矢車菊素-3-葡萄糖苷對UVB誘導HaCaT細胞損傷的防護作用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于化妝品技術領域。更具體地，涉及矢車菊素-3-葡萄糖苷對UVB誘導 HaCaT細胞損傷的防護作用。
【背景技術】
[0002] 隨著大氣臭氧層遭到嚴重破壞，紫外線（ultraviolet，UV)輻射強度照射增強，且 生活水平提高，戶外運動、日光浴機會的增多，導致人們接受過多的紫外線照射，導致光損 害性皮膚病逐漸增多。紫外線（ultraviolet，UV)照射到地面上的強度增大，引起人皮膚損 傷的紫外線主要是中波紫外線（ulrtavioletB，UVB)和長波紫外線（ulrtavioletA，UVA)， 而前者對皮膚的損傷程度約是后者的1000倍，可對皮膚造成如日曬傷的急性損傷和光老 化、皮膚癌等的慢性累積性傷害，對人類健康構成潛在威脅。
[0003]UVB誘導角質形成細胞光損傷的分子機制及防治研究，是當今國際上研究熱點之 一。長期以來，眾多的研究者在這當中做了大量的研究，其涉及的分子機制較為復雜，其中 DNA直接損傷、氧化損傷及膜表面死亡受體的活化是主要的機制。而氧化損傷機制是目前 研究較多且是較為重要的。隨著人們生活水平的提高以及老齡人口的增長，皮膚老化問題 日益引起人們的重視，因此，開發(fā)具有高活性成分的防曬產(chǎn)品、抵抗紫外線的輻射、保護皮 膚免受光損傷、預防和延緩皮膚衰老，已成為目前醫(yī)學研究的熱點。
[0004] 矢車菊素-3-葡萄糖苷（〇5^111(1;[11-3-8111(3081(16，036)是最為常見的花青素 (anthocyanidin)之一，屬于酸類化合物中的類黃酮類，分子式C21H21O11,它作為一種多功能 的抗氧化劑，具有抗炎、抗氧化和抗癌的生物活性。雖然以往的研究已表明了C3G具有強大 的抗炎、抗氧化性能，但目前關于C3G抗皮膚光損傷的研究，對于C3G對人類表皮細胞是否 具有減輕光損傷的效果及其安全性尚無相關研究和報道。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有UVB誘導角質細胞光損傷防護的不足，提供 矢車菊素-3-葡萄糖苷（C3G)的一種新應用，即在皮膚光損傷防護方面的應用。具體是C3G 可減少UVB引起HaCaT細胞的ROS生成，具有抗氧化作用，而且可以保護DNA免受損傷，抗 凋亡等等作用。
[0006] 本發(fā)明上述目的通過以下技術方案實現(xiàn)： 矢車菊素-3-葡萄糖苷在制備防曬化妝品和/或藥物方面的應用。
[0007] 矢車菊素-3-葡萄糖苷在制備曬后修復化妝品和/或藥物方面的應用。
[0008] 矢車菊素-3-葡萄糖苷在制備皮膚光損傷防護劑和/或光損傷后修復劑方面的應 用。具體地，所述光損傷是指UVB引起的光損傷。
[0009] 矢車菊素-3-葡萄糖苷在制備HaCaT細胞光損傷防護劑和/或光損傷后修復劑中 的應用。具體地，所述HaCaT細胞光損傷是指UVB誘導的HaCaT細胞損傷。
[0010] 另外，上述矢車菊素-3-葡萄糖苷在應用時的用量優(yōu)選為80~200ymol/L。
[0011] 矢車菊素-3-葡萄糖苷在制備抗氧化的化妝品和/或藥物中的應用。具體地，所 述氧化是指UVB引起的氧化損傷。更具體地，是在制備防治UVB引起的HaCaT細胞的氧化 損傷中的應用。更進一步地，具體是抑制UVB引起HaCaT細胞生成R0S。
[0012] 矢車菊素-3_匍萄糖苷在制備抗凋亡制劑方面的應用。
[0013] 本發(fā)明分別采用四甲基偶氮唑鹽比色實驗（MTT法)、熒光ROS探針實驗等技術檢 測UVB照射后細胞的存活率、ROS生成量，并通過蛋白質免疫印跡(Westernblot)技術初 步探究C0X-2及其相關蛋白的表達水平和C3G的干預機制，探討C3G對UVB引起人體皮 膚光損傷的防護作用及安全性。同時，為了系統(tǒng)地了解C3G在人類表皮形成細胞中是否也 能抑制UVB誘導的C0X-2表達，探究在UVB損傷下角質形成細胞中ROS水平和p53的活化， 分析兩者之間與UVB誘導凋亡的關系；并以"R0S-DNA損傷一P53--線粒體凋亡通路"為 主線，探究矢車菊素-3-葡萄糖苷（C3G)對皮膚光損傷角質形成細胞的保護機制，為C3G實 際應用于防治光損傷提供重要依據(jù)，為預防及治療光損傷提供新方向。
[0014] 本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明選用體外培養(yǎng)的HaCaT細胞為代表，用UVB照射誘發(fā)其氧化損害，模仿紫外線 對表皮細胞的光損傷模型，再以C3G作為光損傷保護劑，通過評估應用C3G減輕永生化人 角質形成細胞HaCaT細胞的UVB損傷效果及相關通路，以探討C3G對皮膚光損傷(尤其是 UVB引起人體皮膚光損傷）的防護作用及其作用機制和安全性。研究結果顯示，C3G可減 少UVB引起HaCaT細胞的ROS生成，具有抗氧化作用；而且可以保護DNA免受損傷，能夠 提高UVB照射后HaCaT細胞的存活率，減少凋亡等等作用，為臨床上有效的預防和治療皮 膚光損傷，尤其是急性光損傷提供新的應用和思路，為研究天然植物抗氧化劑保護紫外線 福射損傷的作用機制奠定理論基礎。
