一種無創(chuàng)制作慢性阻塞性肺疾病急性加重動物模型的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于動物實驗?zāi)Ｐ蜆?gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種無創(chuàng)制作慢性阻塞性肺疾病急性加重動物模型的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前慢性阻塞性肺疾病急性加重動物模型的構(gòu)建方法有很多，目前最長使用的方法包括:內(nèi)毒素經(jīng)氣管內(nèi)注入加熏香煙法、氣管內(nèi)滴入蛋白酶加二氧化硫刺激法、持續(xù)細菌感染加吸煙法、氣道內(nèi)注入促彈性蛋白酶和脂多糖、氣道內(nèi)注入蛋白酶加常壓低氧法、CaCl2聯(lián)合山黎豆類制劑。上述造模方法均需要氣道內(nèi)滴入化學(xué)制劑，由于慢性阻塞性肺疾病急性加重動物模型的構(gòu)建時間較長，故造模過程中動物的存活率是一個很關(guān)鍵的問題。造模過程中氣道內(nèi)滴入化學(xué)制劑的步驟相當關(guān)鍵，可以有氣管切開法、直視下給藥法、盲插法等，均屬于有創(chuàng)操作，對動物造成一定程度的損傷，會影響成型動物的存活數(shù)量以及質(zhì)量。
[0003]氣管切開法:為有創(chuàng)操作，簡單易行，且在切開后，視野暴露良好，易于準確定位；但術(shù)后感染與否以及操作對于氣管局部以及周圍組織的破壞難以掌握，存活率低。
[0004]直視下給藥法:選取光源暴露聲門后，操作者在直視聲門的情況下，進行氣管內(nèi)給藥的相關(guān)操作，較其他方法創(chuàng)傷小，器械和技術(shù)水平要求相應(yīng)也降低，但選擇合適的光源清晰暴露聲門則是此法關(guān)鍵環(huán)節(jié)，多選用燈泡，冷光源，手電等透過頸部的光線。此時輔以牽拉舌根暴露聲門，但大鼠頭部狹長，聲門狹小并且在口腔深部，選用的給藥裝置如過粗或形態(tài)不能很好配合生理曲度時，在逐漸接近會厭部，則會擋住大部分視線，在聲門暴露的短暫時間內(nèi)，較難準確插入聲門完成操作，并容易將給藥裝置誤入食管或因為視野不清反復(fù)多次插入造成喉頭水腫，氣道損傷，聲帶出血，嚴重時甚至大鼠死亡。
[0005]盲插法:經(jīng)口氣管內(nèi)給藥，在沒有暴露聲門的情況下，容易反復(fù)刺激喉部，造成粘膜水腫出血，氣道分泌物增加，導(dǎo)致氣道阻塞，另外極易將注射裝置誤入食道，成功率較低。經(jīng)皮氣管內(nèi)給藥，則需要從外部皮膚直接準確定位氣管位置并從環(huán)狀軟骨間隙給藥，對操作人的技術(shù)要求較高，否則容易多次刺激局部肌肉及筋膜等，給藥效果難以評估，還容易造成水腫出血，成功率低。
[0006]針對上述現(xiàn)有的操作技術(shù)，目前，需要一種操作方便，成功率高，損傷小且成本低廉的大鼠用氣管內(nèi)給藥方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提出了一種無創(chuàng)制作慢性阻塞性肺疾病急性加重動物模型的方法。其技術(shù)方案如下:
[0008]一種無創(chuàng)制作慢性阻塞性肺疾病急性加重動物模型的方法，包括以下步驟:
[0009]步驟1、菌株與細菌培養(yǎng)
[0010]肺炎鏈球菌標準菌株由天津市臨床檢驗中心提供，菌株號:ATCC49619，取菌株ATCC49619接種于血瓊脂培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng)18_24h，挑取單菌落接種THB液體培養(yǎng)基，37°C，200rpm/min振蕩培養(yǎng)12h，離心濃縮后，備用；
[0011]步驟2、實驗動物
[0012]清潔級Wistar雄性大鼠60只，月齡3_6個月，體重180 士 20g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物合格(許可)證號:SCXK(京)2009-0004 ;實驗大鼠喂養(yǎng)在天津?qū)嶒瀯游镏行?，飼養(yǎng)環(huán)境室內(nèi)相對濕度為50% -60%，溫度控制在18-22°C ;常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲用水，按時通風沖刷糞便，保持環(huán)境安靜，適應(yīng)性喂養(yǎng)I周后開始實驗；
[0013]步驟3、肺氣腫動物模型構(gòu)建:
[0014]采用內(nèi)窺鏡引導(dǎo)下氣管內(nèi)灌注的滴注菌液方式，設(shè)備采用鼻O度4#硬式內(nèi)窺鏡、氙燈冷光源及松下KS-822攝錄監(jiān)視系統(tǒng)；
[0015]將大鼠置于直徑為26cm的干燥器內(nèi)乙醚麻醉，麻醉滿意后迅速將鼠從麻醉器中取出，呈仰臥位狀以彈力固定夾將其四肢分別固定于鼠板上；
