一種具有組織誘導(dǎo)性功能的用于骨損傷修復(fù)支架的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于骨修復(fù)生物材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種載藥殼聚糖/膠原/聚己內(nèi)酯/羥基磷灰石復(fù)合結(jié)構(gòu)支架材料，特別涉及一種具有組織誘導(dǎo)性功能的用于骨損傷修復(fù)支架。
【背景技術(shù)】
[0002]每年我國骨缺損或功能障礙患者超過300萬人。骨損傷和骨缺損臨床上十分常見，目前一般采用自體骨或異體骨移植修復(fù)治療。雖然自體骨移植的修復(fù)效果優(yōu)于異體骨移植，但是自體骨移植在材料來源方面存在著嚴(yán)重的缺陷。從自體異位取骨，無異于拆了東墻補西墻，病人易患手術(shù)后并發(fā)癥，失敗率高達10?30%，嚴(yán)重制約了其在臨床的廣泛應(yīng)用；異體骨移植在材料篩選、儲存方面相當(dāng)困難，比較昂貴，并容易產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)、可能攜帶一些病原體，引起機體疾病的發(fā)生，造成機體一定的損傷等，失敗率更高。同時，異體骨被取代緩慢，新生骨體積偏小。為了克服自體骨和異體骨移植存在的種種問題，人們試圖通過天然的或合成途徑，取得理想的骨修復(fù)材料。
[0003]對于一種理想的骨修復(fù)材料首先應(yīng)該具備的特性有:1)生物相容性:可與骨直接進行化學(xué)結(jié)合，不阻止骨細胞在其表面的正?；钚曰蚋蓴_其周圍骨細胞的自然再生過程，對骨組織的分解吸收具有傳導(dǎo)性。2)機械耐受性:以小梁骨為準(zhǔn)，抗壓強度應(yīng)大于5MPa，抗壓模量在45?10MPa之間。3)生物降解性:在一定時間內(nèi)被宿主骨替代，不影響骨組織的修復(fù)，無毒副作用。4)誘導(dǎo)再生性:通過自身或添加骨誘導(dǎo)因素，刺激或誘導(dǎo)骨骼生長。簡言之，移植物的生物特性應(yīng)與自然骨相似。
[0004]近年來，對骨替代物的尋找集中于人工骨修復(fù)材料，例如金屬材料、生物陶瓷、天然高分子材料等，但這些材料在生物相容性、生物降解性、誘導(dǎo)成骨性和生物機械強度方面有著不同程度的缺陷。
[0005]鑒于傳統(tǒng)的骨組織生物材料的缺點，具有“主動修復(fù)功能”和“可調(diào)控生物響應(yīng)特性”的第三代生物活性材料成為當(dāng)前的研宄熱點和未來的發(fā)展方向。
[0006]淫羊藿為中國傳統(tǒng)藥用植物，淫羊藿苷是淫羊藿中的主要活性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研宄表明淫羊藿苷能夠抑制破骨細胞的骨吸收活性，促進成骨細胞生長、增殖，并且能夠提高成骨細胞的堿性磷酸酶的比活性。通過構(gòu)建復(fù)合淫羊藿苷微球的復(fù)合支架材料，能夠使支架材料具有組織誘導(dǎo)性功能，從而有效地促進骨損傷修復(fù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種具有組織誘導(dǎo)性功能的用于骨損傷修復(fù)的支架，構(gòu)建新型組織誘導(dǎo)性生物材料，克服現(xiàn)有骨修復(fù)材料在生物相容性、生物降解性、誘導(dǎo)成骨性和生物機械強度等方面存在的缺陷。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種具有組織誘導(dǎo)性功能的用于骨損傷修復(fù)支架，采用以下方法制得: 步驟1:按質(zhì)量比1: 5、1: 10或1: 50，分別取淫羊藿苷和殼聚糖，溶解于質(zhì)量百分比濃度為0.1%的乙酸溶液中，均勻混合，得第一混合液；
