阿司匹林在制備治療腦鐵代謝沉積藥物的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及阿司匹林的醫(yī)藥新用途。
【背景技術(shù)】
[0002]阿司匹林(acetylsalicylic acid，ASA)，化學(xué)學(xué)名鄰-乙酰水楊酸，醋柳酸等，IUPAC命名法為2-乙酰氧基苯甲酸。由德國化學(xué)家菲力克斯.霍夫曼在20世紀(jì)初正式推出。阿司匹林治療范圍極廣，包括感冒、發(fā)熱、頭痛、牙痛、關(guān)節(jié)炎痛癥、風(fēng)濕痛癥等，還能預(yù)防手術(shù)后血栓形成、心肌梗塞和中風(fēng)，故俗稱它為“萬靈藥”。
[0003]之前有研宄表明ASA增加血管內(nèi)皮細(xì)胞feritin蛋白的表達(dá)，作為一種新的抗氧化機(jī)制來發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用的。其研宄對象是用內(nèi)皮細(xì)胞作為研宄對象，研宄ASA對抗H2O2損傷的作用H202誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷經(jīng)常被用作動脈粥樣硬化、心血管疾病的模型研宄，通過脂質(zhì)過氧化，氧化應(yīng)激來造成損傷作用的。研宄范圍主要對ferritin蛋白進(jìn)行研宄，并認(rèn)為ASA通過增加ferritin蛋白的表達(dá)來發(fā)揮抗過氧化損傷的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供阿司匹林在制藥領(lǐng)域的新用途，其具有新的藥效。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0006]阿司匹林在制備預(yù)防或治療腦鐵代謝沉積藥物中的應(yīng)用。
[0007]阿司匹林在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)細(xì)胞的腦鐵代謝蛋白中的應(yīng)用。
[0008]阿司匹林在調(diào)節(jié)神經(jīng)元和/或小膠質(zhì)細(xì)胞的腦鐵代謝蛋白中的應(yīng)用。
[0009]阿司匹林在制備預(yù)防或治療腦神經(jīng)系統(tǒng)損傷藥物中的應(yīng)用。
[0010]阿司匹林在制備預(yù)防或治療腦神經(jīng)炎性損傷藥物中的應(yīng)用。
[0011]阿司匹林在改善小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥損傷中的應(yīng)用。
[0012]阿司匹林在制備治療或者預(yù)防腦鐵過載的神經(jīng)炎性疾病藥物中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明提供了阿司匹林可以影響腦鐵代謝，減少腦鐵積聚，從而減少鐵導(dǎo)致的腦神經(jīng)元損傷，使我們更深入的了解ASA的藥理作用，并為腦鐵沉積導(dǎo)致的有關(guān)神經(jīng)性疾病尋求治療方法提供理論依據(jù)。
[0014]本研宄采用BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元為研宄對象，研宄了 ASA對腦鐵代謝的影響。異常的鐵沉積以及一些腦鐵過載的神經(jīng)性疾病伴隨著膠質(zhì)細(xì)胞尤其是小膠質(zhì)細(xì)胞激活為主要特征的神經(jīng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展，過度產(chǎn)生的小膠質(zhì)細(xì)胞激活的炎癥反應(yīng)將導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷、變性甚至死亡。本研宄以LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞為模型，研宄ASA在炎癥情況下對中樞系統(tǒng)鐵代謝的影響；這與內(nèi)皮細(xì)胞是完全不同的研宄對象，所模擬的疾病類型以及ASA所起的作用和類型完全不同。
