熒光假單胞菌鐵調(diào)控蛋白的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子疫苗學(xué)領(lǐng)域，具體的說是熒光假單胞菌鐵調(diào)控蛋白的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 熒光假單胞菌是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，廣泛分布于各種環(huán)境。熒光假單胞菌是重 要的水生動(dòng)物病原菌，能夠感染水生脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物，前者包括多種養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類。 對(duì)魚類而言，熒光假單胞菌感染宿主范圍廣，既包括淡水魚類也包括海水魚類。目前對(duì)該菌 引起的疾病在國內(nèi)尚無有效防范措施。鐵是一種細(xì)菌生存所必需的營養(yǎng)成分。在許多細(xì)菌 中的研宄表明，鐵調(diào)控大量細(xì)菌蛋白的表達(dá)，這些蛋白參與各種生物功能，包括鐵獲取和運(yùn) 輸、代謝反應(yīng)以及致病過程等。在某些細(xì)菌中，位于細(xì)胞表面的鐵調(diào)控蛋白參與細(xì)菌感染過 程并具有免疫保護(hù)作用。目前熒假單胞菌鐵調(diào)控蛋白的研宄很少，其作用也不甚清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明目的在于提供熒光假單胞菌鐵調(diào)控蛋白的應(yīng)用。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0005] 一種熒光假單胞菌鐵調(diào)控蛋白的應(yīng)用，鐵調(diào)控蛋白用于制備熒光假單胞菌的免疫 疫苗。所述鐵調(diào)控蛋白為質(zhì)粒PETTfeR或pETOprF。
[0006] 進(jìn)一步的說，以熒光假單胞菌TSSl為模板，采用F1/R1或F2/R2為引物分別進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物分別與載體pET259連接，獲得質(zhì)粒pETTfeR或pETOprF，所得質(zhì)粒分別 轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)即可表達(dá)重組鐵調(diào)控蛋白。
[0007]所述引物為Fl:5' -GATATCATGAGCCCCAGCTTCAACGCCT-3' ；R1 :5'-GATATCCGATGTAG TCACCGACGCGAA-3' ；F2 :5'-GATATCATGAAACTGAAAAACACCTTGG-3' ；R2 :5'-GATATCCTGAGCGGTA GCTTCAACC-3'。
[0008] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0009] 1.顯著保護(hù)性。本發(fā)明的熒光假單胞菌鐵調(diào)控蛋白作為疫苗對(duì)熒光假單胞菌的免 疫保護(hù)效率達(dá)50%以上。
[0010] 2.本發(fā)明的疫苗無需商業(yè)化佐劑。
【附圖說明】
[0011] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的純化的鐵調(diào)控蛋白（泳道1)。泳道M，分子量標(biāo)準(zhǔn)。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而 非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如 下方法：
[0013] 1?質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化皆使用"天根生化科技（北京）有限公司"的相 應(yīng)試劑盒。
[0014] 2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌皆用Hanahan方法（Sambrookand Russell:MolecularCloning:ALaboratoryMannual.ColdSpringHarborLaboratory Press2001)；
[0015] 3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于"北京，紐英倫生物技術(shù)有限公司"。
[0016] 實(shí)施例1
[0017] 熒光假單胞菌鐵調(diào)控蛋白TfeR和OprF的表達(dá)受鐵條件調(diào)控
[0018] 熒光假單胞菌TSSl在正常LB培養(yǎng)基（對(duì)照組）或含有600uM鐵絡(luò)合物 2, 2'-dipyridyl(購于美國Sigma公司）的LB培養(yǎng)基中搖動(dòng)培養(yǎng)2h，培養(yǎng)溫度為28°C，轉(zhuǎn)速 160rpm。隨后以5000g，4°C離心10min，收集菌體。將收集的菌體進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)TfeR 或OprF基因的表達(dá)（具體方法見文獻(xiàn)：ZhangSR,ZhangL,SunL.Identificationand analysisofthreevirulence-associatedTonB-dependentoutermembranereceptors ofPseudomonasfluorescens.DisAquatOrg. 2014;110:181-91.)。結(jié)果表明，在鐵絡(luò)合 物2, 2' -dipyridyl的存在下，TfeR和OprF基因的表達(dá)量顯著（P〈0. 01)上調(diào)（即檢測(cè)到 的TfeR和OprF的mRNA量顯著增多）（分別為對(duì)照組的14倍和30倍），說明這兩個(gè)基因受 鐵條件調(diào)控。
