用于藥物遞送的組合物和方法
【專利說明】用于藥物遞送的組合物和方法
[0001] 本發(fā)明涉及適用于遞送分子至哺乳動物的組合物和方法。本發(fā)明具體地涉及肽衍 生物（肽和偽肽）、其二聚體或多聚體以及它們作為感興趣分子的載體的用途。本發(fā)明還 涉及綴合物，其含有連接至感興趣分子的本發(fā)明的肽衍生物或其二聚體或多聚體。本發(fā)明 的肽具體地可通常以前藥綴合物的形式用于經(jīng)特異性受體（受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運，RMT)將感興 趣的藥物或診斷分子例如治療分子、成像或診斷劑或分子探針負載穿過健康或病理（癌細 胞）的不同組織或器官（例如肝、腎上腺和腸）的細胞膜，且具體地使其穿過神經(jīng)系統(tǒng)的生 理屏障例如血腦屏障（BBB)、血-脊髓屏障（BSCB)或血-視網(wǎng)膜屏障（BRB)。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 根據(jù)頂SHealth，在2007年，治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS，腦和脊髓）病癥的藥物的 全球市場大約700億美元，該總額中有近90億美元代表的是由藥物遞送技術(shù)研發(fā)的產(chǎn)品 (Jain，2008,JainPharmaBiotechReport，DrugDeliveryinCNSdisorders)。因此，神 經(jīng)病學(xué)連同心血管醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué)是當下三大治療領(lǐng)域。盡管全世界患CNS障礙和病癥的 人數(shù)高于患心血管疾病或癌癥的人數(shù)，神經(jīng)病學(xué)仍然是有待開發(fā)的市場。其由以下事實進 行部分解釋：98 %的治療CNS病癥的潛在藥物并未穿過血腦屏障或BBB(Pardridge，2003， Mol.Interv.，3, 90-105)。目前市場上僅有5%的藥物針對神經(jīng)系統(tǒng)。
[0004] 事實上，CNS是由于兩個主要的生理屏障系統(tǒng)（BBB/BSCB和血-腦脊液屏障 (BCSFB))的存在而免受潛在的有毒物質(zhì)的侵害。所述BBB被認為是在腦水平攝取等離子體 配體的主要途徑。其表面積約是BCSFB表面積的5000倍。BBB的結(jié)構(gòu)性血管（constitutive bloodvessel)的總長大約600km。大腦皮層每立方厘米所含的相當于lkm血管所含。BBB 的總表面積估計有 20m2(DeBoer等人，2007,Clin.Pharmacokinet.，46 (7)，553-576)。BBB 和BSCB被視為在研發(fā)治療CNS病癥和損傷的新型療法中需要克服的主要障礙（Neuwelt等 人，2008,LancetNeurol.，7,84-96) 〇
[0005] 類似地，在眼中，血-視網(wǎng)膜屏障（BRB)是血眼屏障的一部分，所述血眼屏障是 由緊密結(jié)合在一起的細胞所組成并抵御一些物質(zhì)進入視網(wǎng)膜。所述BRB有兩種成分：視 網(wǎng)膜血管內(nèi)皮和視網(wǎng)膜色素上皮，其還被稱為內(nèi)部和外部組分（內(nèi)部BRB[iBRB]和外部 BRB[oBRB])。與腦血管類似的視網(wǎng)膜血管維持內(nèi)部血眼屏障。正如BBB或BSCB，這種生理 屏障包括緊密連接（TJ)的單層無孔內(nèi)皮細胞。視網(wǎng)膜上皮細胞間的這些連接阻止大分子 從脈絡(luò)膜毛細血管穿過進入該視網(wǎng)膜。
[0006] 在2007年，全球總的眼用藥物制品方面估值約115. 2億美元（Visiongain， Ophthalmics. 2007,Visiongain,Inc. :SanFrancisco.JanoriaKG,等人。Novel approachestoretinaldrugdelivery.ExpertOpinDrugDeliv〇2007 ;4(4):371-388)〇 視網(wǎng)膜疾病包括色素性視網(wǎng)膜炎、黃斑變性、視錐-視桿細胞營養(yǎng)不良（CORD)、視網(wǎng)膜脫 離、視網(wǎng)膜剝落、高血壓性視網(wǎng)膜病變和糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜母細胞瘤、視網(wǎng)膜脂血 癥等。
