個月。
[0138]應(yīng)當(dāng)注意，本發(fā)明的各方面之一的上下文中所述的實施方案和特征也適用于本發(fā)明的其它方面。
[0139]本申請中引述的所有專利和非專利文獻整體引入本文作為參考。
[0140]現(xiàn)在在如下非限制性實施例中進一步詳細描述本發(fā)明。
實施例
[0141]實施例1一一成骨細胞的膠原蛋白合成
[0142]通過如Declercq等人在2004年所述的酶消化從新生Wistar大鼠的煩蓋中分離原代成骨細胞。在所有實驗期間，將細胞在5% C02和37°C的條件下維持在含有10%熱滅活胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的α -最小必需培養(yǎng)基中。將細胞以3500個細胞/孔的密度接種在Coll-1-包被的96-孔培養(yǎng)板上或以3X 14個細胞/孔的密度接種在24-孔培養(yǎng)板上，在a -MEM中培養(yǎng)2天以達到匯合。然后使細胞暴露于不同條件:最小培養(yǎng)基(C-)、包含50 μ g/ml抗壞血酸、5mM β -磷酸甘油的最小培養(yǎng)基(C+ ;優(yōu)化培養(yǎng)基)和補充有I μ M齊墩果苷(OLP)或/和I μ M羥基酪醇(HTy)或/和10 9M I, 25 二羥基維生素D3 (I, 25 (OH) 2D3)的最小培養(yǎng)基。將OLP和HTy溶于二甲亞砜(DMSO)，將1，25 (OH) 2D3溶于乙醇。DMSO和乙醇在培養(yǎng)基中的終濃度各自為0.1 %。每2天改變培養(yǎng)基。
[0143]9天后，使用來自B1color的Sircol測定法測定細胞膠原蛋白含量。這種Sircol膠原蛋白測定法是定量結(jié)合染料方法，設(shè)計該方法是為了分析體外培養(yǎng)期間從哺乳動物組織和細胞提取的膠原蛋白。染料試劑特異性地結(jié)合哺乳動物膠原蛋白中發(fā)現(xiàn)的[Gly-X-Y]。螺旋結(jié)構(gòu)(ι-ν型)。
[0144]圖1顯示了響應(yīng)于1，25 (OH) 2D30LP和HTy組合的刺激的培養(yǎng)9天后的成骨細胞的膠原蛋白合成，通過相對于每毫克總蛋白質(zhì)而言的所產(chǎn)生的膠原蛋白的微克數(shù)測定。
[0145]I, 25 (OH) 2D3 = 10 9M I, 25 二羥基維生素 D3 ；0LP = I μΜ 齊墩果苷；HTy = I μΜ羥基酪醇；C+ =優(yōu)化培養(yǎng)基用作陽性對照。
[0146]數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM(重復(fù)3次)。統(tǒng)計學(xué):克-瓦二氏(Kruskal Wallis)檢驗，然后是曼-懷二氏(Mann Whitney) U 檢驗(雙尾)，*ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;***ρ〈0.001，對比于陰性對照(C-)。
[0147]如圖1所示，I, 25 (OH) 2D3、OLP和HTy的組合的添加在培養(yǎng)9天后顯著刺激了成骨細胞的細胞膠原蛋白合成。
[0148]實施例2—一成骨細胞的堿性磷酸酶活性
[0149]通過如Declercq等人在2004年所述的酶消化從新生Wistar大鼠的煩蓋中分離原代成骨細胞。在所有實驗期間，將細胞在5% C02和37°C的條件下維持在含有10%熱滅活胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的α -最小必需培養(yǎng)基中。將細胞以3500個細胞/孔的密度接種在Coll-1-包被的96-孔培養(yǎng)板上或以3X 14個細胞/孔的密度接種在24-孔培養(yǎng)板上，在a -MEM中培養(yǎng)2天以達到匯合。然后使細胞暴露于不同條件:最小培養(yǎng)基(C-)、包含50 μ g/ml抗壞血酸、5mM β -磷酸甘油的最小培養(yǎng)基(C+ ;優(yōu)化培養(yǎng)基)和補充有I μ M齊墩果苷(OLP)或/和I μ M羥基酪醇(HTy)或/和10 9M I, 25 二羥基維生素D3 (I, 25 (OH) 2D3)的最小培養(yǎng)基。將OLP和HTy溶于二甲亞砜(DMSO)，將1，25 (OH) 2D3溶于乙醇。DMSO和乙醇在培養(yǎng)基中的終濃度各自為0.1 %。每2天改變培養(yǎng)基。
