格公司 (Promega))后15分鐘將其置于仰臥位使用與冷卻CCD相機和560nm激發(fā)濾光器偶聯(lián)的 IVIS 100成像系統(tǒng)（卡鉗生命科學(xué)公司（Caliper Life Sciences))成像。使用Xenogen 活體成像軟件v2. 5獲取和分析圖像和發(fā)光信號并以每秒光子的形式進行定量。
[0104] 為評估療效，在原位腫瘤植入后7天進行膀胱的體內(nèi)桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。將小鼠隨機 分配至對照或治療組。對小鼠進行再次麻醉和再次插管后，灌注BacPAK6或BV-CD40L或 BV-IL-15病毒。將動物在7天后處死用于組織學(xué)分析或者觀察6個月以觀察膀胱癌的跡象 和癥狀（血尿和體重?fù)p失）以及活力狀態(tài)。
[0105] 對動物的所有處理和護理都根據(jù)新加坡國家實驗動物研宄咨詢委員會（National Advisory Committee for Laboratory Animal Research, Singapore)提出的《用于科 學(xué)目的的動物護理和使用指南》（Guidelines on the Care and Use of Animals for Scientific Purposes)進行。
[0106] 組織學(xué)分析和免疫染色：對于組織學(xué)檢查，收獲膀胱并在4% PFA中固定過夜，將 其懸浮于30%蔗糖中并包埋在組織冷凍介質(zhì)中。制備10 μπι的低溫切片并使用蘇木精和 伊紅（Η&Ε)染色。對于免疫染色，使用Tris緩沖的鹽水吐溫-20 (TBST)清洗組織切片2次 并使其在〇. 025%曲通Χ-100中孵育10分鐘。隨后將組織切片在5% BSA中孵育1小時以 封閉非特異性結(jié)合。使用兔多克隆抗熒光素酶抗體（阿柏堪穆公司（Abcam)，l:100)4°C過 夜。使用TBST清洗3次后，將載玻片與二抗（FITC偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(l:200))在室溫下 孵育1小時。
[0107] 細(xì)胞因子/趨化因子表達：經(jīng)膀胱內(nèi)灌注PBS或BacPAK6后48小時處死小鼠。 收獲膀胱并稱重。以50mg組織/ml的量加入含有蛋白酶抑制劑混合物（卡巴開公司 (Calbiochem)，默克公司（Merck)，德國達姆施塔特）的組織裂解緩沖液（富酶泰斯公司 (Fermentas)，美國馬里蘭州）并通過超聲對膀胱進行勻漿。隨后對膀胱勻漿物在4°C下 16, OOOx g離心30分鐘并收集上清液。通過伯樂蛋白試驗方法（伯樂公司（Biorad)，美國 加利福尼亞州）測量上清液的蛋白濃度。將含80 yg總蛋白濃度的上清液等分試樣加載在 小鼠細(xì)胞因子陣列2. 1 (瑞博奧公司（Raybiotech)，佐治亞州諾克羅斯）上以根據(jù)生產(chǎn)商的 說明書測量細(xì)胞因子和趨化因子的表達水平。使用RayBio?分析工具（瑞博奧公司）將平 均信號強度和細(xì)胞因子的相對表達水平進行關(guān)聯(lián)。
[0108] 結(jié)果
[0109] 經(jīng)膀胱內(nèi)灌注后桿狀病毒載體有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠膀胱：首先評估桿狀病毒是否能夠 在免疫缺陷的裸小鼠中轉(zhuǎn)導(dǎo)膀胱。在經(jīng)膀胱內(nèi)灌注至膀胱后，對三種不同的含螢火蟲熒光 素酶基因的重組桿狀病毒載體進行了測試，并使用IVIS活體動物成像系統(tǒng)監(jiān)控了體內(nèi)轉(zhuǎn) 導(dǎo)效率（圖1A)。所有三種載體都能夠在使用聚L-賴氨酸預(yù)處理器官后有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠膀 胱。含有兩種病毒轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件WPRE和RU5的其中一種桿狀病毒載體BV-RU5-Luc-WPRE 提供了膀胱中最高的轉(zhuǎn)基因表達水平。雖然隨時間降低，但三種載體提供的表達水平在至 少35天中維持顯著高于背景水平（圖1B)。