步驟2:以10?12mL/2h的速率將第一混合液滴入石蠟油中，同時以450?500r/min的轉(zhuǎn)速進行攪拌；第一混合液滴完后，再以10?12mL/2h的速率滴入質(zhì)量百分比濃度為5%的多聚磷酸鈉溶液，在滴加過程持續(xù)以相同的轉(zhuǎn)速進行攪拌，滴加完成后，再以相同的轉(zhuǎn)速攪拌至形成穩(wěn)定的第二混合液；
步驟3:靜置，棄上清液，將沉淀物離心后，依次用石油醚和異丙醇洗滌，得淫羊藿苷微球；
步驟4:將淫羊藿苷微球置于-20°C溫度下冷凍2 h，再置于_80°C溫度下冷凍24h，最后置于溫度為-40?_50°C的真空環(huán)境中，冷凍干燥10?12h，得載藥微球顆粒；
步驟5:取模具，該模具包括半圓筒形的上模具、半圓筒形的下模具、桶形的頂端固定帽和桶形的底端固定帽，頂端固定帽的底板上設(shè)有進料孔，上模具的側(cè)壁上和下模具的側(cè)壁上均并排設(shè)有兩個手柄，每個手柄上均設(shè)有輔助孔；將上模具和下模具扣合在一起，組成筒狀結(jié)構(gòu)，將頂端固定帽和底端固定帽分別安裝在該筒狀結(jié)構(gòu)的兩端，構(gòu)成具有內(nèi)腔體的模具；
按40mg膠原蛋白中加入3mg載藥微球顆粒的比例，將載藥微球顆粒加入膠原蛋白中，混合均勻，形成芯層材料，將該芯層材料通過進料孔注入該模具的內(nèi)腔體內(nèi)，當(dāng)該模具內(nèi)注滿芯層材料后，利用透明膠布封閉進料孔，置于-80°C溫度下冷凍2h，然后置于溫度為-40?_50°C的真空環(huán)境中冷凍干燥10?12 h，得芯層結(jié)構(gòu)；
步驟6:按1mL六氟異丙醇中加入0.1g輕基磷灰石、0.3g聚己內(nèi)醋和0.3g膠原蛋白的比例，將羥基磷灰石、聚己內(nèi)酯和膠原蛋白加入六氟異丙醇中混溶，得混合液，將該混合液進行電紡，得到殼層；
步驟7:將芯層材料放入殼層內(nèi)，在37°C的溫度下1%京尼平交聯(lián)lh，然后用0.0lM PBS清洗，得復(fù)合結(jié)構(gòu)；
步驟8:將復(fù)合結(jié)構(gòu)在-18?-20°C的溫度下冷凍2h，然后在溫度為-40?_50°C真空條件下冷凍干燥10?12h，得到具有組織誘導(dǎo)性功能的用于骨損傷修復(fù)支架本發(fā)明骨損傷修復(fù)支架具有如下優(yōu)點:
I)本發(fā)明構(gòu)建的復(fù)合支架材料的特制模具使樣品易于制備、取出、消毒，模具易于清理。
[0009]2)淫羊藿苷殼聚糖微球緩釋曲線實現(xiàn)了藥物良好的緩釋效果；淫羊藿苷殼聚糖微球藥物的釋放可以促進骨髓中的間充質(zhì)細胞向成骨細胞分化，增加成骨細胞的活性，促進其堿性磷酸酶的分泌，提高新生骨的生成速度。
[0010]3)支架材料的復(fù)合結(jié)構(gòu)具有一定的力學(xué)強度，在骨缺損處起到一定的支撐作用；支架材料的芯層結(jié)構(gòu)具有疏松多孔結(jié)構(gòu)，有利于細胞的長入、營養(yǎng)物質(zhì)的輸入和代謝物質(zhì)的排出。
[0011]4)復(fù)合支架材料具有良好的降解性、生物相容性和無毒副作用，符合組織工程材料的要求。