[0007] 由于許多群體的年齡不斷增加，金融專家預(yù)測，短期內(nèi)該方面的年均增長將超過 10%。然而，持續(xù)給藥治療上有效濃度的藥物以治療眼疾，尤其是眼后半段疾病，仍然是顯 著的技術(shù)挑戰(zhàn)?；颊唔槕?yīng)性與現(xiàn)有療法的相應(yīng)問題也是嚴重的難題。因此，對于追求新型 分子以及創(chuàng)新的藥物遞送體系的公司而言，存在大量的市場機會。
[0008] 因此，BBB、BSCB和BRB不僅代表了在使用潛在藥物治療許多CNS和眼部疾病時的 主要障礙，還代表了在血液和神經(jīng)組織之間大面積的潛在交換。
[0009] 作為一般規(guī)律，僅有大約450至600道爾頓的少許親脂性小分子（僅2%的候選藥 物）可穿過上述生理屏障，也就是說，穿過血液進入神經(jīng)組織。許多在治療CNS疾病的體外 研究和動物研究中顯示出有希望的結(jié)果的候選藥物的分子量和大小是相當大的。因此，由 于神經(jīng)組織毛細血管內(nèi)皮細胞的低跨細胞滲透性，大多數(shù)的分子，例如治療性的肽、蛋白， 包括治療性的抗體，通常被排除在血液到CNS或眼（視網(wǎng)膜）神經(jīng)組織的通路/轉(zhuǎn)運系統(tǒng) 外。排列在血管中的腦毛細血管內(nèi)皮細胞（BCEC)被基底層、星形膠質(zhì)細胞突觸小結(jié)、周細 胞以及小神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)細胞所包圍。內(nèi)皮細胞與星形膠質(zhì)細胞突觸小結(jié)的緊密結(jié)合導(dǎo)致 了BBB對大多數(shù)分子不透過性的發(fā)展與維持，從而確保嚴格且有效地控制血液和腦之間的 分子交換以維持腦穩(wěn)態(tài)。相比于其他器官的具有孔的內(nèi)皮細胞，腦的內(nèi)皮細胞是通過TJ而 緊密結(jié)合的。因此這些TJ防止穿過BBB的細胞旁通道。圍繞在其周圍的內(nèi)皮細胞和星形 膠質(zhì)細胞突觸小結(jié)也構(gòu)成了生理屏障，因為這些細胞具有有效的外排體系，其限制任何跨 細胞途徑的通路/轉(zhuǎn)運系統(tǒng)。事實上，多藥耐藥性（MDR)轉(zhuǎn)運蛋白將一些能夠穿過生理屏 障的分子從內(nèi)皮細胞主動排出到血液系統(tǒng)。這些主動外排轉(zhuǎn)運（AET)體系通?？刂朴缮窠?jīng) 組織到血液系統(tǒng)的小分子的主動外排。舉個例子，BBB的模型AET體系是ATP結(jié)合盒（ABC) 轉(zhuǎn)運蛋白，即P-糖蛋白（P-gp);但是，其他的AET體系也存在于BBB，例如MDR-相關(guān)蛋白 1 (MRP1)。主要位于BCEC腔表面的P-gp不僅是阻止大多數(shù)外源物進入腦的BBB生理屏障 功能的主要要素，還是候選藥物以及在CNS中能夠被活化的感興趣的其他治療分子。因此， 這些性質(zhì)強烈地限制了物質(zhì)從血漿轉(zhuǎn)運到CNS和眼神經(jīng)組織的細胞外隙。
[0010] 可以解釋為什么目前沒有可用于主要CNS或眼部病癥和損傷（腦癌、帕金森病和 阿爾茨海默病、腦血管意外（CVA)等）的真正有效的治療的原因之一是：研發(fā)治療腦部病 癥的候選藥物的人員采取的是自身研究項目（腦部藥物開發(fā)項目），而并沒有投入精力在 穿透屏障的問題，也沒有投入精力在優(yōu)先靶向神經(jīng)組織，特別是腦（腦部藥物靶向項目）， (Pardridge，2003,Mol.Interv.，3,90-105)。候選藥物必須遵循一定結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)、藥物 化學(xué)和藥理學(xué)規(guī)律以便具有最大的成為治療CNS病癥或障礙的藥物的可能性（Pajouhesh 等人，2005,Neur〇Rx，2(4)，541-553)。因此，在研發(fā)候選藥物中，分子對其靶點的選擇性與 特異性（藥理學(xué)性質(zhì)）對其治療活性（有效性）是必要的。分子的生物利用度和潛在毒性 (藥物學(xué)性質(zhì)）對其將來作為藥物是至關(guān)重要的。換句話說，任何可能成為用于治療CNS或 眼部病癥或障礙的藥物的分子必須穿過BBB/BSCB或BRB，保持其生物活性并呈現(xiàn)出合適的 藥代動力學(xué)（PK)、吸收、分布、代謝和排泄/清除（ADME)和藥效學(xué)（PD)特性，且具有低毒性 (Tox)。實際上，對于神經(jīng)系統(tǒng)治療學(xué)這一領(lǐng)域的藥學(xué)化學(xué)家而言，找出正研發(fā)的分子的親 水/親油平衡是特別困難的。
