥角固醇的組合（B 組）進一步抑制發(fā)炎細胞浸潤，因而顯示相較于C組具更佳的抗發(fā)炎功效。
[0149] 天郎星紅染色
[0150] 圖16例示A組至C組肝細胞天郎星紅染色切片的代表顯微照片，其中圖16(A)、 16 (C)及16 (E)是50倍放大，而圖16⑶、16 (D)及16 (F)是200倍放大。如圖16 (A)及 16(B)所示，A組天郎星紅染色顯示膠原蛋白堆積在中央靜脈、膽管及變性肝細胞周圍，顯 示中央對中央橋接纖維化現(xiàn)象（central-to-centralbridgingfibrosis)，此即顯示在肝 臟細胞中嚴重纖維化。如圖16(C)及16(D)所示，測試化合物（化合物1)與麥角固醇的組 合傾向于降低膠原蛋白堆積現(xiàn)象。如圖16(E)及16(F)所示，單獨以環(huán)己烯酮化合物處理 者，相較于對照組，其僅略為降低膠原蛋白堆積現(xiàn)象。
[0151] 因此，不論是本文所提供的環(huán)己烯酮化合物（例如化合物1)與麥角固醇的組合（B 組）或單獨使用測試化合物（C組），兩者均傾向于抑制膠原蛋白堆積，因此可預防肝臟纖維 化。特定言之，相較于僅單獨使用測試化合物，本發(fā)明所提供的環(huán)己烯酮化合物（例如化合 物1)與麥角固醇的組合（B組）表現(xiàn)更佳抗肝臟纖維化的能力。
[0152] 第三型膠原蛋白的免疫組織化學分析
[0153] 圖17例示A組至C組第三型膠原蛋白免疫染色肝臟切片的代表顯微照片，其中 圖17(A)、17 (C)及17(E)是100倍放大，而圖17⑶、17 (D)及17(F)是400倍放大。如圖 17(A)及17(B)所示，載劑對照組第三型膠原蛋白染色顯示，膠原蛋白纖維是于類洞內(nèi)皮區(qū) 域及膽管周圍及中央靜脈處堆積。如圖17(C)、17(D)、17 (E)及17(F)所示，環(huán)己烯酮化合 物（例如化合物1)與麥角固醇的組合及單獨使用環(huán)己烯酮