[0012]5)本發(fā)明構(gòu)建的復(fù)合支架材料的方法制備工藝簡單、尺寸可控、重復(fù)性好，易于根據(jù)需要制備具有不同尺寸的復(fù)合支架，滿足不同的需求。
【附圖說明】
[0013]圖1是本發(fā)明制得的淫羊藿苷微球的掃描電鏡圖。
[0014]圖2是圖1所示的淫羊藿苷微球的緩釋曲線圖。
[0015]圖3是本發(fā)明骨修復(fù)材料制備過程中用于制備復(fù)合支架芯層結(jié)構(gòu)的專用模具示意圖。
[0016]圖4是圖3的使用狀態(tài)圖。
[0017]圖5是本發(fā)明構(gòu)建的芯層結(jié)構(gòu)交聯(lián)前掃描電子顯微鏡結(jié)構(gòu)圖。
[0018]圖6和圖7是本發(fā)明構(gòu)建的殼層的掃描電子顯微鏡結(jié)構(gòu)圖。
[0019]圖8是圖5所示芯層結(jié)構(gòu)交聯(lián)后掃描電子顯微鏡結(jié)構(gòu)圖。
[0020]圖9是本發(fā)明構(gòu)建的骨修復(fù)材料與細胞復(fù)合培養(yǎng)的掃描電鏡圖。
[0021]圖10是本發(fā)明構(gòu)建的骨修復(fù)材料與細胞復(fù)合培養(yǎng)的細胞免疫熒光圖。
[0022]圖11和圖12是本發(fā)明的骨損傷修復(fù)支架植入動物骨缺損處3個月后的組織染色圖。
[0023]圖1和圖2中:1.進料孔，2.頂端固定帽，3.手柄，4.輔助孔，5.上模具，6.底端固定帽，7.下模具。
【具體實施方式】
[0024]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明。
[0025]本發(fā)明提供了一種骨損傷修復(fù)支架，具有較好的生物相容性、生物降解性和誘導(dǎo)成骨性，同時具有較好的生物機械強度，滿足骨損傷修復(fù)的要求。該骨損傷修復(fù)支架采用以下方法制得:
步驟1:按質(zhì)量比1: 5、1: 10或1: 50，分別取淫羊藿苷和殼聚糖，將淫羊藿苷和殼聚糖溶解于質(zhì)量百分比濃度為0.1%的乙酸溶液中，均勻混合，得第一混合液(水相)；
步驟2:將10mL石蠟油置于500mL錐形燒瓶中，該石蠟油中含有體積百分比為2%的Span-80，得到油相；將第一混合液裝入50mL滴定漏斗中，并以10?12mL/2h的速率將第一混合液滴入石錯油(油相)中，在滴加第一混合液的同時，以450?500r/min的轉(zhuǎn)速進行攪拌(該速率能使水相滴入油相后形成相對大小均一的微球)；第一混合液滴完后，再以10?12mL/2h的速率逐滴滴入質(zhì)量百分比濃度為5%的多聚磷酸鈉(TPP)，在滴加過程持續(xù)以相同的轉(zhuǎn)速進行攪拌，滴加完成后，再以相同的轉(zhuǎn)速攪拌至形成穩(wěn)定的第二混合液；
步驟3:靜置I?2h后，棄去上清液，將沉淀物以2000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30min，用石油醚洗滌3次，洗滌后，再用異丙醇洗滌3次，得淫羊藿苷微球；該淫羊藿苷微球的掃描電鏡圖，如圖1所示，圖1顯示制備的淫羊藿苷微球的形態(tài)為球形，大小基本均一。該淫羊藿苷微球的緩釋曲線，如圖2所示，從圖中可看出在緩釋的早期I?10小時，藥物的釋放迅速增加；10?72小時時藥物的釋放達到緩釋。
[0026]步驟4:將淫羊藿苷微球置于-20°C溫度下冷凍2 h，再置于_80°C溫度下冷凍24h，最后置于溫度為-40?_50°C的真空環(huán)境中，冷凍干燥10?12h，制得載藥微球顆粒，密封備用；
步驟5:取用結(jié)構(gòu)如圖3所示的專用模具，該專用模具包括半圓筒形的上模具5、半