一種可復(fù)性梗阻性黃疸大鼠模型的建立方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明提供了一種醫(yī)學(xué)動(dòng)物模型的建立方法，具體為一種可復(fù)性梗阻性黃疸大鼠 模型的建立方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 梗阻性黃疸（obstructivejaundice，簡稱0J)是由于肝內(nèi)外膽管完全或不完全 梗阻引起膽汁引流障礙而出現(xiàn)全身病理生理改變的一類臨床常見疾病。常見的原因有腫 瘤、結(jié)石、炎癥、狹窄等。通過手術(shù)或內(nèi)鏡方法解除梗阻、暢通引流是梗阻性黃疸最根本的治 療措施。梗阻性黃疸時(shí)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)的完整性遭到嚴(yán)重破壞，腸粘膜通透性增高。腸黏 膜通透性的改變是發(fā)生細(xì)菌移位及內(nèi)毒素血癥的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。腸粘膜屏障功能已經(jīng)成為判 斷梗阻性黃疸病人預(yù)后的重要參考指標(biāo)，腸道不但是多臟器功能障礙發(fā)生的靶器官，更是 MODS(多器官功能障礙綜合癥）的"啟動(dòng)器"。關(guān)于梗阻性黃疸與腸粘膜屏障的研究也已經(jīng) 成為臨床醫(yī)學(xué)研究的重要領(lǐng)域。
[0003] 建立動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)研究的重要手段，并且模型設(shè)計(jì)方案的優(yōu)劣直接關(guān)系到最終 實(shí)驗(yàn)結(jié)論的準(zhǔn)確性。文獻(xiàn)報(bào)道有多種建立0J模型的方法，主要分為傳統(tǒng)0J模型和可復(fù)性 梗阻性黃疸模型。傳統(tǒng)0J模型與臨床上大多0J疾病的癥狀表現(xiàn)不甚相符，而關(guān)于可復(fù)性 梗阻性黃疸模型的研究相對(duì)較少。且這些方法均不能很好地契合臨床梗阻性黃疸疾病的發(fā) 生及發(fā)展過程。
[0004] 大量研究發(fā)現(xiàn)，0J引起的腸黏膜通透性增加是促使細(xì)菌移位和內(nèi)毒素血癥的重要 因素。肝內(nèi)外膽管的阻塞主要影響腸上皮細(xì)胞和緊密連接的正常結(jié)構(gòu)和功能，繼而由于腸 腔內(nèi)膽汁量的減少導(dǎo)致腸黏膜細(xì)胞增殖下降和細(xì)胞凋亡增加也是引起腸屏障功能障礙的 重要原因，此外還伴有多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，若不及時(shí)治療易引起一系列全身 病理生理改變，嚴(yán)重者出現(xiàn)MODS。由于膽管阻塞引起的0J對(duì)機(jī)體的損害在一定程度上是可 逆的，當(dāng)解除膽管梗阻的因素后，肝臟等器官能夠恢復(fù)到接近正常的組織學(xué)結(jié)構(gòu)或原來的 生物學(xué)功能，因此在臨床上對(duì)于絕大多數(shù)膽管梗阻引起的0J的治療首選手術(shù)或內(nèi)鏡解除 梗阻暢通引流，后期由于黃疸引起的癥狀或并發(fā)癥在一定程度上也會(huì)得到相應(yīng)的緩解或治 愈。
[0005] 傳統(tǒng)的0J大鼠模型的建立都是將膽管直接結(jié)扎，以阻斷膽汁的排泄導(dǎo)致膽紅素 迅速入血，這是一種急性梗阻的黃疸模型，并在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中被廣泛使用，而在臨床上0J的 進(jìn)展基本都是呈慢性漸進(jìn)性過程，并且隨著社會(huì)的進(jìn)步和醫(yī)療水平的提高，很多黃疸患者 在發(fā)病初期即0J早期就會(huì)及時(shí)就診，采取相應(yīng)的措施進(jìn)行治療。因此經(jīng)典的膽管結(jié)扎黃疸 模型已經(jīng)不能滿足目前對(duì)0J研究的需求，也不能很好地反映臨床常見黃疸疾病的發(fā)生及 發(fā)展過程?；谶@一問題，我們設(shè)想建立一種可復(fù)性梗阻性黃疸大鼠動(dòng)物模型以更好的模 擬臨床0J疾病的病理生理演變過程。