[0150]在處置第0、5、9、12和15天時以動態(tài)方式測定堿性磷酸酶(ALP)的酶活性。用PBS將成骨細胞沖洗2次，然后在干冰上冷凍。然后通過冷凍-融化循環(huán)裂解細胞并且勻化入200 μ I IM 二乙醇胺和0.24mM氯化鎂緩沖液pH 9.8 (ALP緩沖液)中。將細胞裂解物(10 μ I)加入到200 μ I 6mg/ml磷酸對硝基苯酯(p_NPP)在ALP緩沖液中的溶液中。使用Var1Sklan Flash微量培養(yǎng)板讀板器在405nm和30°C測定吸光度，每2分30秒測定I次，持續(xù)30分鐘。ALP活性表示為微摩爾p-NPP/小時/毫克蛋白質(zhì)。根據(jù)Bradford的方法，使用Quick Start B1Rad蛋白質(zhì)測定法進行了蛋白質(zhì)測定。
[0151]圖2顯示了響應(yīng)于I，25 (OH) 2D3、OLP和HTy組合的培養(yǎng)9天后的堿性磷酸酶(ALP)活性，由微摩爾ALP/毫克蛋白質(zhì)/小時表示。
[0152]C-=最小培養(yǎng)基用作陰性對照；1，25 (OH) 2D3 = 10 9M I, 25 二羥基維生素D3 ；0LP=I μΜ齊墩果苷；HTy = I μΜ羥基酪醇；C+ =優(yōu)化培養(yǎng)基用作陽性對照。
[0153]數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM。統(tǒng)計學(xué):克-瓦二氏(Kruskal Wallis)檢驗，然后是曼-懷二氏(Mann Whitney)U 檢驗(雙尾)，*ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;***ρ〈0.001，對比于陰性對照(C-) O
[0154]圖2進一步證明:1，25 (OH) 2D3、OLP和HTy的組合的添加在培養(yǎng)9天后顯著刺激了成骨細胞的細胞膠原蛋白合成。
[0155]圖3-6顯示了在時程模型中在單獨或組合的1，25 (OH) 2D3、齊墩果苷(OLP)、羥基酪醇(Hyt)的存在下培養(yǎng)的成骨細胞的堿性磷酸酶(ALP)活性。
[0156]C-=最小培養(yǎng)基用作陰性對照；1，25 (OH) 2D3 = 10 9M I, 25 二羥基維生素D3 ；0LP=I μΜ齊墩果苷；HTy = I μΜ羥基酪醇；C+ =優(yōu)化培養(yǎng)基作為陽性對照。
[0157]數(shù)據(jù)表示為平均值土SEM。統(tǒng)計學(xué):克-瓦二氏(Kruskal Wallis)檢驗，然后是曼-懷二氏(Mann Whitney)U 檢驗(雙尾)，*ρ〈0.05 ;**ρ〈0.01 ;***ρ〈0.001，對比于陰性對照(C-) O
[0158]結(jié)論
[0159]正如可以從圖3所示的數(shù)據(jù)看出的那樣，添加維生素D3自身確實在第15天誘導(dǎo)了小的、但是具有統(tǒng)計學(xué)顯著性的AP活性增加，指示成骨細胞活性和骨形成和/或軟骨合成代謝。按照相同方式，添加HT自身或OLP自身在第15天也引起了小的增加，與維生素D3的作用相當(dāng)(參見各附圖)。
[0160]組合HT和OLP 二者確實也增加了成骨細胞活性(同樣在第15天觀察)，但是不像將維生素D與HT或OLP組合所增加的那樣多。與對照具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異的唯一的點仍然是第12天和第15天。在第5天和第9天的較早的測量與陰性對照相比沒有統(tǒng)計學(xué)差升。[0161 ] 因此，所提供的數(shù)據(jù)解釋說明了添加維生素D的兩種作用。首先，維生素D連同HT和OLP中的一種或兩種的添加增加了成骨細胞響應(yīng)。這在與例如第15天的水平的比較中觀察到。
