酸纖維素膜放置在含有5%脫脂牛奶TBST中室溫孵育lh，然后一抗孵育過夜(β -actin(l/10000, B1world), POMC(1:10000，ABGENT)，M0R(1/10000, Epitomics)，NKl 受體(1/500，Proteintech) DOR (1/500, B1world))。在這之后，二抗室溫孵育 2h(β _actin、D0R、M0R 和 TACRl 的二抗是 HRP-羊抗兔 IgG (1/5000，B1world)，POMC 二抗是HRP-兔抗羊IgG (1/5000, B1world))。最后在化學發(fā)光成像儀(Sage Creat1n)上顯色。蛋白分子量大小與預染蛋白marker (Fermentas)進行對比。
[0070]為了分析western bloing數據，對照的灰度被定義為100%,其數值由QuantityOne軟件(B1-world)測定。樣品的灰度根據對照灰度被以百分比的形式輸出。所有的數據來源于至少獨立的三次重復實驗。
[0071]數據分析
[0072]所有的數據來源于至少獨立的三次重復實驗。數據以平均值土SEM形式表示。所有的數據用SPSS軟件(SPSS Inc.，Chicago, IL, USA)分析。P值< 0.05被認為具有顯著性差異。
[0073]結果
[0074]1、給小鼠側室注射寡肽Asqffglm-NH2后，其在腦中的分布位點
[0075]在熒光顯微鏡下，fluo-寡肽ASQFFGLM-NH2肽在藍光激發(fā)下顯示綠光。給側腦室注射藥物1min后，fluo-寡肽ASQFFGLM_NH2主要分布在腦室以及幾個與腦室相鄰的結構。然而，fluo-寡肽Asqffglm-NH2和fiuo-r/mHK-1主要的不同分布位點是,在fluo-寡肽Asqffglm-Nh2處理組中，沒有在導水管灰質(pag)和e/ov發(fā)現綠色熒光。
[0076]2、編碼NKl受體和不同的前速激肽原在mRNA水平的表達特征
[0077]我們采用實時定量RT-PCR的方法比較研究了 NKl受體和前速激肽原在mRNA水平的表達變化(圖1)。其中管家基因GAPDH用來做內參。在實時定量PCR實驗中，2_δδμ方法被用于分析基因表達的相對變化。與對照組相比(生理鹽水，標準化為1)，側腦室注射寡肽 AsqFFGLM-NH2 后 5min、10min 和 20min 的 NKl 受體的 mRNA 值分別是 0.91 ±0.05，0.93±0.04and0.87±0.06 (圖 la，A)。5min、1min 和 20min 的 PPT-A mRNA 值分別是0.99±0.06,0.93±0.17 和 0.96±0.09 (圖1a,B)。5min、10min 和 20min 的 PPT-C mRNA 值分別是0.96±0.08、1.10±0.11和0.96±0.03 (圖la,C)0數據分析表明對照和所有寡肽Asqffglm-NH2處理組的寡肽asqffglm-nh2無顯著性差異，這表明在小鼠中，nki受體和前速激肽原的mRNA表達水平不受側腦室注射寡肽Asqffglm-NH2的影響。
[0078]3、編碼內源性阿片受體和阿片肽的mRNA的表達特征
[0079]利用實時定量rt-pcr技術，我們發(fā)現，與對照相比，寡肽Asqffglm-NH2處理組的DOR在mRNA水平上發(fā)生顯著增強。側腦室注射寡肽ASQFFGLM_NH2后5、10和20min時間點的值分別是 601.7±137.0,386.1 + 83.1 和 254.3 + 68.7 (圖 2e，E)。然而，DOR 的內源性配體PENK在mRNA水平沒有發(fā)生顯著變化，在側腦室注射藥物后，5、10和20min時間點的值分別是 1.08±0.11,0.94±0.10 和 0.97±0.08 (圖 2d，B)。MOR (圖 2a,A),POMC(MOR 的一個內源性配體，圖2b，B)，KOR (圖2c，C)和PDYN(K0R的一個內源性配體，圖2d，D)在藥物處理后在mRNA的表達水平均未發(fā)生顯著變化。
[0080]4、小鼠側腦室注射寡肽Asqffglm-NH2后導致dor受體蛋白的表達顯著增高
[0081]最后，我們檢測了由側腦室注射寡肽Asqffglm-Nh2引起的dor轉錄本的上調是否與dor蛋白的表達增加相關。在圖3D中可以看到，與對照組相比，經寡肽Asqffglm-NH2處理后，DOR蛋白的表達發(fā)生了顯著上調。在5、10和20min時間點，DOR蛋白的表達量分別是 1.78±0.28，3.26±0.50 和 5.29±0.86 (圖 3D)。此外，我們也檢測了 NKl 受體、MOR 和POMC的轉錄表達與它們各自的蛋白表達的相關性，由圖3A-C的結果可見這幾種蛋白在對照組與hHK-Ι的之間沒有發(fā)生顯著變化。
[0082]實施例2
[0083]材料和方法
[0084]動物