[0019] 所述LB組成成分按重量百分比計(jì)：1.0%蛋白胨，0.5 %酵母粉，1.0%氯化 鈉，97. 5 %蒸餾水；所述菌株TSSl保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生 物中心CGMCC，保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 2329,分類命名為熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens)保藏日期為2008年1月9日，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科 學(xué)院微生物研宄所。
[0020] 實(shí)施例2
[0021] 重組熒光假單胞菌鐵調(diào)控蛋白rTfeR和rOprF的制備
[0022] 步驟l)rTfeR和rOprF的表達(dá)載體pETTfeR和pETOprF的構(gòu)建：
[0023] 焚光假單胞菌TfeR和OprF的序列已被報(bào)道（GenBankaccessionnumber. AFJ59752. 1和AFJ59305. 1)。pETTfeR的構(gòu)建如下：以熒光假單胞菌TSSl為模 板，采用引物F1/R1擴(kuò)增TfeR基因。PCR條件為：94°C60s預(yù)變性模板DNA，然后 94°C40s, 60°C60s, 72°C60s, 5 個(gè)循環(huán)，然后 94°C40s, 66°C60s, 72°C60s, 30 個(gè)循環(huán)。PCR 產(chǎn)物用天根的相應(yīng)試劑盒純化。將表達(dá)載體pET259(pET259構(gòu)建過程參見HuYH，Zheng ffff,SunL.Identificationandmolecularanalysisofaferritinsubunitfromred drum(Sciaenopsocellatus) ?FishShellfishImmunol2010 ;28:678_86)用限制性內(nèi)切 酶SwaI酶切后與上述純化的PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a， 在含卡那霉素（50ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為 pETTfeR。
[0024]pETOprF的構(gòu)建如下：以熒光假單胞菌TSSl為模板，采用引物F2/R2PCR擴(kuò)增OprF 基因。PCR條件為：94°C60s預(yù)變性模板DNA，然后94°C40s，56°C60s，72°C60s，5個(gè)循環(huán)， 然后94°C40s，62°C60s，72°C60s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用天根的相應(yīng)試劑盒純化。將表達(dá) 載體PET259用限制性內(nèi)切酶SwaI酶切后與上述純化的PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶連接，連 接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a，在含卡那霉素（50ug/ml)的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時(shí)， 篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pETOprF。
[0025] 所述引物為Fl:5' -GATATCATGAGCCCCAGCTTCAACGCCT-3' ；R1 :5'-GATATCCGATGTAG TCACCGACGCGAA-3' ；F2 :5'-GATATCATGAAACTGAAAAACACCTTGG-3' ；R2 :5'-GATATCCTGAGCGGTA GCTTCAACC-3'。
[0026] 步驟2)重組熒光假單胞菌鐵調(diào)控蛋白rTfeR和rOprF的誘導(dǎo)表達(dá)和純化：
[0027] rTfeR的誘導(dǎo)表達(dá)和純化如下：將上述步驟1)質(zhì)粒pETTfeR用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸 桿菌BL21(DE3)(購自于"天根生化科技有限公司"，北京），在含有卡那霉素（50ug/ml)的 LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，將其命名為BL21/pETTfeR。將BL21/ pETTfeR于含有卡那霉素（50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)；取Iml過夜后的培養(yǎng)液， 加入100mL新鮮的含有卡那霉素（50ug/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C下轉(zhuǎn)速200rpm搖 動(dòng)培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6,加入終濃度為ImM的IPTG，37°C繼續(xù)以轉(zhuǎn)速160rpm搖動(dòng)培養(yǎng)4 一 5h，而后以5000g，4°C離心lOmin，收集菌液，加入5ml裂解液，在室溫于搖床上緩慢搖動(dòng)1-2 小時(shí)，直至菌懸液變澄清為止。將菌液以l〇〇〇〇g，4°C離心30min，回收上清。將上清中的 蛋白用HisTrapHPColumns(購于美國GEHealthcare公司）回收純化，純化的蛋白經(jīng) SDS-PAGE電泳檢測(cè)（8v/cm電壓下電泳25 - 30min，隨后15v/cm電壓下電泳2 - 2. 5h)，測(cè) 定其分子量大小，與rTfeR吻合（參見圖1A)。
