合物是作為清潔衛(wèi)生用品的添加物，例如，可添 加至臉部、身體或手部清潔用品、或環(huán)境消毒液、或并入口罩、清潔紙巾、衛(wèi)生紙或棉花棒。
[0027] 實(shí)施例1 :馬尾藻多糖之制備
[0028] 將馬尾藻以流水清洗并烘干，再進(jìn)行研磨。接著配制5% (w/w)的馬尾藻水溶液進(jìn) 行熱水萃取法：首先將馬尾藻水溶液浸泡于熱水浴(約KKTC左右，浸泡約1-3小時)使藻體 軟化，再以酵素或酸水解處理，反應(yīng)完成后進(jìn)行高速離心，之后過濾并收集上清液。將該上 清液移至_80°C，再以真空凍結(jié)干燥機(jī)（LABC0NC0)進(jìn)行冷凍干燥，獲得馬尾藻多糖。
[0029] 實(shí)施例2 :硫酸化反應(yīng)
[0030] 將上述萃得到的馬尾藻多糖以硫酸根化學(xué)法處理增加硫酸根含量：于馬尾藻多糖 中添加氯橫酸 _ 二甲基甲醜胺（Chlorosulfonic acid-N, N-dimethylformamide, HC1S03/ DMF)試劑進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后以NaOH調(diào)成中性，隨后進(jìn)行高速離心，之后過濾并收集上清液。 將該上清液移至_80°C，再以真空凍結(jié)干燥機(jī)進(jìn)行冷凍干燥，即得硫酸化馬尾藻多糖。
[0031] 實(shí)施例3 :硫酸根含量分析
[0032] 使用商業(yè)上可取得的馬尾藻多糖標(biāo)準(zhǔn)品或待測的硫酸化馬尾藻多糖樣品，將其溶 于濃度IN的0. 5ml HCl中，于100°C反應(yīng)1小時后，以烘箱蒸干至無水分。加入0. 5ml的去 離子水（CldH2O)回溶后，再加入2ml無水酒精、Iml的氯化鋇緩沖液（BaCl 2buffer，其含有2M 的醋酸l〇ml、0. 05M的氯化鋇2ml、0. 02M的碳酸氫鈉8ml，并以無水酒精定量至100ml)以及 I. 5ml 玫掠酸鈉溶液（Na-rhodizonate solution，其含有 0· 25mg/ml 的 Na2C606、IOOmg 抗壞 血酸，并以無水酒精定量至100mL)混勻。進(jìn)行避光反應(yīng)20分鐘，最后測量A520并換算成 硫酸根含量。利用上述方法檢測馬尾藻多糖標(biāo)準(zhǔn)品及待測的硫酸化馬尾藻多糖樣品，其硫 酸根含量如表1所示。
[0033] 表 1
[0035] 實(shí)施例4 :多糖分子量分析
[0036] 以普魯蘭（Pul Iulan)為標(biāo)準(zhǔn)品（標(biāo)準(zhǔn)品的分子量自大至小依次為788kDa、 404kDa、212kDa、112kDa、47. 3kDa、22. 8kDa、ll. 8kDa 及 5. 9kDa)，取 20μ L 進(jìn)行 HPLC 分子量 分析。GPC分離管柱（OHpak SB-804HQ)操作條件為流速0. 8ml/min，沖提液為去離子水，并 以蒸發(fā)光散射檢測器（Evaporative Light Scattering Detector, ELSD)進(jìn)行多糖體分子 量分布分析。分析后的圖譜以EC2000GPC軟件計算出滯留時間（retention time)對多糖 分子量（Mw)的標(biāo)準(zhǔn)曲線作為馬尾藻多糖分子量分析的依據(jù)。
[0037] 圖1顯示馬尾藻多糖的HPLC圖譜結(jié)果，其中圖I (A)是馬尾藻多糖標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 圖譜，圖I (B)是硫酸化馬尾藻多糖的HPLC圖譜，經(jīng)比對標(biāo)準(zhǔn)曲線后可得馬尾藻多糖分子 量約落在約800kDa，又其中圖I (B)的滯留時間向右移，表示經(jīng)硫酸化反應(yīng)后，因硫酸根的 添加，導(dǎo)致分子量增加。
[0038] 實(shí)施例5 :細(xì)胞及病毒培養(yǎng)
[0039] 腸病毒71型的病毒株是取自一名于2001年7月間因腸病毒71型重癥死亡的兩 歲大女嬰的喉頭檢體，該病毒株為MEL701，由中興大學(xué)陳全木老師實(shí)驗(yàn)室提供。
[0040] 另一方面，將非洲綠猴腎細(xì)胞（African green monkey kidney cells ;VER0細(xì)胞， ATCC CCL-18)，培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)液中（含2%FBS，pH7. 0)，當(dāng)細(xì)胞生長約八分滿時進(jìn)行 繼代培養(yǎng)。先移除細(xì)胞培養(yǎng)液，以磷酸緩沖液（phosphate buffer saline，PBS)洗去殘留 的血清和細(xì)胞代謝物，再加入胰蛋白酶與乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)作用3至5分鐘，以胎牛血清（fetal bovine serum, FBS)中止反應(yīng)并用細(xì)胞 培養(yǎng)液沖下細(xì)胞，收集于離心管中，離心，去除上清液收集細(xì)胞沉淀，再以培養(yǎng)液回溶之后， 進(jìn)行作細(xì)胞計數(shù)。