[0011] 因此，在治療CNS和眼部障礙和病癥中一個主要的問題在于以下事實：所給藥的 分子不穿過BBB/BSCB/BRB，因此無法到達它們在CNS或眼中的靶點。因此，在發(fā)現(xiàn)治療、診 斷或成像CNS或眼部障礙或病癥的分子的研究中，一個優(yōu)先考慮事項是找到提高活性物質(zhì) 穿過BBB/BSCB或BRB的有效性的方法。
[0012] 在這方面，負載分子穿過這些屏障的策略，即候選藥物研發(fā)者為了使感興趣的 治療分子到達CNS而在目前所研究并使用的，可分為兩大主要策略：藥理學(xué)方法和生理 學(xué)方法（Pardridge，2007,Pharm.Res.，24 (9) ,1733-1744;DeBoer等人，2007，（：1111. Pharmacokinet.，46 (7)，553-576;DeBoer等人，2007,Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.，47， 327-355 ;Jones等人，2007，Pharm.Res.，24 (9)，1759-1771;Vlieghe和Khrestchatisky， 2012,MedResRev.，33 (3)，457-516)。
[0013] 侵入方法
[0014] 侵入方法可通過以下實施：在腦中直接室內(nèi)注射、腦內(nèi)注射或鞘內(nèi)輸注活性物質(zhì) 或破壞BBB/BSCB(短暫的破壞這些屏障的完整性）。
[0015] 對于通過室內(nèi)注射的神經(jīng)外科方法，除了涉及神經(jīng)外科手術(shù)的花費之外，其主要 問題在于：該藥物不是直接遞送至腦實質(zhì)而是遞送至腦脊液。室內(nèi)輸注包括將導(dǎo)管置于室 (Aird，1984,Exp.Neurol.，86, 342-358)。這個高度侵入性技術(shù)無法有效地將活性物質(zhì)輸送 到神經(jīng)實質(zhì)。事實上，例如在腦中，在通過室內(nèi)輸注遞送藥物的過程中，腦脊液到腦實質(zhì)的 流量是由其對流（輸送）的異常緩慢的擴散所控制的，因為腦不具有實質(zhì)內(nèi)流量。
[0016] 同樣對于腦內(nèi)注射，腦中活性物質(zhì)的擴散從注射部位到病變部位降低得非?？臁?事實上，活性物質(zhì)的腦濃度在距離其注射部位500ym處減少了 90 %。
[0017] 鞘內(nèi)輸注包括將導(dǎo)管置于腦中。這個導(dǎo)管被連接至以預(yù)定流速遞送活性物質(zhì)的 栗。由于腦是唯一不具有淋巴系統(tǒng)的器官這一事實，而淋巴系統(tǒng)通常提供將細胞外液輸送 回大循環(huán)，因此通過鞘內(nèi)輸注將活性物質(zhì)分布于腦中是非常緩慢的。這降低了活性物質(zhì)在 病變部位的濃度。
[0018] 此外，在該神經(jīng)外科手術(shù)過程中，感染的風(fēng)險顯著，特別是在所述導(dǎo)管的存在的情 況下。在這些條件下，患者舒適性不佳。
[0019]BBB的短暫開放與BCEC的瞬間開放TJ有關(guān)。這是針對血管活性物質(zhì)，例如白細 胞三稀或緩激肽的情況下（Baba等人，1991，J.Cereb.BloodFlowMetab.，ll，638_643)。 這一策略同樣是侵入性的且需要動脈進入麻醉了的受試者/患者的頸動脈。短暫破壞BBB 的完整性遇到的主要問題，除了涉及進入頸動脈的放射性手術(shù)的花費外，所述BBB僅維持 很短時間的開放，因此限制了長期遞送藥物的可能性。此外，短暫破壞BBB會使血漿蛋白 進入腦（而這些蛋白可能對腦有毒性）且還可促使病原體的進入。因此，破壞BBB的這 種類型可能會導(dǎo)致慢性神經(jīng)病理性破壞并伴隨高風(fēng)險感染（Salahuddin等人，1988,Acta Neuropathol.，76,1-10) 〇