【附圖說明】
[0015] 圖1為不同UVB劑量照射的HaCaT細胞的細胞存活率（%)。
[0016] 圖2為不同劑量UVB照射的HaCaT細胞內ROS水平。
[0017] 圖3為細胞內ROS水平與細胞生存率的關系。
[0018] 圖4為UVB照射對HaCaT細胞形態(tài)的影響。
[0019] 圖5為不同濃度的C3G對300mJ/cm2UVB照射的HaCaT細胞形態(tài)的影響。
[0020] 圖6為不同濃度C3G對UVB照射HaCaT細胞的存活率的影響。
[0021 ] 圖7為C3G作用Ih對UVB照射后HaCaT細胞的細胞活性影響。
[0022] 圖8為不同濃度C3G對300mJ/cm2UVB照射的HaCaT細胞內ROS的影響。
[0023] 圖9為Westernblot檢測不同濃度C3G對300mJ/cm2UVB照射的HaCaT細胞 C0X-2的影響。
[0024] 圖10為Westernblot檢測C3G及塞來昔布抑制UVB誘導EGFR的磷酸化。
[0025] 圖11為Westernblot檢測C3G及塞來昔布抑制UVB誘導ERK的磷酸化。
[0026] 圖12為Westernblot檢測C3G及塞來昔布抑制UVB誘導JNK的磷酸化。
[0027] 圖13為Westernblot檢測C3G及塞來昔布抑制UVB誘導p38的磷酸化。
[0028] 圖14為Westernblot檢測C3G及塞來昔布抑制UVB誘導Akt的磷酸化。
[0029] 圖15為C3G對UVB照射后HaCaT細胞凋亡的影響。
[0030] 圖16為C3G對UVB照射后HaCaT細胞凋亡的影響。
[0031] 圖17為C3G對UVB照射后HaCaT細胞A$m的影響。
[0032] 圖18為C3G對UVB照射后HaCaT細胞A也m的影響。
[0033] 圖19為westernblot分析C3G對UVB照射后HaCaT細胞DNA損傷的影響。
[0034] 圖20為westernblot分析C3G對UVB照射后HaCaT細胞p53磷酸化的影響。
[0035] 圖21為westernblot分析C3G對UVB照射后HaCaT細胞凋亡相關蛋白的影響。
【具體實施方式】
[0036] 以下結合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的方法和設備為本技術領域常規(guī)方法和設 備。除非特別說明，以下實施例所用試劑和材料均為市購。
[0037] 所用HaCaT細胞購于武漢大學保藏中心，37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0038] 主要溶液的配制(所有溶液配制用水均為超純水）： (I)C3G:取20mg的C3G粉溶于無血清的DMEM中，配制成4. 49X105yg/ml(即Immol/L)的儲備液，分裝儲存在I. 5ml的EP管中，避光保存在-20°C冰箱。使用時提前取出，根據(jù) 實驗不同濃度需要，用DMEM稀釋成相應濃度。
[0039] (2)塞來昔布：塞來昔布用DMSO溶解，分別配制成281. 37yg/ml(即lmmol/L)的 儲備液，過濾分裝后，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0040] (3)HaCaT細胞培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基）：DMEM培養(yǎng)基（高糖無血清培養(yǎng)基）+10%FBS (胎牛血清)，即比例為9 :1 ;培養(yǎng)基中加入雙抗(青霉素+鏈霉素)，使其終濃度為100mg/L; 封口膜封口，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0041] (4)磷酸鹽緩沖液（PBS):PBS=KH2PO4 0? 20g、Na2HP04.12H20 3. 56g、NaCl8. 00g、 KCl0.20g，加超純水至1000mL，調pH至7. 2-7. 4,高壓滅菌4°C保存。
[0042] (5)細胞凍存液：60%DMEM培養(yǎng)基、30%胎牛血清、10%DMS0,細胞凍存前現(xiàn)配現(xiàn) 用。
[0043] (6)MTT(5mg/mL):MTT粉末 50mg，加PBS溶解至 10mL，使MTT濃度為 5mg/mL。 0. 22ym濾器過濾滅菌，分裝避光4°C或-20°C保存。
[0044] (7 )熒光酶標儀檢測ROS試劑DCFH-DA:用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH