一種羌活提取物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羌活提取物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腎臟是人體的重要器官，用于保證機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，是新陳代謝得以正常進(jìn)行。 腎損傷時(shí)泌尿外科常見(jiàn)的急癥之一，對(duì)腎損傷做出適當(dāng)?shù)闹委煼桨?，?duì)減輕患者的傷情，改 善預(yù)后情況至關(guān)重要。因此，近年來(lái)腎損傷保護(hù)藥物在不斷的研究和開(kāi)發(fā)中。
[0003] 研究發(fā)現(xiàn)中藥對(duì)腎損傷具有明顯的保護(hù)作用，而且相對(duì)于西藥來(lái)說(shuō)，中藥更加溫 和安全，副作用較小。羌活，傘形科、羌活屬植物，性溫，散表寒；祛風(fēng)濕；利關(guān)節(jié)；止痛。主 外感風(fēng)寒；頭痛無(wú)汗；風(fēng)水浮腫；瘡瘍腫毒。用于陽(yáng)痿遺精，遺尿尿頻，腰膝冷痛，腎虛作喘， 五更泄瀉；外用治白癜風(fēng)，斑禿。解表散寒，祛風(fēng)勝濕，止痛。生長(zhǎng)于海拔2000-4000米的林 緣及灌叢內(nèi)，分布于中國(guó)的陜西、四川、甘肅、青海、西藏。此外，羌活還常與防風(fēng)、白芷和細(xì) 辛等中藥組成復(fù)方使用。但是，目前并未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道羌活具有防止腎損傷的功效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種羌活提取物及其制備方法和應(yīng)用，使得所 述羌活提取物具有防止腎損傷、保護(hù)腎損傷細(xì)胞的功效，能夠應(yīng)用于腎損傷保護(hù)藥物的制 備中。
[0005] 同時(shí)，本發(fā)明的另一個(gè)發(fā)明目的是提供羌活在制備腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用。
[0006] 其中，本發(fā)明所述羌活提取物的制備方法，包括：
[0007] 步驟1、粉碎羌活根莖，加入乙醇溶液提取，提取液過(guò)濾、濃縮后加鹽酸調(diào)節(jié)pH為 2,加熱回流并濃縮蒸干獲得粗提物；
[0008] 步驟2、粗提物加入乙醇溶液復(fù)溶，通過(guò)大孔樹(shù)脂柱吸附，依次水洗脫、由低到高的 梯度濃度乙醇溶液洗脫，收集60 %乙醇洗脫液，除去溶劑，濃縮至浸膏，然后加入乙酸乙酯 溶解、過(guò)濾，濾液除去溶劑，濃縮、干燥，獲得所述羌活提取物。
[0009] 其中，作為優(yōu)選，步驟1所述羌活根莖與乙醇溶液的體積質(zhì)量比為lg:6-10mL。
[0010] 作為優(yōu)選，步驟1所述乙醇溶液的體積百分濃度為70%。
[0011] 作為優(yōu)選，步驟2所述粗提物加入乙醇溶液復(fù)溶為粗提物加入羌活根莖總重1倍 量的40%乙醇溶液溶解。
[0012] 作為優(yōu)選，所述大孔樹(shù)脂柱為D-101型大孔樹(shù)脂柱。
[0013] 作為優(yōu)選，所述大孔樹(shù)脂柱重量為為羌活根莖總重的2倍。
[0014] 作為優(yōu)選，所述依次水洗脫、由低到高的梯度濃度乙醇溶液洗脫具體為：
[0015] 依次水洗脫4個(gè)柱體積，40 %乙醇洗脫3個(gè)柱體積，60 %乙醇洗脫6個(gè)柱體積。
[0016] 根據(jù)上述制備方法，本發(fā)明提供由本發(fā)明所述制備方法制備的羌活提取物，其包 含凱林內(nèi)酯、紫花前胡苷元、異虎耳草素、茴香酸對(duì)羥基苯乙酯和比克白芷內(nèi)酯，總香豆素 含量大于50%。
[0017] 本發(fā)明制備的羌活提取物在對(duì)順鉑所致HK-2細(xì)胞腎損傷模型的試驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì) 正常HK-2細(xì)胞的安全性以及對(duì)腎損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。因此，本發(fā)明提供了羌活以及所述 羌活提取物在制備腎損傷保護(hù)藥物中的應(yīng)用。作為優(yōu)選，所述腎損傷為由順鉑所致腎損傷。
