部脫落下來。
[0055] h)將此細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml或50ml無菌離心管中，1000 rpm離心5min。
[0056] i)利用真空泵無菌操作吸出上清培養(yǎng)基。加入5ml 37°C預(yù)熱好的完全培養(yǎng)基重 懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻。
[0057] j)用移液管輕輕吹打細(xì)胞，使其從培養(yǎng)皿底部完全脫落下來。
[0058] k)將此細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到15ml或50ml無菌離心管中，1000 rpm離心5min。
[0059] 1)利用真空泵無菌操作吸出上清培養(yǎng)基。加入5ml 37°C預(yù)熱好的完全培養(yǎng)基重 懸細(xì)胞沉淀，輕輕吹打混勻。
[0060] m)用細(xì)胞計數(shù)儀對細(xì)胞懸液進(jìn)行計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液至合適密度接板進(jìn)行細(xì)胞鋪 板實驗。
[0061] η)將SK0V-3細(xì)胞按照上述方法進(jìn)行，得到SK0V-396孔細(xì)胞培養(yǎng)板。
[0062] SK0V-3細(xì)胞，完全培養(yǎng)基為McCOY' S 5Α，為life產(chǎn)品，16600082,接板密度 (cells/well)為 12000。
[0063] 2、待測藥物L(fēng)evonorgestrel配制和加藥（200X終濃度）：
[0064] 1)待測藥物L(fēng)evonorgestrel母板配制
[0065] a)用DMSO將待測藥物L(fēng)evonorgestrel稀釋到20mM待用。
[0066] b)取a)步驟中配置好的20mM待測藥物79 μ L加入稀釋板第一行第一孔中，隨 后加入54 μ L的DMSO溶劑到第一行第二孔至第九孔中，從第一孔中取25 μ L溶液到第二 孔中，混勻后從第二孔中取25 μ L溶液到第三孔中，依次類推到第九孔，保證藥物逐次進(jìn)行 3. 16倍倍比梯度稀釋。
[0067] 2)陽性藥 Doxorubicin (MCE, Cat. No. ΗΥ-15142)母板配制
[0068] a)用DMSO將陽性藥Doxorubicin稀釋到6mM待用。
[0069] b)將6mM陽性藥Doxorubicin溶液加入稀釋板中，DMSO溶液1:3. 16倍倍比梯度 稀釋該待測藥物。
[0070] 3、藥物工作板配制及加藥
[0071] a)待測藥物及陽性藥加樣模板如下圖1所示，其中，S1208:陽性藥 Doxorubicin, DMS0:陽性對照孔，Cpd 1，2, 3:待測藥物，DMSO終濃度為0. 5% (DMS0兼容 性）。
[0072] b)向工作板中加入95 μ 1細(xì)胞特定的完全培養(yǎng)基，每個藥物對應(yīng)9個孔，用多道排 槍從待測藥物和陽性藥doxorubicin母板中分別依次轉(zhuǎn)移5 μ 1 -系列（9個孔）倍比稀釋 好的溶液（10Χ終濃度），得到含有不同濃度藥物的細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0073] c)從培養(yǎng)箱中取出步驟1制備SK0V-396孔細(xì)胞培養(yǎng)板，按圖1加藥板型排列方式 (圖1)分別向SK0V-396孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入10 μ 1上述b)制備的含有不同濃度藥物的細(xì) 胞培養(yǎng)基（10X終濃度），放入到CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)72h，得到SK0V-3的96孔藥篩板。
[0074] 以不加任何藥物的作為對照孔。
[0075] 上述待測藥物、陽性藥Doxorubicin和對照孔在96孔板中的終濃度及加藥情況如 下：
[0076] 待測藥物在圖1的2-10孔中的終濃度（μM)依次為：100、31· 64557、10. 01442、 3. 16912U. 002886,0. 317369,0. 100433,0. 031783,0. 010058 ；
[0077] 陽性藥Doxorubicin在圖1的2-10孔中的終濃度（μ Μ)依次為：30、9· 493671、 3. 004326,0. 950736,0. 300866,0. 09521U0. 03013,0. 009535,0. 003017 ；