[0015]由于鐵代謝是由很多相關(guān)蛋白參與的一個過程。本研宄將ASA對腦鐵代謝蛋白的影響進(jìn)行了系統(tǒng)的研宄，在BV-2和原代神經(jīng)元上檢測了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrinreceptor，TfR)，二甲金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(DMTl)，儲鐵蛋白(Ferritin-L，F(xiàn)TL)，膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(FpN，F(xiàn)erroportin)等相關(guān)蛋白的變化情況。本研宄是直接的對ASA和腦鐵代謝關(guān)系進(jìn)行展開的，并且在不造成細(xì)胞損傷的低劑量的ASA(0.1mM)對幾種蛋白的作用效果都很顯著，對于治療和預(yù)防腦鐵過載以及神經(jīng)炎性疾病具有重要的意義。
[0016]腦內(nèi)鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)有兩種形式:Tf_Fe，即Fe3+要先綁定到Tf上被轉(zhuǎn)運(yùn)，另一種形式非Tf結(jié)合鐵(NTBI)，主要通過DMTl或者三價(jià)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(TCT)，轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞的腦鐵，一部分被細(xì)胞代謝所利用，游離的鐵將被儲存在ferritin中，其中1/3-3/4腦鐵被儲存在鐵蛋白中，F(xiàn)pN，作為目前發(fā)現(xiàn)的唯一一個鐵輸出蛋白，在腦內(nèi)廣泛表達(dá)，若腦內(nèi)鐵濃度過高，過量的鐵可以通過FpN被輸出，從而其對于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受鐵誘導(dǎo)的氧化損傷有重要的意義。
[0017]LPS刺激的BV-2細(xì)胞常被用來作為體外炎癥模型進(jìn)行研宄。根據(jù)現(xiàn)有的條件，我們首先對ASA在BV-2細(xì)胞上對鐵代謝相關(guān)蛋白的影響進(jìn)行研宄.
[0018]1.生理?xiàng)l件下，ASA下調(diào)了 TfR、DMTl+IRE蛋白的表達(dá)，上調(diào)了 FTUFpN蛋白的表達(dá)
[0019]Western blotting結(jié)果(圖4)顯示，ASA能夠降低鐵攝取蛋白TfRl和DMT+IRE的表達(dá)，增加鐵儲存蛋白FTL和鐵輸出蛋白FpN表達(dá)。這一數(shù)據(jù)說明ASA可以直接改變鐵代謝蛋白的表達(dá)，從而減少細(xì)胞內(nèi)鐵的水平。
[0020]2.炎癥情況下，ASA對鐵代謝蛋白的影響
[0021]①ASA阻止LPS導(dǎo)致的細(xì)胞活力的下降以及LPS導(dǎo)致的NO生成的增加
[0022]從MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)可以看出ASA對LPS導(dǎo)致的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。LPS刺激BV-2細(xì)胞，顯著導(dǎo)致了 NO的生成，NO在免疫和炎癥反應(yīng)上是很重要的調(diào)控器，ASA可以抑制LPS導(dǎo)致的NO的生成，并且在較高濃度抑制作用明顯。說明LPS刺激明顯增加了炎癥反應(yīng)，而ASA抑制了炎癥反應(yīng)的發(fā)生。
[0023]②ASA對LPS導(dǎo)致的鐵代謝蛋白變化的影響
[0024]本發(fā)明結(jié)果顯示ASA抑制了 LPS引起的TfR、FpN的下調(diào)以及FTL的上調(diào)。ASA可以逆轉(zhuǎn)LPS刺激引起的改變。
[0025]結(jié)論:
[0026]一.ASA在BV-2細(xì)胞上的鐵代謝蛋白的影響研宄:
[0027]1.生理情況下，0.01mM，0.1mM ASA可以降低攝鐵蛋白TfRl和DMT1+IRE的表達(dá)以及增加儲存鐵蛋白FTL和輸出鐵的蛋白FpN的表達(dá)。
[0028]2.在炎癥情況下，ASA在0.01和0.1mM濃度時(shí)可以改善LPS導(dǎo)致的BV-2細(xì)胞細(xì)胞活力的下降；
[0029]3.在較高濃度(4mM)，ASA可以明顯減少LPS誘導(dǎo)的NO的生成；