[0018] 由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明提供了羌活及其經(jīng)過(guò)特殊方法提取的提取物在保護(hù) 腎損傷細(xì)胞中的應(yīng)用，從而為臨床上防止腎損傷提供多一種安全有效的中藥選擇。羌活提 取物在安全劑量?jī)?nèi)能夠有效地保護(hù)腎損傷細(xì)胞，可進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為腎損傷保護(hù)藥物，具有廣 泛的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1所示為本發(fā)明羌活提取物高壓制備液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 本發(fā)明公開(kāi)了一種羌活提取物及其制備方法和應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本 文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù) 人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述產(chǎn)品和制備方法以及應(yīng) 用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi) 對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0021] 依照本發(fā)明所述羌活提取物的制備方法，其可根據(jù)優(yōu)選方案具體如下：
[0022] 將羌活根莖粉碎成粗粉，按體積/質(zhì)量加入6~10倍的70%乙醇溶液提取兩次， 每次1. 5小時(shí)，合并過(guò)濾液，濃縮至無(wú)醇味后加水至藥材重量的1倍；濃縮液加入濃鹽酸調(diào) 節(jié)pH至2,加熱回流0. 5個(gè)小時(shí)，濃縮蒸干，加入藥材重量1倍量的40%乙醇溶液使其完全 溶解。水解液通過(guò)2倍藥材重量的D-101大孔樹(shù)脂柱（徑高比為1:8)吸附后，水洗脫4個(gè) 柱體積，40 %乙醇洗脫3個(gè)柱體積，60 %乙醇洗脫6個(gè)柱體積。60 %乙醇洗脫液合并，回收溶 劑，濃縮至浸膏。浸膏加入乙酸乙酯溶液，使其溶解完全，濾過(guò)，回收溶劑，濃縮至浸膏，60°C 真空干燥，粉碎即得所述羌活提取物。
[0023] 以下就本發(fā)明所提供的一種羌活提取物及其制備方法和應(yīng)用做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0024] 實(shí)施例1 :制備本發(fā)明所述羌活提取物
[0025] 將羌活根莖粉碎成粗粉，按體積/質(zhì)量加入6~10倍的70%乙醇溶液提取兩次， 每次1. 5小時(shí)，合并過(guò)濾液，濃縮至無(wú)醇味后加水至藥材重量的1倍；濃縮液加入濃鹽酸調(diào) 節(jié)pH至2,加熱回流0. 5個(gè)小時(shí)，濃縮蒸干，加入藥材重量1倍量的40%乙醇溶液使其完全 溶解。水解液通過(guò)2倍藥材重量的D-101大孔樹(shù)脂柱（徑高比為1:8)吸附后，水洗脫4個(gè) 柱體積，40 %乙醇洗脫3個(gè)柱體積，60 %乙醇洗脫6個(gè)柱體積。60 %乙醇洗脫液合并，回收溶 劑，濃縮至浸膏。浸膏加入乙酸乙酯溶液，使其溶解完全，濾過(guò)，回收溶劑，濃縮至浸膏，60°C 真空干燥，粉碎即得所述羌活提取物。
[0026] 實(shí)施例2 :所述羌活提取物總香豆素含量檢測(cè)
[0027] 采用紫外分光光度發(fā)測(cè)定羌活提取物中總香豆素含量：精密稱(chēng)取異紫花前胡內(nèi)酯 標(biāo)品2. 52mg，置入IOOmL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配置成對(duì)照品母液。取對(duì)照品母液 I. 5mL、2. 0mL、2. 5mL、3. 0mL、3. 5mL，分別置于5個(gè)IOmL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配置 成對(duì)照品溶液。精密稱(chēng)取實(shí)施例1所得提取物6. 34mg，置入50mL容量瓶中，加甲醇稀釋至 刻度，配置成供試品母液。