[0020] 負載的藥理學(xué)方法
[0021] 輸送分子的藥理學(xué)方法包括：通過將脂質(zhì)或親脂性基團加至活性物質(zhì)中所制成 的更疏水分子的跨細胞擴散（跨細胞親脂性擴散，TLD)或使用脂質(zhì)體（Zhou等人，1992， J.Control.Release，19,459-486)，以及通過正電荷載體分子的離子吸附或通過將活性分 子陽離子化進行輸送（吸附介導(dǎo)的輸送或AMT)。
[0022] 加入脂質(zhì)或親脂性基團能夠使親水性分子化學(xué)轉(zhuǎn)化成更疏水的分子，尤其是利用 前藥方法。但是，合成該化合物導(dǎo)致超出最佳輸送閾的分子穿過BBB/BSCB/BRB，尤其是對 于分子量（MW)變得大于450道爾頓的最佳限度（Pajouhesh等人，2005,NeuroRx，2(4)， 541-553)。出于相同原因，通常過大的脂質(zhì)體或甚至小囊泡（膠束等）或納米顆粒（納米 球，納米囊）對BBB/BSCB/BRB沒有足夠的特異性，并因此不太能夠有效地輸送感興趣的治 療分子（或成像或診斷試劑或任何其他分子，例如分子探針）穿過這些屏障（Levin，1980， J.Med.Chem.，23,682-684;Schackert等人，1989,SelectiveCancerTher.，5, 73-79)。此 外，這種類型的囊泡系統(tǒng)通常對大腦具有不可忽略的毒性作用。因此，脂質(zhì)化技術(shù)所面臨的 主要問題是相比于其他細胞膜，它們對特異性靶向并穿過BBB/BSCB/BRB的特異性較低、該 藥物血漿值的曲線下面積（AUC)的降低以及它們普遍僅限用于負載小分子。
[0023] 在AMT(通過共價結(jié)合或直接陽離子化藥物引入陽離子基團）中，所面臨的主要問 題是相比于其他細胞膜，特異性靶向和穿過BBB/BSCB/BRB的特異性低。事實上，AMT基于 吸附在細胞上的陽離子分子，所述細胞的細胞膜帶負電荷，這是對于絕大多數(shù)細胞而言。該 藥物AUC的血漿值的降低、其通常僅限用于負載小分子以及它們的細胞毒性均是使AMT負 載方法無效的其他因素。
[0024] 負載的生理學(xué)方法
[0025] 基于生理學(xué)方法進行負載的策略在于利用屏障的各種天然輸送機制。主動輸送分 子穿過BBB的這些機制既可以通過偶聯(lián)特定受體底物或與特定受體底物分子模擬起作用 (載體介導(dǎo)的輸送或CMT)，也可以通過與特異性靶向受體的配體偶聯(lián)或融合起作用（RMT， 受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運或受體介導(dǎo)的跨細胞作用）。
[0026] 作為一個例子，分子（例如L-D0PA(帕金森?。?、美法侖（腦癌）、a-甲 基-D0PA(動脈高血壓）和加巴噴?。òd癇））通過CMT，經(jīng)由大型中性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白1和 2(LAT1 和LAT2)進入腦（Pardridge，2003，Mol.Interv.，3,90-105)。這些分子具有與苯丙 氨酸（LAT1天然底物之一）接近的化學(xué)結(jié)構(gòu)。但是，CMT方法面臨的主要問題是它們對綴 合物廣泛的選擇性/特異性，所述綴合物近似地模仿/模擬內(nèi)源性受體/轉(zhuǎn)運蛋白的底物， 并因此它們的用途仍然僅限于負載小分子。
[0027]RMT需要受體依賴的輸送系統(tǒng)。負載是經(jīng)由胞吞作用機制，通過靶向存在于靶組 織（包括腦毛細血管）中的內(nèi)源性受體實現(xiàn)的。各種會參與RMT的人BBB受體的著名實 例包括：轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR)，其輸送結(jié)合鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf);胰島素受體（IR)或胰島素 樣生長因子受體（IGFR);能夠輸送包含在低密度、高密度和極低密度脂蛋白（分別是LDL、 HDL和VLDL)中膽固醇的受體，包括低密度脂蛋白（LDL)受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋 白（LRP)家族成員；白喉毒素受體（DTR)或肝素結(jié)合性表皮生長因子（HB-EGF);以及清道 夫受體（SCAV-Rs)，包括B族I型清道夫受體（SR-BI)。