[0016]兩名操作者并排位于鼠頭頂方向，首先助手以左手持鼠麻醉喉鏡，自鼠上唇齒伸入口腔、提壓鼠舌，伸至鼠會厭緣處時提拉鼠舌根，以右手持牽拉套圈，套住鼠上列長尖牙門齒，左右手同時相反方向上下牽拉舌根與長尖牙門齒，使鼠自唇齒至喉部間上呼吸暢通暴露聲門區(qū)域，此時主操作者以左手持O度硬式內(nèi)窺鏡，右手持7號長針注射器，內(nèi)裝定量造模所用肺炎鏈球菌菌懸液，在監(jiān)視器顯示引導(dǎo)下將7號長注射針插入氣管內(nèi)，并深入聲門下15?20mm，此時觀察鼠的聲帶活動情況，當雙側(cè)聲帶由內(nèi)收狀向外展狀變化時，緩慢滴注6u 0.15ml彈性蛋白酶溶液7.7 μ /mg, Sigma公司，隨后注入100 μ I空氣，此時鼠呈吸氣階段，使藥物隨吸氣時的氣流充分進入支氣管內(nèi)，推注完畢后，將鼠板迅速立起鼠頭在上左右翻轉(zhuǎn)15?20秒，空白組不做處理，鹽水對照組注入同等量的無菌生理鹽水；每7天滴入一次，共3次，造模時間21天；
[0017]解除鼠四肢彈力固定夾將鼠放回鼠籠內(nèi)待復(fù)蘇，鼠復(fù)蘇時間約30?60秒，然后置于恒溫動物房飼養(yǎng)；接種后每日觀察其活動、取食、精神的一般情況，記錄相應(yīng)數(shù)據(jù)；
[0018]步驟4、制備肺炎鏈球菌瓊脂珠懸液:
[0019]肺炎鏈球菌標準菌株由天津市臨床檢驗中心提供，菌株號:ATCC49619 ;營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)后，調(diào)整細菌濃度為2X 1012-6X 1012CFU/ml，取濃縮菌液與45°C溶化的瓊脂溶液等量混合，迅速注入4°C快速攪拌的腦心浸液培養(yǎng)基中，制成由瓊脂包裹細菌的肺炎鏈球菌瓊脂珠懸液；懸浮液包含細菌濃度為lX1012-3X1012CFU/ml的不定形瓊脂珠。
[0020]本發(fā)明的有益效果為:
[0021]本發(fā)明使用的是無創(chuàng)手段氣管內(nèi)滴入彈性蛋白酶以及肺炎鏈球菌的方法構(gòu)建慢性阻塞性肺疾病動物模型。該方法通過無創(chuàng)的方法，減少了對動物的損傷，提高了成活率，保證了在較長時間的造模過程中動物能夠免于有創(chuàng)操作帶來的死亡。研宄發(fā)現(xiàn)每次能夠保證滴入足夠量的彈性蛋白酶能夠相對縮短造模時間，節(jié)省了時間的同時也節(jié)約了造模成本。
【附圖說明】
[0022]圖1為空白組動物肺組織HE染色(50倍);
[0023]圖2為模型組動物肺組織HE染色(50倍);
[0024]圖3為鹽水對照組動物肺組織HE染色(50倍)。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細地說明。一種無創(chuàng)制作慢性阻塞性肺疾病急性加重動物模型的方法
[0026]步驟1、菌株與細菌培養(yǎng)
[0027]肺炎鏈球菌標準菌株由天津市臨床檢驗中心提供，菌株號:ATCC49619，取菌株ATCC49619接種于血瓊脂培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng)18_24h，挑取單菌落接種THB液體培養(yǎng)基，37°C，200rpm/min振蕩培養(yǎng)12h，離心濃縮后，備用。
[0028]步驟2、實驗動物
[0029]清潔級Wistar雄性大鼠60只，月齡3_6個月，體重180 士 20g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物合格(許可)證號:SCXK(京)2009-0004 ;實驗大鼠喂養(yǎng)在天津?qū)嶒瀯游镏行模曫B(yǎng)環(huán)境室內(nèi)相對濕度為50% -60%，溫度控制在18-22°C ;常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲用水，按時通風沖刷糞便，保持環(huán)境安靜，適應(yīng)性喂養(yǎng)I周后開始實驗。
[0030]步驟3、肺氣腫動物模型構(gòu)建:
[0031]采用內(nèi)窺鏡引導(dǎo)下氣管內(nèi)灌注的滴注菌液方式，設(shè)備采用鼻O度4#硬式內(nèi)窺鏡、氙燈冷光源及松下KS-822攝錄監(jiān)視系統(tǒng)；
[0032]將大鼠置于直徑為26cm的干燥器內(nèi)乙醚麻醉，麻醉滿意后迅速將鼠從麻醉器中取出，呈仰臥位狀以彈力固定夾將其四肢分別固定于鼠板上；
[0033]兩名操作者并排位于鼠頭頂方向，首先助手以左手持鼠麻醉喉鏡，自鼠上唇齒伸入口腔、提壓鼠舌，伸至鼠會厭緣處時提拉鼠舌根，以右手持牽拉套圈，套住鼠上列長尖牙門齒，左右手同時相反方向上下牽拉舌根與長尖牙門齒，使鼠自唇齒至喉部間上呼吸暢通暴露聲門區(qū)域，此時主操作者以左手持O度硬式內(nèi)窺鏡，右手持7號長針注射器，內(nèi)裝定量造模所用肺炎鏈球菌菌懸液，在監(jiān)視器顯示引導(dǎo)下將7號長注射針插入氣管內(nèi)，并深入聲門下15?20mm，此時觀察鼠的聲帶活動情況，當雙側(cè)聲帶由內(nèi)收狀向外展狀變化時，緩慢滴注6u(0.15ml)彈性蛋白酶溶液(7.7 μ/mg，Sigma公司)，隨后注入10yl空氣，此時鼠呈吸氣階段，使藥物隨吸氣時的氣流充分進入支氣管內(nèi)，推注完畢后，將鼠板