[0030]4.ASA可以抑制LPS誘導(dǎo)的TfR蛋白的降低，并且這與對TfR mRNA作用趨勢一致，ASA也可以抑制LPS導(dǎo)致的FTL表達(dá)的增加以及Fpnl表達(dá)的降低，并且作用的最適宜濃度為0.1mM,而對于LPS誘導(dǎo)的FTL、Fpnl mRNA的變化沒有影響，說明是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控；
[0031]5.在高鐵情況下，TfR和DMT1+IRE水平顯著下降，F(xiàn)TL水平顯著升高；在低鐵環(huán)境下，TfR和DMT1+IRE稍升高，F(xiàn)TL表達(dá)量很低，ASA可以促進(jìn)TfR蛋白表達(dá)降低，以及FTL蛋白表達(dá)的升高，對DMT1+IRE沒有影響；在低鐵環(huán)境下，ASA對幾種蛋白的表達(dá)基本上都沒有影響，
[0032]二.ASA在神經(jīng)元上鐵代謝蛋白的影響研宄:0.1mM ASA顯著降低了 DMTl的表達(dá)，以及升高FpN和FTL的表達(dá)，這與ASA在BV-2細(xì)胞上對兩種蛋白影響是一致的；但是對TfR蛋白表達(dá)影響不顯著。
[0033]綜上所述，本發(fā)明表明:非留體抗炎藥ASA可以影響神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鐵代謝，ASA可以用于預(yù)防或者治療腦鐵過載導(dǎo)致的神經(jīng)性疾病，如AD，PD等，從而使我們更深入的了解腦鐵過載導(dǎo)致的神經(jīng)性疾病的病因以及ASA的藥理作用，并為腦鐵過載導(dǎo)致的神經(jīng)性疾病尋求治療方法提供新的方法。
[0034]本發(fā)明可以將阿司匹林與藥學(xué)上可接受的輔料一起配制。
【附圖說明】
[0035]圖1阿司匹林對BV-2細(xì)胞活力的影響
[0036]BV-2細(xì)胞用不同濃度的ASA (0.01_4mM)，對照用0.1 %乙醇溶劑孵育24h。用MTT比色法檢測細(xì)胞活力。以對照的百分比來表示結(jié)果。
[0037]圖2阿司匹林在LPS刺激的BV-2細(xì)胞活力的影響
[0038]Bv-2細(xì)胞用溶劑(0.1%乙醇)和不同濃度的ASA (0.01，0.1，I和4mM)提前孵育30min，然后再用lyg/ml LPS共處理24h。用MTT比色法檢測細(xì)胞活力。用三組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差來表示結(jié)果。與對照組比，.*p < 0.05 ;與LPS處理組比，#p < 0.05。
[0039]圖3阿司匹林對脂多糖誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞產(chǎn)生的NO含量的影響
[0040]BV-2細(xì)胞用溶劑(0.1%乙醇)和不同濃度的ASA(0.01，0.1，1和4mM)預(yù)處理30min，然后再用I μ g/ml LPS共處理24h。用Griess反應(yīng)檢測NO的生成量。用三組獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差來表示結(jié)果。與對照組比，**.*p < 0.001 ;與LPS處理組比，###p< 0.0Olo
[0041]圖4不同濃度阿司匹林對TfR，F(xiàn)pN, FTL and DMT1+IRE蛋白表達(dá)的影響
[0042]BV-2細(xì)胞用溶劑(0.1%乙醇)和不同濃度的ASA(0.01，0.1，1，2和4mM)孵育24ho用Western blot檢測技術(shù)分析TfR，F(xiàn)pN, FTL和β-actin蛋白的表達(dá)。(A)圖代表TfR, FpN, FTL and β -actin 的 western blot 條帶；(B)圖代表 DMT+1 RE 和 β -actin 的western blot 條帶；(C)，(D)，(E)和(F)圖分別代表定量的 TfR, FpN, FTL 和 DMT+IRE ;結(jié)果用至少三組獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示；與對照組相比，*p < 0.05，林P < 0.01，***p < 0.0l0
[0043]圖5 ASA對LPS誘導(dǎo)的TfR，F(xiàn)TL, FTH, FpN蛋白變化的影響
[0044]BV-2細(xì)胞用溶劑(0.1%乙醇)和不同濃度的ASA(0.01，0.1，1和4mM)預(yù)處理30min，然后再用 I μ g/ml LPS 共處理 24h。用 Western blot 檢測技術(shù)分析 TfR(A)，F(xiàn)TL(B)，