[0078] 此外，96孔板中51208孔伍1-!11和六12-012):1(^1終濃度10(^]\10(?〇1'111^(^11 溶液（溶劑為包含〇. 5 % DMSO的完全培養(yǎng)基溶液），DMSO孔（Al-Dl，Ε12-Η12和 Al I-Hl 1) : 10 μ 1包含0· 5% DMSO的完全培養(yǎng)基溶液。
[0079] 二、CELLTITER-GL0熒光細(xì)胞活性檢測系統(tǒng)檢測
[0080] 1、CellTiter-Glo 試劑配制
[0081] a)使用前，將CellTiter-Glo試劑Buffer融化，平衡到室溫使用。
[0082] b)使用前，將CellTiter-Glo試劑凍粉底物融化，平衡到室溫使用。
[0083] c)取 IOOrnl 平衡好的 CellTiter-Glo Buffer 加入到瓶裝 CellTiter-Glo 試劑凍 粉底物中，使其充分重懸形成酶/底物混合物，也就是所謂的CellTiter-Gl0檢測試劑。
[0084] d)輕輕混勻渦旋，并反復(fù)倒置獲得均勻的溶液。一般來說，1分鐘內(nèi) CellTiter-Gl0底物試劑就會充分溶解，分裝，避光保存在-20°C備用，避免反復(fù)凍融。
[0085] 2、檢測
[0086] a)檢測前，將上述一的3得到的SK0V-3的96孔藥篩板在室溫中平衡20-30分鐘。 [0087] b)倒置顯微鏡觀察每塊培養(yǎng)板的細(xì)胞形態(tài)及死亡情況，標(biāo)記出異常情況并復(fù)測一 次。
[0088] c)向所有藥篩孔中加入100 μ 1上述1制備的CellTiter-Glo試劑，混勾。
[0089] d)在96孔微孔板振蕩器上充分震蕩混勻2分鐘，使細(xì)胞完全裂解。
[0090] e)避光室溫放置15分鐘后進(jìn)行冷光信號檢測，保證信號的穩(wěn)定性。
[0091] f)使用EnSpire多功能讀板機(jī)570nm時讀取冷光信號。
[0092] g)分析處理數(shù)據(jù)。
[0093] SK0V-3的96孔藥篩板結(jié)果如圖2所示。
[0094] 計算IC50值，結(jié)果如表1所示。
[0095] 采用同樣的方法檢測Levonorgestrel作用人肺癌非小細(xì)胞NCI-H1993和人肺腺 癌細(xì)胞NCI-H441，細(xì)胞的IC50值，結(jié)果如表1。
[0096] 可以看出，Levonorgestrel對卵巢癌細(xì)胞增殖具有特異抑制作用，可以用來作為 治療卵巢癌的藥物。
[0097] 表1為不同細(xì)胞在Levonorgestrel藥物作用下的IC50值
[0098]
[0099]
【主權(quán)項】
1. Levonorgestrel在制備治療卵巢癌產(chǎn)品中的應(yīng)用。 2. Levonorgestrel在制備抑制卵巢癌細(xì)胞增殖產(chǎn)品中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述卵巢癌細(xì)胞為SK0V-3。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應(yīng)用，其特征在于：所述產(chǎn)品為藥物或試劑盒。5. -種產(chǎn)品，其活性成分為Levonorgestrel ;所述產(chǎn)品具有如下1)和/或2)功能： 1) 治療卵巢癌； 2) 抑制卵巢癌細(xì)胞增殖。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述卵巢癌細(xì)胞為SK0V-3。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述產(chǎn)品為藥物或試劑盒。
【專利摘要】本發(fā)明公開了Levonorgestrel在制備抗卵巢癌產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了Levonorgestrel在制備治療卵巢癌產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明對FDA,CFDA已獲批準(zhǔn)的藥物L(fēng)evonorgestrel進(jìn)行腫瘤藥物重定位，根據(jù)腫瘤不同的細(xì)胞系(組織類型)以及突變位點(diǎn)對適應(yīng)癥不是抗腫瘤的藥物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)Levonorgestrel抗卵巢癌這種新用途，實現(xiàn)舊藥新用。
【IPC分類】A61P35/00, A61P15/00, A61K31/567
【公開號】CN104983736
【申請?zhí)枴緾N201510385949
【發(fā)明人】師詠勇, 宋智健
【申請人】上海交通大學(xué)
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年6月30日