[0110] 在免疫活性C57BL/6小鼠中（圖2A、2B)，雖然BV-RU5-LUC-WPRE提供的初始表達 水平與免疫缺陷的裸小鼠中觀察到的類似，但該水平迅速下降且可檢測的轉(zhuǎn)基因表達僅持 續(xù)約2周。兩種小鼠類型之間轉(zhuǎn)基因表達的差異顯示針對桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的強免疫應(yīng)答。膀 胱中桿狀病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達是劑量依賴的，證據(jù)是使用每只小鼠 IO7個病毒顆粒治療 的C57BL/6小鼠中1天時的熒光素酶表達水平為使用每只小鼠 IO8個病毒顆粒治療時的約 1/4(圖2A、2B)。使用針對熒光素酶蛋白的抗體的免疫組織學(xué)染色確認(rèn)了桿狀病毒介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)基因表達限于淺表的膀胱上皮（圖2C)。
[0111] 單獨的桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)能夠延緩膀胱腫瘤生長：研宄了免疫活性C57BL/6小鼠中桿 狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后器官內(nèi)細(xì)胞因子和趨化因子的表達。BacPAK6是一種不含哺乳動物基因表達 盒的桿狀病毒載體，用于該目的以避免可能的轉(zhuǎn)基因表達干擾。使用抗體陣列法，與接受 PBS灌注的膀胱中的表達水平相比，在兩天前接受了膀胱內(nèi)灌注BacPAK6的膀胱中，鼠陣列 中檢測到了 59% (32個中的19個）細(xì)胞因子和趨化因子的上調(diào)（定義為大于2倍的表達 增加）（圖3A、B)。上調(diào)最多的5種蛋白是粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF，升高123 倍）、粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF，升高35倍）、皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子（CTACK，升高10 倍）、血小板生成素（ΤΡ0,升高7倍）和腫瘤壞死因子a (TNFa，升高7倍）。不進行任何 治療的正常小鼠膀胱和接受PBS灌注的膀胱之間的比較顯示，細(xì)胞因子和趨化因子的表達 水平?jīng)]有顯著性差異。
[0112] 隨后研宄了桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞因子和趨化因子的表達水平變化是否會影響膀 胱腫瘤生長。在建立同源原位小鼠膀胱癌模型以研宄效果的過程中，注意到甚至在低接種 劑量（每只動物lx IO5個癌細(xì)胞）下，ΜΒ49細(xì)胞在2周內(nèi)快速生長以占據(jù)泌尿膀胱的整個 內(nèi)腔（圖4Α)。由于侵略性腫瘤生長，小鼠也快速死亡，其中第一只小鼠在10至14天死亡 且所有小鼠在約4周內(nèi)死亡（Gilnther JH等，1991)。ΜΒ49細(xì)胞的這些特性使進行精確膀胱 內(nèi)灌注和測試靶向已建立膀胱腫瘤的實驗治療劑（尤其是免疫治療劑）變得困難。MB49S1 細(xì)胞是MB49小鼠膀胱癌細(xì)胞系的亞克隆，顯示較慢的生長速率但保持高腫瘤建立率（圖 4A)，其因此用于在C57BL/6小鼠中通過經(jīng)膀胱內(nèi)將細(xì)胞灌注至聚L-賴氨酸預(yù)處理的膀胱 中以建立膀胱癌模型。