[0085]雄性和雌性的ICR小鼠(20±1.0g)由杭州師范大學動物中心(中國杭州)隨機提供。所有動物實驗程序由浙江理工大學動物飼養(yǎng)和使用委員會批準，并且符合1986年11月24號歐共體委員會指令(86/609/EEC)。所有的動物飼養(yǎng)在12小時光/暗周期的23 °C -25 °C環(huán)境中，并且在實驗開展前提供標準的食物和水。所有實驗過程中盡可能減少小鼠所受到的傷害和痛苦。
[0086]多肽
[0087]寡肽Asqffglm-NH2多肽由中肽公司(中國杭州)使用固相多肽合成法合成，并且使用高效液相(HPLC)純化，其純度達到98%。寡肽Asqffglm-NH2溶解在生理鹽水中，工作液濃度是1.5mM。
[0088]側腦室注射和甩尾實驗
[0089]側腦室注射按照Haley和McCormick描述的在清醒小鼠中的操作方法進行操作。每只小鼠注射的寡肽Asqffglm-NH2最終劑量是6nmoi，注射體積是4 μ I。在側腦室注射人HK-1 (4-11)后，馬上皮下注射2mg/kg的嗎啡，然后用溫浴甩尾實驗檢測聯合注射這兩種藥物對小鼠急性疼痛的影響。在溫浴甩尾實驗中，每只小鼠只用一次。將小鼠尾部1/3浸入48.5°C的恒溫水浴中，從浸入開始到小鼠自發(fā)將尾部甩出水浴的時間間隔定義為甩尾潛伏期。每只小鼠在實驗前先檢測甩尾潛伏期，并篩選甩尾潛伏期在2.5-4.5s的小鼠進行實驗研究，過于遲鈍和過于敏感的小鼠都棄去不用。為了避免小鼠尾部被燙傷，小鼠甩尾潛伏期的最大值為15s。每只小鼠每次測甩尾潛伏期的時間間隔為10s，最后四次的甩尾潛伏期的平均值作為用藥處理前的甩尾潛伏期，且這四次甩尾潛伏期的變異不能超過10%。聯合注射人HK-1 (4-11)和嗎啡后，檢測藥物注射后10，20，30，40，50和60分鐘各自的甩尾潛伏期。
[0090]鎮(zhèn)痛作用用下列公式進行計算:
[0091]甩尾潛伏期的變化百分率=[(用藥后的甩尾潛伏期-用藥前的基礎甩尾潛伏期)/用藥前的基礎甩尾潛伏期]*100%
[0092]數據分析
[0093]所有的數據來源于至少獨立的三次重復實驗。數據以平均值土SEM形式表示。所有的數據用SPSS軟件(SPSS Inc.，Chicago, IL, USA)分析。P值< 0.05被認為具有顯著性差異。
[0094]結果
[0095]側腦室注射人HK-1 (4-11)聯合皮下注射嗎啡后的協(xié)同鎮(zhèn)痛效果
[0096]從圖4可以看出，側腦室注射人HK-1 (4-11)能顯著增強皮下注射的嗎啡的鎮(zhèn)痛效果，在注射后一小時的時間內，每個10分鐘檢測到的鎮(zhèn)痛增強的幅度大約是原來嗎啡鎮(zhèn)痛效果的兩倍。由此可見，側腦室注射人HK-1 (4-11)聯合皮下注射嗎啡具有強效的協(xié)同鎮(zhèn)痛效果。
[0097]本領域普通技術人員應當理解，可以在本發(fā)明的實踐中采用除具體例示那些外的方法和原材料等而無需過度實驗。任何此類方法和原材料等的所有的本領域已知的功能等價物都預期包括在本發(fā)明中。本領域技術人員還應當理解，可對本說明書及權利要求書中描述的本發(fā)明進行各種變動和修飾，且本發(fā)明包括所有此類變動和修飾。本發(fā)明還包括本說明書中單獨或同時提及或指出的所有步驟、特征、組合物和化合物，以及所述步驟或特征中的任何2個或更多個的任何和所有組合。
【主權項】
1.寡肽Asqffglm-NH2和嗎啡聯合在制備用于在受試者中鎮(zhèn)痛的制劑中的用途。
2.根據權利要求1中所述的用途，其中所述的受試者為哺乳動物。
3.根據權利要求2所述的用途，其中所述的哺乳動物為人。
4.根據權利要求1所述的用途，其中所述的制劑為藥物。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的用途，其中所述的寡肽被PEG化修飾。
6.寡肽Asqffglm-NH2在制備用于增強嗎啡在受試者中的鎮(zhèn)痛效果的制劑中的用途。
7.根據權利要求6中所述的用途，其中所述的受試者為哺乳動物。
8.根據權利要求7所述的用途，其中所述的哺乳動物為人。
9.根據權利要求6所述的用途，其中所述的制劑為藥物。
10.根據權利要求6-9中任一項所述的用途，其中所述的寡肽被PEG化修飾。
【專利摘要】本發(fā)明涉及寡肽聯合或與嗎啡的組合在制備用于鎮(zhèn)痛的藥物中的用途。具體而言，本發(fā)明的寡肽ASQFFGLM-NH2在提高受試者中提高δ阿片受體的轉錄和/或表達水平，并進而能夠提高嗎啡的鎮(zhèn)痛效果。
【IPC分類】A61K47-48, A61K31-485, A61P25-04, A61K38-08
【公開號】CN104800829
【申請?zhí)枴緾N201410032675
【發(fā)明人】金園庭
【申請人】中國計量學院
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2014年1月23日