一種含鈣化層仿生組織工程骨軟骨一體化支架的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及工程骨軟骨一體化支架的制備方法，屬于醫(yī)用材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 由創(chuàng)傷或骨病所致關(guān)節(jié)骨軟骨缺損臨床常見，主要表現(xiàn)為頑固性疼痛、關(guān)節(jié)運動 功能受限，嚴重影響患者生活質(zhì)量，已成為目前肢體殘障的主要原因之一。美國發(fā)病率為 1.5%。~3%。，我國約為美國的5~6倍，且隨著中老年人群比例的增加呈逐年上升趨勢。
[0003] 由于軟骨沒有神經(jīng)、血管及淋巴系統(tǒng)，自身修復(fù)能力非常有限，直徑>2mm的軟骨 缺損幾乎不能完全修復(fù)，如果合并軟骨下骨缺損，治療則更為困難?，F(xiàn)有臨床治療措施均存 在明顯缺陷，其中保守治療與關(guān)節(jié)清理術(shù)只能暫時緩解疼痛，不能阻止病程的發(fā)展；自體骨 軟骨移植術(shù)人為造成供區(qū)缺損，且來源有限，難以修復(fù)面積較大的缺損；異體骨軟骨移植術(shù) 存在免疫排斥反應(yīng)及傳播疾病的可能；關(guān)節(jié)融合術(shù)改變了關(guān)節(jié)原有的解剖結(jié)構(gòu)，喪失了關(guān) 節(jié)的運動功能，患者難以接受；人工關(guān)節(jié)置換術(shù)費用昂貴、并發(fā)癥較多、翻修率較高，且經(jīng)濟 負擔(dān)較重，特別是對年輕患者的身心健康影響極大。
[0004] 國內(nèi)外對組織工程骨軟骨復(fù)合組織的構(gòu)建研宄比較深入，從"分層構(gòu)建"的可行性 初探到"一體構(gòu)建"的動物實驗研宄取得了階段性成果，然而目前尚存在缺損區(qū)修復(fù)組織質(zhì) 量缺陷、與宿主界面整合欠佳及缺乏相應(yīng)力學(xué)功能等主要問題。（1)分層構(gòu)建：即在體外分 別構(gòu)建軟骨和骨組織，在植入前將兩者用可吸收線縫合、纖維蛋白膠粘合或光聚合形成一 個整體。如Gao等將擴增培養(yǎng)的MSCs分別向成骨細胞和成軟骨細胞表型誘導(dǎo)后，與成軟 骨支架HYAFF-II和成骨支架磷酸鈣復(fù)合構(gòu)建相應(yīng)組織，再用纖維蛋白凝膠將兩者粘合；體 外實驗顯示兩者結(jié)合可見骨軟骨復(fù)合體形成，動物實驗表明軟骨下骨與宿主骨整合良好， 但軟骨整合欠佳，且無潮線和鈣化層結(jié)構(gòu)形成；（2)體外一體構(gòu)建：首先制備一體化支架材 料，然后在軟骨區(qū)域接種成軟骨性種子細胞，成骨區(qū)域根據(jù)情況接種或不接種成骨性種子 細胞；如Chen等用膠原海綿制作軟骨支架，聚丙交酯-聚乙交酯共聚物（PLGA)和膠原制 作骨支架，將狗MSCs接種于該支架，體外培養(yǎng)一周植入體內(nèi)修復(fù)狗膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損，術(shù) 后4個月組織學(xué)檢測表明，修復(fù)區(qū)域分別形成軟骨和骨，但機械性能較差。（3)體內(nèi)一體 構(gòu)建：即將體外擴增培養(yǎng)的種子細胞與可注射性生物材料混合，直接注入缺損區(qū)域產(chǎn)生修 復(fù)行為，如Hoemann等將體外擴增的軟骨細胞與殼聚糖混合后通過關(guān)節(jié)鏡注入兔體內(nèi)修 復(fù)骨軟骨缺損，術(shù)后1周植入物與周圍組織基本整合，組織學(xué)觀察有軟骨樣細胞外基質(zhì)產(chǎn) 生，但修復(fù)組織機械性能較差。
[0005] 目前醫(yī)學(xué)臨床主要采用的可降解與吸收性聚合物是：含α -羥基酸衍生物的脂肪 族聚酯，主要包括聚乙交酯（PGA)和聚丙交酯（PLA)及其共聚物三大類。在體內(nèi)，PGA被水 解成羥基乙酸，在甘油酸酯氧化酶的作用下，羥基乙酸轉(zhuǎn)變成乙醛酸；再與甘氧酸轉(zhuǎn)氧酶作 用產(chǎn)生甘氨酸；甘氧酸可參與蛋白質(zhì)或絲氨酸的合成。在被轉(zhuǎn)化成現(xiàn)丙酮酸之后，絲氨酸可 參與三羧酸循環(huán)。PLA水解后產(chǎn)生乳酸，乳酸可通過羧酸循環(huán)而被代謝成CO 2，隨后通過肺而 排出體外。這些聚合物及其共聚物可采用不同的塑料加工技術(shù)而被制備成纖維、薄膜或其 他形狀(如棒、螺釘、板、夾等)。與金屬或陶瓷相比，其最大優(yōu)點是易于加工且成本低廉。它 們已被制成手術(shù)縫合線、纖維織物、骨內(nèi)固定物、多孔復(fù)合材料、藥物緩釋載體及三維支架 材料而在醫(yī)學(xué)臨床及組織工程制備技術(shù)中廣泛應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的難題，提供了一種具有良好骨組織生物相 容性、對機體無毒性、無致畸和致突作用、可生物降解的高強度高模量吸收性關(guān)節(jié)骨軟骨的 一體化多孔支架及制備方法。