[0113] 接種lx IO5個MB49S1細(xì)胞后一周，將具有已建立腫瘤的C57BL/6小鼠隨機分為 兩組（每組η = 10)。一組接受IO8個BacPake病毒顆粒的單次灌注而另一組接受PBS作 為灌注對照。膀胱中桿狀病毒刺激后觀察到具有膀胱腫瘤小鼠的存活顯著延長。對照組中 的全部動物在70天內(nèi)死亡，而治療組中50%的動物在腫瘤接種后6個月仍存活（圖4Β，對 數(shù)秩檢驗中Ρ〈〇. 01)。該發(fā)現(xiàn)顯示，膀胱中桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞因子和趨化因子的上調(diào)在介 導(dǎo)抗腫瘤效果方面是有功能的且可發(fā)揮作用以治愈已建立的膀胱腫瘤。
[0114] 桿狀病毒載體可介導(dǎo)至膀胱癌細(xì)胞的高效基因轉(zhuǎn)移和針對膀胱癌的CD40L基因 治療：為評估桿狀病毒載體是否可用于將轉(zhuǎn)基因遞送至膀胱癌，將培養(yǎng)的小鼠 ΜΒ49膀胱癌 細(xì)胞和人Τ24膀胱癌細(xì)胞與BV-RU5-LUC-WPRE -起進行體外轉(zhuǎn)導(dǎo)。使用針對熒光素酶蛋白 的抗體進行的免疫染色確認(rèn)了這些腫瘤細(xì)胞中高水平的熒光素酶表達（圖5Α)。在具有原 位ΜΒ49腫瘤的C57BL/6小鼠中，膀胱內(nèi)灌注BV-RU5-Luc-WPRE導(dǎo)致腫瘤以及正常膀胱上皮 中明顯的轉(zhuǎn)基因表達（圖5)。在腫瘤中，陽性染色不僅在腫瘤表層而且在內(nèi)部腫瘤區(qū)域中 都能觀察到，顯示腫瘤中病毒的滲透。
[0115] 透過使用鼠⑶40配體（⑶40L)基因（一種編碼II型跨膜蛋白的基因，所述蛋白 的功能為有效的T輔助1免疫刺激物）代替BV-RU5-LUC-WPRE表達盒中的熒光素酶基因， 構(gòu)建了桿狀病毒載體BV-CD40L。在ΜΒ49細(xì)胞中體外桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和原位ΜΒ49腫瘤中體內(nèi) 桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后分別使用RT-PCR(圖5C)和Western印跡（圖5D)確定⑶40L的表達。
[0116] 為檢測BV-⑶40L的治療效果，通過將2x IO4個DiR標(biāo)記的MB49細(xì)胞接種至 C57BL/6小鼠的膀胱內(nèi)來建立膀胱腫瘤模型。使用IVIS活體動物成像系統(tǒng)監(jiān)控DiR紅外熒 光信號以確認(rèn)成功的腫瘤建立（圖6A)。在腫瘤接種后第4天，將小鼠隨機分為兩組（每 組η = 5)并以每只小鼠 IO8個BV-⑶40L病毒顆粒或作為對照的10 8個BacPAK6病毒顆粒 的劑量經(jīng)膀胱內(nèi)灌注進行治療。在治療接種后第6天和第8天進行兩組中的第2和第3次 治療。在第14天處死小鼠并通過檢測H&E染色的膀胱組織切片以評估膀胱中的腫瘤發(fā)展 階段（圖6A)。在對照組中，腫瘤發(fā)展至晚期，5只動物中的4只（#1、2、4、5)具有嚴(yán)重的腫 瘤壞死且腫瘤侵襲至肌肉層中。這些小鼠中膀胱上皮完全損傷且變得混亂。在治療組中， 腫瘤塊相對較小且上皮中沒有顯著損傷。一些腫瘤（#1和3)還是淺表性的，而其他（#2、4 和5)從小鼠膀胱內(nèi)腔上排列的細(xì)胞層生長至下方的結(jié)締組織中，但尚未進入肌肉層。該組 的平均膀胱重量在統(tǒng)計學(xué)上顯著低于治療組（P〈〇. 05,圖6B)。這些發(fā)現(xiàn)顯示桿狀病毒可能 能夠用作體內(nèi)基因治療載體遞送治療性基因以治療侵略性生長的膀胱癌。
