和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要時(shí)，可以加入崩解劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽例如海藻酸鈉。
[0024]本發(fā)明的活性成分的有效量可為提高受試者中δ阿片受體的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)水平的的任何量，其可以是相當(dāng)于約0.1-1Smg寡肽Asqffglm-NH2,優(yōu)選0.01-20mg寡肽Asqffglm-Nh2的劑量單位。更優(yōu)選地，劑量單位包括約1-4mg的寡肽asqffglm-nh2。最優(yōu)選地，劑量單位包括約2-3mg的寡肽Asqffglm-NH2。有效量的測定在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力內(nèi)，特別是根據(jù)本文提供的公開內(nèi)容的啟示下。
[0025]根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的藥學(xué)產(chǎn)品(藥物、藥劑)或藥物組合物可以以任意有效劑量數(shù)施用給藥受試者。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥學(xué)產(chǎn)品(藥物、藥劑)或藥物組合物可以以多次劑量給藥，例如從約2至約15次劑量，更優(yōu)選從約4-10次劑量，最優(yōu)選約6次劑量。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案，在給藥過程中，以每三周給藥約一次的頻率將本發(fā)明的藥學(xué)產(chǎn)品(藥物、藥劑)或藥物組合物給藥至受試者，例如注射、輸注或口服。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案，給藥為通過注射。
[0026]應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的藥學(xué)產(chǎn)品(藥物、藥劑)或藥物組合物可以按用于通過任意適宜的途徑給藥的任意適宜的方式配制。
[0027]本發(fā)明的藥學(xué)產(chǎn)品(藥物、藥劑)或藥物組合物的劑量單位是基于常規(guī)進(jìn)行給藥受試者。例如，劑量單位可以給藥多于每日一次、每周一次、每月一次等。劑量單位可以是以兩次/周為基礎(chǔ)給藥，即每周兩次，例如每三天一次。
[0028]如本文所使用的，“包含”與“包括”、“含有”或“特征在于”同義，并且是包括在內(nèi)的或開放性的，并且不排除另外的未陳述的元件或方法步驟。術(shù)語“包含”在本文中的任何表述，特別是在描述本發(fā)明的方法、用途或產(chǎn)品時(shí)，應(yīng)理解為包括基本上由所述組分或元件或步驟組成和由所述組分或元件或步驟組成的那些產(chǎn)品、方法和用途。本文示例性描述的本發(fā)明適當(dāng)?shù)乜梢栽诓淮嬖诒疚奈淳唧w公開的任何一種或多種元件、一種或多種限制的情況下進(jìn)行實(shí)踐。
[0029]本發(fā)明的藥學(xué)產(chǎn)品中所包含的涉及該藥學(xué)產(chǎn)品的說明書可以含有如下內(nèi)容:適應(yīng)癥(例如疼痛)、施用劑量(例如上述所示例性說明的)以及可能產(chǎn)生的副作用等等。
[0030]本文已采用的術(shù)語和表述用作描述性而不是限制性術(shù)語，并且在此種術(shù)語和表述的使用中不預(yù)期排除所示和所述特征或其部分的任何等價(jià)物，但應(yīng)認(rèn)識到各種修飾在請求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)是可能的。因此，應(yīng)當(dāng)理解盡管本發(fā)明已通過優(yōu)選實(shí)施方案和任選特征具體公開，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以采用本文公開的概念的修飾和變化，并且此類修飾和變化被視為在如由附加權(quán)利要求定義的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0031]為更清楚地說明本發(fā)明，現(xiàn)結(jié)合如下實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)說明，但這些實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明的示例性描述，并不能解釋為對本申請的限制。
[0032]實(shí)施例1
[0033]材料和方法
[0034]動物
[0035]雄性和雌性的ICR小鼠(20±1.0g)由杭州師范大學(xué)動物中心(中國杭州)隨機(jī)提供。所有動物實(shí)驗(yàn)程序由浙江理工大學(xué)動物飼養(yǎng)和使用委員會批準(zhǔn)，并且符合1986年11月24號歐共體委員會指令(86/609/EEC)。所有的動物飼養(yǎng)在12小時(shí)光/暗周期的23 °C -25 °C環(huán)境中，并且在實(shí)驗(yàn)開展前提供標(biāo)準(zhǔn)的食物和水。所有實(shí)驗(yàn)過程中盡可能減少小鼠所受到的傷害和痛苦。
[0036]多肽
[0037]Fiuo-寡肽Asqffglm-NH2和寡肽asqffglm-nh2多肽由中肽公司(中國杭州)使用固相多肽合成法合成，并且使用高效液相(HPLC)純化，其純度達(dá)到98%。FAM是羧基熒光基團(tuán)，利用標(biāo)準(zhǔn)耦合技術(shù)將5-羧基熒光素耦合到寡肽ASQFFGLM-NH2肽的氨基酸基團(tuán)上。寡肽Asqffglm-NH2溶解在生理鹽水中，工作液濃度是1.5禮。熒光素標(biāo)記的(fam)寡肽Asqffglm-Nh2溶解在50%dms0 (二甲基亞砜)中，儲存液的濃度是15禮。在實(shí)驗(yàn)之前用生理鹽水將其稀釋到1.5mM的工作濃度。
[0038]側(cè)腦室注射和組織制備
[0039]側(cè)腦室注射按照Haley和McCormick描述的在清醒小鼠中的操作方法進(jìn)行操作。每只小鼠注射的寡肽Asqffglm-NH2或fluo-寡肽asqffglm-nh2的最終劑量是6nmoi，注射體積是4 μ I。