[0007] 在本技術(shù)中，我們采用可控降解速率的聚磷酸鈣CPP纖維，該纖維是采用化學(xué)成 份與人體骨礦物質(zhì)相近的偏磷酸鈣為主要原料，通過添加適量的穩(wěn)定劑Mg和阻降劑Zn，經(jīng) 粉碎、研磨和高溫熔融、拉絲，制得。聚磷酸鈣纖維在水中慢慢降解。該纖維及其制備工藝 已申請專利（申請?zhí)?1101545. 4)。經(jīng)理化與機械性能測試和生物相容性評定及其生物安全 性研宄表明，該纖維是一類具有良好骨組織生物相容性、對機體無毒性、無致畸和致突作用 的高強度高模量可生物降解吸收性醫(yī)用增強材料。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案： 一種含鈣化層仿生組織工程骨軟骨一體化支架的制備方法，將制備的透明軟骨層、鈣 化軟骨層和軟骨下骨層經(jīng)真空熱壓和顆粒濾取制成中間是密實鈣化軟骨層、兩側(cè)是多孔透 明軟骨層和軟骨下骨層一體化的復(fù)合材料支架， 其中， 以聚乳酸為基體，聚磷酸鈣短纖維為增強物，氯化鈉為致孔劑，采用溶媒澆鑄法制得 透明軟骨層和軟骨下骨層； 以聚乳酸為基體，聚磷酸鈣長纖維為增強物，采用薄膜鋪層法制得密實鈣化軟骨層(為 CPPf/PLLA 薄膜)。
[0009] 優(yōu)選的，在透明軟骨層或軟骨下骨層的制備中，聚磷酸鈣短纖維：聚乳酸的重量比 為（1~99) :(20~80)，其中孔隙率為50%-90%。
[0010] 更優(yōu)選的，在透明軟骨層或軟骨下骨層的制備中，聚磷酸鈣纖維：聚乳酸的重量比 為（20~60) : (40~80)，進一步優(yōu)選的，聚磷酸鈣短纖維：聚乳酸的重量比為（40~60): (40 ~60)〇
[0011] 優(yōu)選的，所述聚乳酸的粘均分子量為（15~50)萬，進一步優(yōu)選為（20~40)萬。
[0012] 優(yōu)選的，所述所述聚磷酸鈣短纖維及聚磷酸鈣長纖維日降解率均0. 2-4%，直徑為 5-5〇Mm ;優(yōu)選的，日降解率為0. 8-1. 5%，直徑為5-25Mm。
[0013] 優(yōu)選的，所述致孔劑NaCl的粒徑為100_800Mm，優(yōu)選200_500Mm。
[0014] 所述鈣化軟骨層為CPPf/PLLA薄膜，按以下步驟制備： 選取聚磷酸鈣纖維，并將其剪裁成10-500mm的長纖維； +f稱重； I將聚乳酸用I :50-100有機溶劑溶解； '?:將經(jīng)步驟f稱重的聚磷酸鈣長纖維手工鋪層，同時用經(jīng)步驟I溶解的聚乳酸制 膜； I'將經(jīng)步驟?處理的0??以?〇^薄膜內(nèi)的有機溶劑自然揮發(fā)24小時，即可脫模。
[0015] 所述透明軟骨層或軟骨下骨層按以下步驟制備： Γ選取聚磷酸鈣纖維，剪裁成3-5mm的短纖維； 1稱重； I選取致孔劑顆粒； 'i稱重； f將聚乳酸用I :50-100有機溶劑溶解； f將經(jīng)步驟+f稱重的聚磷酸鈣短纖維加入經(jīng)步驟+f溶解的聚乳酸中； ?再將經(jīng)步驟1.稱重的NaCl顆粒加入經(jīng)步驟:f溶解的聚乳酸中，攪拌均勻置入模具 中，成型，脫模即可得復(fù)合材料。
[0016] 所述含鈣化層仿生組織工程骨軟骨一體化支架按以下步驟制備： Γ按照透明軟骨層、鈣化軟骨層、軟骨下骨層的順序，依次將預(yù)制料放在模具中； 1'將經(jīng)步驟Γ的模具置于真空熱壓罐中； f將經(jīng)步驟1的真空熱壓罐放在熱壓機上加熱、加壓，通水冷卻使其成型，脫模； ?將經(jīng)步驟言制得的支架置于常溫下的二次蒸餾水中溶鹽，最終獲得符合實驗要求 的一體化多孔支架。
[0017] 優(yōu)選的，所述步驟f中，具體工藝參數(shù)為：溫度180-2KTC，保溫時間2-3h，壓力 5-17MPa，保壓時間 8-12min。
[0018] 本發(fā)明有益效果： 本發(fā)明一體化多孔支架以CPP纖維作為增強材料，其主要作用是：:?提高一體化多孔 支架的壓縮強度和壓縮模量，特別是對提高壓縮模量最為顯著；！由于制備CPP纖維的原 料