[0117] 共同遞送⑶40L和IL-15對于具有膀胱癌小鼠存活的影響：除 BV-CMV-RU5-Luc-WPRE和BV-⑶40L病毒外，還可通過使用鼠白介素（IL15)基因（一種編 碼誘導(dǎo)天然殺傷細(xì)胞增殖的細(xì)胞因子的基因，所述天然殺傷細(xì)胞形成先天免疫系統(tǒng)的一部 分）代替BV-RU5-Luc-WPRE表達盒中的熒光素酶基因來構(gòu)建BV-IL-15。分別測試BV-CD40L 病毒和BV-IL-15病毒的治療效果以確認(rèn)治療性基因表達并隨后共同遞送至具有膀胱癌的 小鼠的膀胱中。在接種IO5個MB49細(xì)胞后2天進行桿狀病毒載體的膀胱內(nèi)灌注。
[0118] 結(jié)果示于圖7。觀察到通過桿狀病毒載體共同遞送的⑶40L和IL-15能夠延長具 有膀胱癌小鼠的存活（圖7)。在使用表達CD40L和IL-15的桿狀病毒載體聯(lián)合治療的一只 小鼠中，MB49腫瘤完全停止（圖7B)。
[0119] 討論
[0120] 可治療性利用哺乳動物中桿狀病毒的免疫刺激效果以抑制膀胱腫瘤生長。該假說 得到了以下觀察的支持，即經(jīng)膀胱內(nèi)遞送不表達任何轉(zhuǎn)基因的桿狀病毒能夠延長具有已建 立的原位膀胱癌的免疫活性小鼠的存活。該同源模型系統(tǒng)提供了完整的免疫功能，允許進 行針對膀胱癌的治療性疫苗的研宄。雖然在單獨一次注射非轉(zhuǎn)基因桿狀病毒載體后只治愈 了一半的具有腫瘤的小鼠，但如果膀胱內(nèi)灌注的頻率升高，可以提高存活。還可通過在桿狀 病毒載體中包括治療性基因以改善效果。就此而言，在具有侵略性生長膀胱癌的動物模型 中顯示了桿狀病毒載體介導(dǎo)的CD40L表達的抗腫瘤效果。
[0121] 因此，上述這些結(jié)果顯示，根據(jù)膀胱癌的同源原位動物模型，昆蟲桿狀病毒可用作 膀胱癌治療的新試劑，其具有治療性疫苗和治療性基因遞送的雙重功能。
[0122] 本說明書引用的所有發(fā)表物和專利申請通過引用納入本文，就好像各發(fā)表物或?qū)?利申請?zhí)囟ê蛦为毜赝ㄟ^引用納入本文那樣。任何出版物的引用針對提交日之前的公開而 不應(yīng)解釋為承認(rèn)本發(fā)明不具有通過在先發(fā)明先于這些出版物的權(quán)利。
[0123] 在本說明書和權(quán)利要求書中所用的單數(shù)形式"一個"、"一種"和"該"包括多個指示 物，除非上下文中有明顯的表示。在本說明書和所附權(quán)利要求書中所用的術(shù)語"包含"、"含 有"、"包括"以及其它這些術(shù)語的形式意味著非限制性包含的意義，即，包括具體引用的元 素或成分，但不排除任何其它元素或成分。該說明書和所附權(quán)利要求書中使用的所有范圍 或列表旨在表示其中所含的任何中間值或范圍或任何子列表。除非另有說明，本文所用的 所有科技術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的通常含義相同。
[0124] 雖然出于闡明目的已經(jīng)通過說明和舉例的方式對本發(fā)明有所描述，但本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)不難了解，可以對本發(fā)明作出某些改變和修改而不背離所附權(quán) 利要求書的構(gòu)思和范圍。
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