[0006] 文獻(xiàn)報(bào)道中已有多種實(shí)現(xiàn)0J逐漸發(fā)生或梗阻再通的方法，主要分為懸吊膽管或 膽汁內(nèi)外引流，但是這些方案都存在著一些不足和問題。電凝燒灼膽管或肝門接種瘤株的 方式是一種慢性漸進(jìn)性或惡性膽管梗阻的良好模型，研究部分阻斷膽管的方法是一種膽汁 淤積的急性模型，通過給予狗膽管壁內(nèi)注射稀釋的甲醛溶液建立的是難治性黃疸的動(dòng)物模 型，這些與完全性膽管結(jié)扎模型沒有根本的區(qū)別，但是其引起的肝功能的損傷相對(duì)較輕。采 用慢性0J模型，通過在膽管內(nèi)置入經(jīng)碘仿紗布處理的規(guī)格為6-0的VICRYL可吸收線，較 好地呈現(xiàn)了某些壺腹部腫瘤壓迫膽管引起的波動(dòng)性黃疸，但不具可恢復(fù)性，雖然一段時(shí)間 后膽紅素水平表現(xiàn)為輕度降低，但是仍然與正常大鼠的膽紅素水平有較大的差距。通過膽 汁外引流的方式建立的黃疸模型，一方面在實(shí)施過程中存在膽管過細(xì)插管困難的問題，另 外這種模型與臨床患者相比，并不符合我們膽汁再通的目的，其實(shí)質(zhì)是膽汁外引流達(dá)到減 黃的作用。通過插管或膽腸吻合實(shí)現(xiàn)膽汁內(nèi)引流的手術(shù)方式存在二次手術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影 響實(shí)驗(yàn)正常進(jìn)行及動(dòng)物的術(shù)后生存率；其次在大鼠膽管結(jié)扎一段時(shí)間后，膽管擴(kuò)張明顯，膽 管壁菲薄，存在插管困難及刺破膽管壁的可能，也大大降低了模型的可操作性。通過縱行剖 開長約0. 5cm的靜脈留置針套管，將其附著于膽總管之上，然后用絲線將其結(jié)扎，再次切 斷線結(jié)達(dá)到通暢膽管引流目的建立的模型，一定程度上有效保護(hù)了膽管，但也同樣存在二 次開腹的問題。通過懸吊膽總管而建立的黃疸模型雖具有一定的可復(fù)性，但是由于受動(dòng)物 體位或活動(dòng)的影響，其懸吊膠管的緊張度不易控制。通過絲線懸吊大鼠膽總管實(shí)現(xiàn)膽管梗 阻-再通的實(shí)驗(yàn)方法也存在同樣的問題。通過可吸收線結(jié)扎膽管，3周后大鼠的肝功能及 膽紅素水平較對(duì)照組有明顯緩解，不施加任何干預(yù)即可解除梗阻，其操作方法簡便，但由于 受動(dòng)物個(gè)體差異的影響及其梗阻引起的黃疸過程過長，并發(fā)癥相應(yīng)增多。用止血鉗鉗夾膽 總管形成的兔可逆型梗阻性黃疸模型在鉗夾動(dòng)物膽管的程度不易量化，并且OJ和再通的 程度也因動(dòng)物個(gè)體差異而影響模型的穩(wěn)定性。在健康版納豬經(jīng)膽囊內(nèi)用foley導(dǎo)尿管將膽 道取石球囊由膽囊管送入膽總管，通過控制球囊的空虛間接達(dá)到膽道梗阻和再通的目的， 這種方法科學(xué)且合理，但是因?yàn)榇笫鬅o膽囊其膽管且直徑僅約〇. 3cm，無法達(dá)到上述目的， 操作性差，耗費(fèi)較高。總之，這些模型的主要問題是：（1)不符合臨床上0J發(fā)生發(fā)展的過 程；（2)術(shù)后全身并發(fā)癥多、死亡率高；（3)手術(shù)操作過程相對(duì)比較復(fù)雜、困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種可復(fù)性梗阻性黃疸大鼠模型的建立方 法，以更貼切地模擬臨床梗阻性黃疸疾病的病理和生理演變過程。
[0008] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種可復(fù)性梗阻性黃疸大鼠模型的建立方法，所述的建立 方法如下： a，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇： 選擇無特定病原體（specificpathogenfree,SPF)的纟Wistar大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，該 大鼠由山東魯抗醫(yī)療股份有限公司供應(yīng)，質(zhì)量許可證號(hào)：SCXK魯20130001，2. 