[0028] rOprF的誘導(dǎo)表達(dá)和純化如下：將上述步驟1)質(zhì)粒pETOprF用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸 桿菌BL21(DE3)(購自于"天根生化科技有限公司"，北京），在含有卡那霉素（50ug/ml)的 LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 - 24小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子，將其命名為BL21/pET0prF。隨后所有步 驟同rTfeR的誘導(dǎo)表達(dá)和純化。純化的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)（同上），測(cè)定其分子量 大小，與rOprF吻合（參見圖1B)。
[0029] 所述裂解液含IOmMNaH2P04、IOmMTris和 8M尿素，pH8. 0。
[0030] 實(shí)施例3
[0031] 重組熒光假單胞菌鐵調(diào)控蛋白rTfeR和rOprF作為疫苗的應(yīng)用
[0032] 步驟1)佐劑及疫苗混合液的制備。
[0033] 佐劑對(duì)照液的制備：將5 % (質(zhì)量比）NaOH和5 % (質(zhì)量比）Al2 (SO4) 3以2 :5體 積比混合，將混合物以10, 〇〇〇g離心5分鐘。將沉淀懸浮于PBS中至0. 2mg/ml，即為佐劑。 將PBS與佐劑等體積混合，即為佐劑對(duì)照液。
[0034] 疫苗混合液制備：將上述實(shí)施例2純化的rTfeR或OprF分別在PBS中稀釋至 200ug/ml，將稀釋后的蛋白與佐劑等體積混合，即為rTfeR疫苗混合液或rOprF疫苗混合 液。
[0035] 所述PBS組成成分按重量百分比計(jì)：0. 8 %NaCl, 0. 02 %KC1, 0. 358 % Na2HPO4. 12H20, 0? 024%NaH2PO4,余量為水。
[0036] 步驟2)疫苗的免疫應(yīng)用。將120條牙鲆（每條重約18g)隨機(jī)分為3組，每組40 條。將這3組分別命名為A，B和C組。將A組的每條魚腹腔注射IOOul上述步驟1)的 rTfeR疫苗混合液，將B組的每條魚腹腔注射IOOul上述步驟1)的rOprF疫苗混合液，將C 組的每條魚腹腔注射IOOul上述步驟1)的佐劑對(duì)照液。
[0037] 步驟3)熒光假單胞菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)熒光假單胞菌TSSl至0D_ 為1，然后離心（5000g，4°C) 10min。收集菌體，將其懸浮于PBS中至終濃度為lxl08cfu/ml。
[0038] 步驟4)疫苗免疫保護(hù)效應(yīng)檢測(cè)。在步驟2)免疫注射后的第30天，用上述步驟3) 的熒光假單胞菌懸液腹腔注射步驟2)的3組魚，每條魚的注射量為lOOul。在以后的20天 中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計(jì)各組魚的總死亡數(shù)目：A組，20條；B 組，17條；C組，40條。利用下列公式計(jì)算相對(duì)免疫保護(hù)效率（RPS):
[0039] RPS=IOOx(1 -免疫組魚的總死亡百分比/對(duì)照組魚的總死亡百分比）
[0040] 根據(jù)此公式算出rTfeR和rOprF的相對(duì)免疫保護(hù)效率分別為50%和58%。因此， 重組熒光假單胞菌鐵調(diào)控蛋白rTfeR和rOprF作為疫苗能夠有效地保護(hù)牙鲆抵御熒光假單 胞菌侵染。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種熒光假單胞菌鐵調(diào)控蛋白的應(yīng)用，其特征在于：鐵調(diào)控蛋白用于制備熒光假單 胞菌的免疫疫苗。
2. 按權(quán)利要求1所述的熒光假單胞菌鐵調(diào)控蛋白的應(yīng)用，其特征在于：鐵調(diào)控蛋白為 質(zhì)粒 pETTfeR 或 pETOprF。
3. 按權(quán)利要求1所述的熒光假單胞菌鐵調(diào)控蛋白的應(yīng)用，其特征在于：以熒光假單胞 菌TSSl為模板，采用F1/R1或F2/R2為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物分別與載體pET259 連接，獲得質(zhì)粒PETTfeR或pETOprF，所得質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)即可表達(dá)重組 鐵調(diào)控蛋白。
4. 按權(quán)利要求3所述的熒光假單胞菌鐵調(diào)控蛋白的應(yīng)用，其特征在于：所述引物為Fl : 5' -GATATCATGAGCCCCAGCTTCAACGCCT-3' ；R1 :5' -GATATCCGATGTAGTCACCGACGCGAA-3' ；F2 : 5' -GATATCATGAAACTGAAAAACACCTTGG-3' ；R2 :5' -GATATCCTGAGCGGTA GCTTCAACC-3'。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子疫苗學(xué)領(lǐng)域，具體的說是熒光假單胞菌鐵調(diào)控蛋白的應(yīng)用。鐵調(diào)控蛋白用于制備熒光假單胞菌的免疫疫苗。本發(fā)明的鐵調(diào)控蛋白作為疫苗能夠有效地保護(hù)牙鲆抵御熒光假單胞菌侵染。CGMCC No.232920080109
【IPC分類】C07K14-21, A61P31-04, A61K39-104, C12N15-70
【公開號(hào)】CN104800839
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510010428
【發(fā)明人】孫黎, 孫園園, 劉莉, 遲恒
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院海洋研究所
【公開日】2015年7月29日
【申請(qǐng)日】2015年1月9日