[0041] 將MEL701病毒株接種于VERO細(xì)胞(含2%FBS RPMI-1640培養(yǎng)液）中，以倒立式顯 微鏡觀察細(xì)胞型態(tài)，當(dāng)出現(xiàn)80%以上細(xì)胞病變現(xiàn)象（cytopathic effect，CPE)時，收集含病 毒的培養(yǎng)液，儲存于_80°C冰箱，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)之用。
[0042] 實(shí)施例6 :病毒斑抑制試驗(yàn)
[0043] 將VERO細(xì)胞種于6孔培養(yǎng)皿中（I X IO5細(xì)胞/孔)，置于含5%C02的37°C培養(yǎng)箱 中，待細(xì)胞培養(yǎng)至六、七分滿，抽掉培養(yǎng)液，以PBS沖洗細(xì)胞一次。將馬尾藻多糖標(biāo)準(zhǔn)品及硫 酸化馬尾藻多糖(取硫酸根含量為67. 6%的樣品）以RPMI-1640培養(yǎng)液(不含胎牛血清）分 別稀釋成不同濃度，各自與細(xì)胞于37°C下培養(yǎng)作用1小時后，再加入病毒液（50PFU/孔)，于 37°C下感染1小時。最后加入含2%瓊脂糖膠（agarose)的RPMI-1640培養(yǎng)液，待其凝固， 置于含5%C0 2的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)四至五天后，以10%的福爾馬林固定，挖除凝膠，以1%的 結(jié)晶紫染色，以自來水沖洗后計數(shù)病毒斑數(shù)目。
[0044] 病毒斑抑制率（％)的計算方式為：（VC - VCS) /VCX 100%，其中VC是未加入馬尾 藻多糖標(biāo)準(zhǔn)品或硫酸化馬尾藻多糖的對照病毒感染組的病毒斑數(shù)；以及VCS是加入馬尾藻 多糖標(biāo)準(zhǔn)品或硫酸化馬尾藻多糖的實(shí)驗(yàn)病毒感染組的病毒斑數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn) 所獲得，以平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差（mean土SEM)顯示。
[0045] 圖2顯示病毒斑抑制試驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示，馬尾藻多糖展現(xiàn)良好的對抗腸病毒71 型感染的效果，抑制率達(dá)約30-45%，尤其馬尾藻多糖增加硫酸根含量后，抗病毒效果又再提 升約28-47%，即抑制率提升至約60-80%以上，抗病毒效果相當(dāng)優(yōu)異。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 馬尾藻多糖在制備用于治療或預(yù)防腸病毒71型感染的組合物中的用途。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中該馬尾藻多糖中，硫酸根含量達(dá)10% (w/w)以上。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中該馬尾藻多糖中，硫酸根含量達(dá)20% (w/w)以上。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中該馬尾藻多糖中，硫酸根含量達(dá)40% (w/w)以上。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中該馬尾藻多糖中，硫酸根含量達(dá)60% (w/w)以上。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其中該馬尾藻多糖中，硫酸根含量達(dá)60-70% (w/w)。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中該馬尾藻多糖是從馬尾藻萃取并經(jīng)增加硫酸根含 量的步驟處理。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中該增加硫酸根含量的步驟是以化學(xué)法添加硫酸根 而達(dá)成。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的用途，其中該組合物是增加對于腸病毒71型感 染的抑制率。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其中該組合物是作為醫(yī)藥組合物、食品添加物或清潔 衛(wèi)生用品的添加物。
【專利摘要】本發(fā)明公開了馬尾藻多糖在制備用于治療或預(yù)防腸病毒71型感染的組合物中的用途。本發(fā)明的組合物可作為醫(yī)藥組合物、食品添加物或清潔衛(wèi)生用品的添加物。
【IPC分類】A01N43/16, A61P31/14, A01P1/00, A23L1/09, A61K31/737
【公開號】CN104922146
【申請?zhí)枴緾N201410108714
【發(fā)明人】吳彰哲, 邱雅凰, 黃宗凱, 蔡佳紜
【申請人】吳彰哲
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2014年3月21日