5~3月齡， 體質(zhì)量280~330g;置于溫度22~26 °C、濕度40%~70%，12小時(shí)白-黑周期的安靜、 通風(fēng)環(huán)境中，分籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食及飲水，飼養(yǎng)7~14天； b，可復(fù)性梗阻性黃疸模型的建立： (1) 大鼠于手術(shù)前禁食12小時(shí)，自由飲水，稱質(zhì)量后以質(zhì)量百分比濃度為10%的水合氯 醛行腹腔注射麻醉，水合氯醛的用量為每100g大鼠體質(zhì)量用〇. 3mL; (2) 將大鼠固定在超凈工作臺(tái)上，上腹部劍突以下上腹部常規(guī)備皮，無菌條件下以稀碘 伏及酒精棉球分別消毒術(shù)區(qū)3遍； (3) 取劍突下、臍上腹部正中縱行手術(shù)切口入腹，切口長度為2~2. 5cm，自十二指 腸與膽管交匯處找到膽管，進(jìn)一步顯露肝門及門靜脈，游離膽管至肝門，在膽管遠(yuǎn)端距肝門 1. 0cm處，以規(guī)格為3-0的不可吸收聚丙烯縫線將膽管與規(guī)格為4F的經(jīng)外周靜脈置入的 中心靜脈導(dǎo)管一并三疊結(jié)結(jié)扎，力度適中，以聚丙烯縫線結(jié)扎后所形成的線圈將膽管正好 閉合為度； (4) 用復(fù)爾凱空腸造口包內(nèi)的穿刺套管針，自切口下緣經(jīng)腹部皮下隧道至左下腹部穿 出，拔出針芯，用經(jīng)外周靜脈置入的中心靜脈導(dǎo)管近小腸端導(dǎo)入上述套管針，該套管針自切 口下部引出潛行至左下腹部，以規(guī)格為2-0的慕絲線將經(jīng)外周靜脈置入的中心靜脈導(dǎo)管 末端固定在皮下，關(guān)閉切口完成包埋，經(jīng)外周靜脈置入的中心靜脈導(dǎo)管的肝門端游離于腹 腔； (5) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)中腹腔注射5萬單位青霉素預(yù)防感染，依次雙層關(guān)腹，術(shù)后5小時(shí)進(jìn) 水，20小時(shí)進(jìn)食，術(shù)后置于溫度22~26 °C、濕度40%~70%，12小時(shí)白-黑周期的安靜、通 風(fēng)環(huán)境中，分籠喂養(yǎng)； (6) 大鼠術(shù)后第5天，首先以碘伏、酒精消毒左下腹部皮膚，自左下腹部切口打開皮下， 拆除固定經(jīng)外周靜脈置入的中心靜脈導(dǎo)管末端的縫線，以血管鉗夾住導(dǎo)管末端輕輕向外拔 出經(jīng)外周靜脈置入的中心靜脈導(dǎo)管，完成膽管再通，以無菌敷貼覆蓋拔管切口，牢固固定， 完成可復(fù)性梗阻性黃疸大鼠模型的建立。
[0009] 上述可復(fù)性梗阻性黃疸大鼠模型的建立方法，先用一支撐物與大鼠膽管并行并結(jié) 扎膽管和支撐物，數(shù)天后拔出支撐物，解除對(duì)膽管的壓迫使其恢復(fù)正常，重新形成通暢的膽 汁引流。其優(yōu)點(diǎn)是，制作的可復(fù)性黃疸模型與傳統(tǒng)的0J模型相比，更加貼近0J的臨床發(fā)展 過程和治療過程，更加符合0J研究的需要。模型制作簡便，解除黃疸不需二次開腹手術(shù)，創(chuàng) 傷小，成功率高、死亡率低，是一種穩(wěn)定可靠的可復(fù)性梗阻性黃疸大鼠模型。該模型的建立 為研究0J對(duì)腸黏膜損害相關(guān)問題提供了一種新的途徑和手段。
【附圖說明】
[0010] 圖1是大鼠術(shù)前麻醉、備皮及消毒的示意圖。
[0011] 圖2是大鼠皮下隧道建立的示意圖。
[0012] 圖3是大鼠膽管及經(jīng)外周靜脈置入的中心靜脈導(dǎo)管，用不可吸收聚丙烯縫線三疊 結(jié)結(jié)扎的示意圖。
[0013] 圖4是拔出經(jīng)外周靜脈置入的中心靜脈導(dǎo)管，完成膽管再通的示意圖。
[0014] 圖5是用慕絲線結(jié)扎膽管的示意圖。
[0015] 圖6是雙層關(guān)腹的不意圖。
[0016]圖7是可復(fù)性梗阻性黃疸大鼠模型建立模式的第一個(gè)示意圖。
[0017] 圖8是可復(fù)性梗阻性黃疸大鼠模型建立模式的第二個(gè)示意圖。
[0018] 圖9是R0J組術(shù)后第5天的黃疸情況示意圖。
[0019] 圖10是R0J組術(shù)后第8天的黃疸情況示意圖。
[0020] 圖11是R0J組術(shù)后第5天膽管擴(kuò)張情況示意圖。
[0021] 圖12是R0J組術(shù)后第8天膽管擴(kuò)張情況示意圖。
[0022] 圖13是R0J組和0J組大鼠總膽紅素水平變化示意圖。
[0023] 圖14是R0J組和0J組大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶與堿性磷酸酶水平變化示意圖。
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