一種組織工程軟骨支架及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程技術領域，尤其是涉及一種組織工程軟骨支架及其制備方法。
【背景技術】
[0002]關節(jié)軟骨是關節(jié)功能執(zhí)行的必要成分，由骨組織及其周圍的軟骨膜構成，軟骨組織則由軟骨細胞、基質及纖維構成。軟骨在關節(jié)功能中發(fā)揮著重要的作用。然而，關節(jié)軟骨損傷是十分常見疾病，臨床上各種原因進行的關節(jié)鏡手術約80%的病人均發(fā)現有軟骨損傷，20%為較重的軟骨損傷。由于軟骨內缺乏血管組織，而且軟骨組織細胞被包裹在基質成分中，不能迀移到損傷部位修復缺損，致使關節(jié)軟骨損傷后的自愈能力很差，不能實現再生。軟骨損傷若不及時治療，容易造成關節(jié)彈響、僵硬、疼痛加重等，最終需要關節(jié)置換，嚴重影響患者生活質量。
[0003]目前，針對軟骨組織損傷治療方法由關節(jié)灌洗術、關節(jié)清理術、骨膜移植、軟骨移植和自體軟骨細胞移植等。但是該些方法存在著明顯的不足，關節(jié)清理術只能暫時緩解癥狀；微骨折受傷只能在缺損部位再生纖維軟骨，不能達到正常軟骨的力學要求；自體軟骨僅適用于軟骨缺損面積較小的損傷治療?，F有制備方法也得不到合格適用于人體的組織工程軟骨。
[0004]由此可見，常規(guī)治療關節(jié)軟骨損傷的方法和手段存在明顯的不足，治療的效果并不理想。因此，如何基于軟骨組織的結構，在體外條件下制備組織工程軟骨，應用于軟骨損傷的修復，為軟骨缺損治療提供最佳的選擇，具有較好的臨床應用價值。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種組織工程軟骨支架及其制備方法，該制備方法具有流程簡單，制備的組織工程軟骨支架合格率高，該組織工程軟骨支架具有生物相容性好，毒性低，適用范圍廣，各項性能參數均適合人體軟骨組織修復的優(yōu)點。
[0006]為解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種組織工程軟骨支架的制備方法，其包括以下步驟:
步驟A:提取II型膠原蛋白；
步驟B:利用所述II型膠原蛋白、透明質酸、硫酸軟骨素以及羥基磷灰石制備初級CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架；
步驟C:利用EDC/NHS系統(tǒng)將步驟B中的初級CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架進行交聯，再冷凍干燥得到CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架；
步驟D:對所述CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架進行消毒，得到可應用于人體的組織工程軟骨支架。
[0007]本發(fā)明的一個實施例中，所述的II型膠原蛋白從牛骨、豬骨、羊骨中提取得到或者所述II型膠原蛋白通過基因工程菌株生產得到。
[0008]本發(fā)明的一個實施例中，在所述步驟B中，所述II型膠原蛋白、所述透明質酸、所述硫酸軟骨素配制成l%_2%(m/V)的溶液；
其中，所述透明質酸溶液和所述硫酸軟骨素溶液混合后，再加入透明質酸溶液或者硫酸軟骨素溶液質量的4-14倍的II型膠原蛋白溶液得到CI1-HA-CS混合液；
所述羥基磷灰石添加量為所述II型膠原蛋白、透明質酸和硫酸軟骨素總質量的30%-80%，與所述CI1-HA-CS混合液形成均一的混合溶液。
[0009]本發(fā)明的一個實施例中，所述均一的混合溶液轉移至24孔板中，冷凍干燥得到初級CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架。
[0010]本發(fā)明的一個實施例中，所述初級CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架浸泡在含乙醇、MES、NHS、EDC的混合溶液中，在培養(yǎng)箱中20 °C -25 °C條件下交聯24-36小時得到CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架。
[0011]本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟D中，所述CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架通過紫外線、Co6°滅菌或環(huán)氧乙烷滅菌進行消毒。
[0012]本發(fā)明的一個實施例中，所述步驟B中，通過3D打印機得到初級CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架。
[0013]本發(fā)明還提供一種應用上述方法制備的組織工程軟骨支架，該組織工程軟骨支架吸水率為300-600%，孔隙率為90%以上，孔徑為50-300 μ m，抗壓強度為大于8kPa。