在RMT中，器官中特定細胞（包括 BBB內(nèi)皮細胞）細胞膜上的受體結(jié)合它們的配體，其導(dǎo)致由在細胞表面形成的囊泡中受體 及其配體所組成的綴合物的胞吞作用，然后穿透靶細胞。這個RMT過程并不依賴于胞吞作 用所吞食的分子大小。對于BBB/BSCB/BRB，所述配體/受體綴合物或離解配體可穿過內(nèi) 皮細胞（跨細胞作用），并因此能夠穿過這些生理屏障，從而作用于神經(jīng)組織。因此，許多 分子或分子綴合物的RMT是一種將其輸送至特定細胞類型或器官，尤其是從血液到CNS或 眼的機制。這些分子或分子綴合物的受體可用于輸送這些經(jīng)修飾而攜帶藥物的受體的天 然配體和/或納米顆粒。例如，將納米顆粒用聚山梨酯，尤其是聚山梨酯80涂布會導(dǎo)致載 脂蛋白E從血漿中吸收至該納米顆粒的表面，隨后該納米顆粒模仿低密度脂蛋白（LDL)顆 粒且可與LDLR相互作用，從而導(dǎo)致其被內(nèi)皮細胞所攝?。↘reuter，2012，AdvDrugDeliv Rev.pii:SO169-409X(12) 00275-X)。LDL受體靶向的包裹有脂質(zhì)體的多柔比星提高了跨 越BBB細胞的體外藥物遞送（Pinz6n_Daza等人，2012，BrJPharmacol。doi:10. 1111/j. 1476-5381. 2012. 02103.x)。Tf是存在于BBB上的TfR的天然配體。已將活性物質(zhì)偶聯(lián) / 綴合至Tf，從而通過Tfr來主動穿透BBB(Jefferies等人，1984,Nature，312,162-163 ; Friden等人，1983，Science，259, 373-377 ;Friden，1994,Neurosurgery，35, 294-298)。盡 管使用蛋白型大分子的這個負載策略能夠提高感興趣的綴合分子穿透該屏障，但是該策略 有多個缺點。首先，該分子通常經(jīng)基因表達方法偶聯(lián)/綴合至載體（融合），因此將所輸送 的分子數(shù)僅限制為多肽或蛋白。第二，用于偶聯(lián)/綴合分子和載體的系統(tǒng)是非常復(fù)雜的；傳 統(tǒng)的化學(xué)或生化偶聯(lián)無法從結(jié)構(gòu)和分子角度得到明確的大分子體系。此外，綴合物和靶向 受體的內(nèi)源性配體之間的潛在競爭可導(dǎo)致RMT生理過程的抑制，或?qū)е履X正常運轉(zhuǎn)所需的 內(nèi)源性配體的濃度降低。最后，RMT受體還可參與大腦的細胞信號傳導(dǎo)過程且所述綴合物 可能會干擾這些過程。
[0028] 經(jīng)特異性受體的RMT還可用于靶向藥物至其他組織/器官而非BBB和腦。已顯 示，例如視網(wǎng)膜對膽固醇的攝取主要經(jīng)LDLR介導(dǎo)的過程發(fā)生（Tserentsoodol等人，2006， MolecularVision2006;12:1306-18)。
[0029] 器官的血管系統(tǒng)、具體器官的實質(zhì)或患病組織可表達高水平的給定受體，該受 體可用于藥物革巴向（reviewedinChung和Wasan，2004，AdvDrugDelivRev. 2004May 7;56(9):1315-34)。例如LDLR在肝（尤其是在肝細胞竇狀隙側(cè)）以及在其他組織，例 如腎上腺和腸中高水平表達（Beisiegel等人，1981，JBiolChem. 25;256(8):4071-8; Huettinger等人，1984,JClinInvest. ;74(3): 1017-26;Fong等人，1989,JClinInvest; 84(3) : 847-56) 〇
[0030] 最終，有足夠的證據(jù)顯示了在各種類型的癌癥中LDLR增加的表達并顯示了經(jīng)由 這些癌細胞（包括膠質(zhì)母細胞瘤）的LDLR進行的LDL-或納米顆粒介導(dǎo)的抗癌藥物的遞 送（Varshosaz等人，2〇l2，EurJMedChem;54:429_38;Kopecka等人，2〇ll;Journalof ControlledRelease; 149:196 - 205;Nikanjam等人，2007,IntJPharm. ;328(1): 86-9