[0040]我們前期的研究結(jié)果顯示側(cè)腦室注射寡肽Asqffglm-NH2后，在20min內(nèi)具有明顯的鎮(zhèn)痛效果，因此本實(shí)驗(yàn)的時(shí)間點(diǎn)選擇為5、10和20min三個(gè)時(shí)間點(diǎn)。在注射FAM-寡肽ASQFFGLM-NH2或者寡肽ASQFFGLM_NH2 (每只小鼠6nmol)后，在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，斷頸處死小鼠，注射位點(diǎn)的準(zhǔn)確性由顯微測量所驗(yàn)證。在對照組中，向小鼠側(cè)腦室注射4μ I生理鹽水。然后，將注射寡肽ASQFFGLM-NH2或者生理鹽水的小鼠腦迅速取出，保存在_80°C冰箱中以供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。迅速將注射fam-寡肽Asqffglm-NH2的小鼠腦取出，固定在含有4%多聚甲醒(Sigma)的0.1M的ρΗ7.4的磷酸鹽緩沖液中24h,在冰凍切片(JUNG Tissue freezingmedium, LEICA, Germany)之前用30%鹿糖溶液脫水。
[0041]冠狀切片和顯微鏡觀察
[0042]每只小鼠腦冷凍在-20°C，切片厚度為ΙΟμπι。然后腦組織切片被保存在玻片上。切片保存在4°C，12h內(nèi)完成顯微觀察和拍照。樣品用相差和熒光顯微鏡觀察(NIKONTE2000-U)。根據(jù)成年小鼠腦結(jié)構(gòu)圖集鑒定解剖結(jié)構(gòu)。
[0043]反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR
[0044]根據(jù)商品使用說明書，使用TRIzol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)從每個(gè)冰凍的腦組織中提取總RNA。簡而言之，用研缽將腦組織磨碎，然后根據(jù)每10mg加入ImlTRIzol的劑量加入TRIzol。在所有實(shí)驗(yàn)中，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Gibco BRL)將5 μ g總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，最終體積為50 μ I。
[0045]引物序列如下，這與我們之前發(fā)表的工作中的引物序列相同[7]:
[0046]NKl 受體(F):5，-TGGACTCTGATCTCTTCCCCAACA-3’
[0047]NKl 受體(R):5’ -GGACCCAGATGACAAAGATGACCACTT-3’
[0048]PPT-C (F): 5，-CGGGCCATCAGTGTGCACTA-3 ’
[0049]PPT-C (R): 5，-GGAATCCCCGTCCCCAGCAT-3，
[0050]PPT-A (F): 5 ’ -GAAATCGATGCCAACGATGATC-3 ’
[0051 ] PPT-A (R): 5，-AGGCTTGGGTCTTCGGGCGATTCT-3 ’
[0052]MOR (F): 5 ’ -ATCCTCTCTTCTGCCATTGGT-3 ’
[0053]MOR (R): 5 ’ -TGAAGGCGAAGATGAAGACA-3 ’
[0054]POMC (F): 5，-AGATTCAAGAGGGAGCTGGA-3 ’
[0055]POMC (R): 5，-CTTCTCGGAGGTCATGAAGC-3 ’
[0056]KOR (F): 5 ’ -CCGATACACGAAGATGAAGAC-3 ’
[0057]KOR (R): 5 ’ -GTGCCTCCAAGGACTATCGC-3，
[0058]PDYN (F): 5 ’ -CGGAACTCCTCTTGGGGTAT-3 ’
[0059]PDYN (R): 5，-TTTGGCAACGGAAAAGAATC-3 ’
[0060]DOR (F): 5，-AAGTACTTGGCGCTCTGGAA-3 ’
[0061]DOR (R): 5，-GCTCGTCATGTTTGGCATC-3 ’
[0062]PENK (F): 5，-AACAGGATGAGAGCCACTTGC-3 ’
[0063]PENK (R): 5，-CTTCATCGGAGGGCAGAGACT-3，
[0064]GAPDH (F): 5，-AGGAGCGAGACCCCACTAACAT-3 ’
[0065]GAPDH (R): 5，-GTGATGGCATGGACTGTGGT-3，
[0066]用ABI7300實(shí)時(shí)PCR檢測系統(tǒng)設(shè)備進(jìn)行相對定量實(shí)時(shí)PCR檢測上述基因在mRNA水平的表達(dá)變化情況，將GAPDH作為內(nèi)參基因。陰性對照用蒸餾水取代cDNA。在每次實(shí)時(shí)定量PCR后，做一次溶解曲線分析。每個(gè)靶標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)表達(dá)水平用2-AAet方法計(jì)算(Livak KJ, Schmittgen TD(2001)Analysis of Relative Gene Express1n Data UsingReal-Time Quantitative PCR and t\\e2^^Δετ Method.Methods 25:402-408.),公式為ΔΔ Ct= (Ct, Target — Ct, GAPDH) Time x (Ct, Target — Ct, GAPDH) TimeO。Time x 表不任意時(shí)間點(diǎn)(5，10和20min)，timeO代表靶基因標(biāo)準(zhǔn)化到對照GAPDH (生理鹽水組)。每次實(shí)驗(yàn)為一式三份，實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行三次獨(dú)立的重復(fù)。所有結(jié)果表示成平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)。
[0067]Western bloting
[0068]使用考馬斯亮藍(lán)蛋白定量法(Pierce Chemical C0.)測定總蛋白濃度，使用牛血清白蛋白(BSA, Sigma)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
[0069]蛋白進(jìn)行SDS變性聚丙烯酰胺膠電泳，