取供試品母液6. 5mL置于50mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配 置成供試品溶液。在200~400nm分別掃描異紫花前胡內(nèi)酯對(duì)照品母液及供試品溶液，二 者在300nm處均有一個(gè)吸收峰，且峰形變化平緩，便于定量測(cè)定，因此，將300nm作為測(cè)定波 長(zhǎng)。分別取供試品溶液和對(duì)照品溶液，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外分光光度法，在300nm波 長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算，即得羌活提取物中總香豆素含量為52. 1 %。
[0028] 實(shí)施例3 :所述羌活提取物主要成分的分離鑒定
[0029] 實(shí)施例1羌活提取物加適量甲醇溶解后，加入等量的粗硅膠（80-100目）中攪拌 均勻，烘干后倒入到含4~5倍量的硅膠（200-300目）柱中。石油醚平衡D-101柱子以 后，利用石油醚-乙酸乙酯50:1、20:1、10:1各洗脫4個(gè)柱體積，10:1部位濃縮蒸干。石油 醚-乙酸乙酯10:1洗脫部位加甲醇溶解后，離心，取上清液，利用高壓制備液相進(jìn)行制備分 離。
[0030] 高壓制備液相色譜條件：安捷倫1260型制備色譜儀，色譜柱為Fuji C18(250X50mm);流動(dòng)相為乙腈（A)-水（B);檢測(cè)波長(zhǎng)為310nm;洗脫程序?yàn)?~60min， A30%，B70%;流速為SOmL.min 1;柱溫為30°C。收集各主要色譜峰（見(jiàn)圖1)，濃縮干燥后 分別得凱林內(nèi)酯、紫花前胡苷元、異虎耳草素、茴香酸對(duì)羥基苯乙酯、比克白芷內(nèi)酯，鑒定結(jié) 果如下：
[0031] (-)-反式凱林內(nèi)酯：111匪1?(4001取，0)300)8:6.25(111，(1，了 = 9.5Hz，H-3)，7.88(lH，d，J = 9.5Hz, H-4), 7.46 (lH，d, J = 8.6Hz, H-5), 6.80 (lH，d, J = 8. 6Hz, H-6), 3. 74 (1H, d, J = 4. 3Hz, H-3r ), 4. 92 (1H d, J = 4. 3Hz, H-4r ), L 38 (3H, s, -C 氏），1.45(3氏8，-〇13)。13〇 NMR (100MHz, CD3OD) S :163. 5 (C-2), 112.7 (C-3), 146.4 (C-4), 129 .9(C-5), 113. 8(C-6), 156. 0(C-7), 115. 9(C-8), 158. 0(C-9), 112. 2 (C-10), 79. 9 (C-2r ),66. l(C-3' ),75. 0(C-4' ),23. 2 (C-5' ),25. 0(C-6')。
[0032] (+)-順式凱林內(nèi)酯：? 匪 R (400MHz, CD3OD) S :6. 24(1H, d, J = 9. 5Hz,H-3),7. 86(1H, d, J = 9. 5Hz, H-4), 7. 44 (1H, d, J = 8. 6Hz, H-5), 6. 76 (1H, d, J = 8. 6Hz, H-6)，3. 75 (1H, d, J = 4. 7Hz, H-3，），5. 07 (1H d, J = 4. 7Hz, H-4，），I. 42 (3H, s, -C 氏），1.43(3氏8，-〇13)。13〇 NMR (100MHz，CD3OD) S :163. 4 (C-2)，112.8 (C-3)，146.3 (C-4)，129 .9(C-5), 113. 7(C-6), 155. 8(C-7), 115. 8(C-8), 157. 9(C-9), 112. 7 (C-10), 80. 2 (C-2r ),62. KC-Sr ),73. I (C-4r ),21.4(C-5, ),26.9(C-6r )〇
[0033] 異虎耳草素：1H NMR (400MHz, CD3OD) S : 6. 34 (1H, d, J = 9. 8Hz, H-3), 8. 18 (1H, d, J =9. 8Hz, H-4), 8. 09 (1H, d, J = 2. 3Hz, H-2r ), 7. 40 (1H, d, J = 2. 3Hz, H-3r ), 4. 17 (3H, s, 5