[0162]其次，維生素D連同HT和OLP中的一種或兩種的添加早于后者引起了成骨細胞活性。結(jié)論如下:維生素D的添加導(dǎo)致了更早的響應(yīng)和更強的響應(yīng)。得出如下結(jié)論:維生素D的添加增強了 OLP和/或HT引起的骨形成和/或軟骨合成代謝響應(yīng)。
【主權(quán)項】
1.用于增強一種或多種多酚對骨形成和/或軟骨合成代謝的作用的應(yīng)用的包含維生素D的組合物。2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述多酚是齊墩果苷和羥基酪醇中的一種或多種。3.包含維生素D和一種或多種多酚的組合物，用于增強所述多酚對骨形成和/或軟骨合成代謝的刺激的應(yīng)用。4.權(quán)利要求3的用于應(yīng)用的組合物，其中所述多酚包含齊墩果苷和羥基酪醇中的一種或多種。5.權(quán)利要求3-4任一項的用于應(yīng)用的組合物，其中所述多酚包含齊墩果苷和羥基酪醇。6.權(quán)利要求5的用于應(yīng)用的組合物，其中該組合物包含800-1200IU維生素D、0.0lmg-1g齊墩果苷和0.0lmg-1g輕基酪醇。7.權(quán)利要求1-2或3-6任一項的用于應(yīng)用的組合物，其中該組合物包含一種或多種另外的生物活性分子，例如抗氧化劑、抗炎化合物、脂肪酸、益生元纖維、益生菌、葡糖胺、硫酸軟骨素、礦物質(zhì)、痕量元素和/或維生素。8.權(quán)利要求7的用于應(yīng)用的組合物，其中該組合物包含礦物質(zhì)鈣和/或鎂。9.前述權(quán)利要求任一項的用于應(yīng)用的組合物，其中所述應(yīng)用靶向于老齡化群體、特別是老年患者。10.前述權(quán)利要求任一項的用于應(yīng)用的組合物，其中所述應(yīng)用是通過增強骨形成和/或軟骨合成代謝的刺激而用于治療、緩解和/或預(yù)防與骨形成和/或軟骨合成代謝與骨吸收之間的關(guān)系失衡相關(guān)的病癥。11.前述權(quán)利要求任一項的用于應(yīng)用的組合物，其中所述應(yīng)用用于維持和/或改善運動性。12.前述權(quán)利要求任一項的用于應(yīng)用的組合物，其中所述應(yīng)用用于改善骨強度。13.前述權(quán)利要求任一項的用于應(yīng)用的組合物，其中所述病癥選自骨質(zhì)疏松癥、佩吉特病、在接近假體處觀察到的骨丟失或骨質(zhì)溶解、轉(zhuǎn)移性骨疾病、甲狀腺功能亢進、歸因于癌癥的高血鈣、多發(fā)性骨髓瘤、牙周疾病、骨關(guān)節(jié)炎、由骨折或骨折愈合造成的骨缺損。14.權(quán)利要求13的用于應(yīng)用的組合物，其中所述病癥是骨質(zhì)疏松癥。15.前述權(quán)利要求任一項的用于應(yīng)用的組合物，其中所述組合物是營養(yǎng)組合物。16.前述權(quán)利要求任一項的用于應(yīng)用的組合物，其中所述組合物每日施用至少一次，持續(xù)至少2個月、優(yōu)選至少3個月的時間期。17.藥物組合物，包含維生素D和一種或多種多酚。18.治療、緩解和/或預(yù)防與骨和/或軟骨代謝失衡相關(guān)的病癥的方法，所述方法包括給需要其的個體施用有效量的維生素D與一種或多種多酚的組合。
【專利摘要】本發(fā)明涉及組合物的用于維持骨和/或軟骨健康或者預(yù)防、緩解和/或治療骨和/或軟骨病癥的應(yīng)用。
【IPC分類】A61K31/592, A61K31/05, A61K31/593, A61P19/08, A61P19/10, A61K31/351
【公開號】CN105050591
【申請?zhí)枴緾N201480018027
【發(fā)明人】M·N·奧卡亞達, F·門布雷茲, 卡萬 E·奧佛德
【申請人】雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司
【公開日】2015年11月11日
【申請日】2014年4月2日
【公告號】CA2907869A1, WO2014161872A1