[0014]本發(fā)明的一個實施例中，所述組織工程軟骨支架3周的降解率為15%_35%。
[0015]本發(fā)明的一個實施例中，所述組織工程軟骨支架經過小鼠成軟骨細胞ATDC-5培養(yǎng)，可使得成軟骨細胞ATDC-5生長良好。
[0016]本發(fā)明的有益效果為:
本發(fā)明的組織工程軟骨支架制備方法應用機體中存在的天然物質的復合材料，制備的組織工程軟骨支架具有生物相容性好、毒性低、易降解、降解產物無毒等優(yōu)點，本發(fā)明制得的組織工程軟骨支架外觀形態(tài)致密，各項性能參數適于人體軟骨組織的修復；本發(fā)明構建組織軟骨支架的材料來源廣泛、容易塑形、可用于大面積創(chuàng)傷修復。本發(fā)明可根據3D打印技術構建出不同的形狀，針對不同部位的缺損大小及形狀量體裁衣，方便應用，可在室溫下長期保存。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發(fā)明的組織工程軟骨支架一實施例的結構示意圖；
圖2為本發(fā)明的組織工程軟骨支架1000倍的電鏡圖；
圖3為本發(fā)明的組織工程軟骨支架3500倍的電鏡圖；
圖4為本發(fā)明的組織工程軟骨支架上培養(yǎng)2天的軟骨細胞ATDC-5熒光染色圖；
圖5為本發(fā)明的組織工程軟骨支架上培養(yǎng)4天的軟骨細胞ATDC-5熒光染色圖；
圖6為本發(fā)明的組織工程軟骨支架上培養(yǎng)7天的軟骨細胞ATDC-5熒光染色圖；
圖7為本發(fā)明的組織工程軟骨支架上培養(yǎng)12天的軟骨細胞ATDC-5熒光染色圖。
【具體實施方式】
[0018]以下通過具體的實施例進一步說明本發(fā)明的技術方案。
[0019]實施例1
本發(fā)明組織工程軟骨支架制備方法，包括以下步驟:
步驟一:11型膠原蛋白的提取。
[0020]首先，選擇新鮮的牛軟骨，用三氯甲烷、甲醇除去骨膜，并將該新鮮牛軟骨粉碎。接著，用含4mol/L鹽酸胍溶液0.05mol/L Tris-HCl攪拌處理粉碎的軟骨組織、并在4°C下低溫離心，去上清。重復多次除去蛋白多糖。然后，將離心得到的沉淀物用0.1-0.5 mol/L乙酸充分洗滌后，溶解于同濃度的乙酸中，加入胃蛋白酶對沉淀物進行消化處理10-18小時，4°C保存離心，將離心得到的上清液，再進行消化處理5-8小時，合并上述得到的上清液，制備得到II型膠原蛋白溶液。最后，將上述上清液經鹽析，通過冷凍干燥機干燥得到II型膠原蛋白O
[0021]在本步驟中，II型膠原蛋白還可以通過豬軟骨、羊軟骨等動物軟骨中提取的得到，或者II型膠原蛋白通過基因工程菌株生產得到。
[0022]步驟二:制備初級CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架。
[0023]首先，將步驟一中提取的冷凍干燥得到的II型膠原蛋白溶于0.05mol/L HCl溶液中，在4°C條件下，攪拌使其溶解完全，得到終濃度為l%-2%(m/V)的II型膠原蛋白溶液。同時，用去離子水分別溶解透明質酸HA和硫酸軟骨素CS，在4°C條件下，攪拌使其完全溶解得到濃度為l%_2%(m/V)的透明質酸溶液，終濃度為l%_2%(m/V)硫酸軟骨素溶液，其中，m/V為溶質質量相對于溶液體積的百分比，例如，Ig固體溶于10ml液體，則m/V為1%。并將上述透明質酸溶液和硫酸軟骨素溶液進行混合。接著，在透明質酸溶液和硫酸軟骨素溶液的混合溶液中加入透明質酸溶液或者硫酸軟骨素溶液質量的4-14倍的II型膠原蛋白溶液，并不斷攪拌。最后，添加II型膠原蛋白，透明質酸和硫酸軟骨素總質量的30%-80%的羥基磷灰石得到混合溶液體系。將該混合溶液體系在4°C條件下繼續(xù)攪拌，得到均一的混合溶液。最后，將上述均一的混合溶液體系轉移至24孔板中，真空冷凍干燥，得到初級CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架。
[0024]本步驟中，可以利用上述均一的混合溶液通過3D打印機得到初級CI1-HA-CS-HAP三維軟骨支架，3D打印機可以根據具體的需要有針對性的進行制備組織工程軟骨支架的形狀。
[0025]本步驟中，也可通過模具根據具體的需要，制備相應的組織工程軟骨支架。
[0026]本步驟中，所述的酸溶液包括鹽酸溶液、硫酸溶液、醋酸溶液等常用的酸溶液。
[0027]步驟三:應用EDC/NHS系統(tǒng)對CI1-HA-CS-HAP三維軟骨初級支架進行交聯。首先，將CI1-HA-CS-HAP三維軟骨初級支架在乙醇、MES混合溶液中室溫條件下浸泡30 min。然后，將該三維軟骨初級支架浸泡在含乙醇、MES、NHS、EDC混合溶液中，并置于培養(yǎng)箱中20°C條件下交聯24小時。再在震蕩條件下，將該三維軟骨支架在Na2HPO4溶液中洗滌2次，每次15-30 min ;NaCl溶液中多次洗滌；三蒸水多次洗滌。最后，將處理過的三維軟骨支架在真空中冷凍干燥，得到CI1-HA-CS-HAP三維軟