GGGTCATGCTGACCGATGTAAGTCCCGAGCCCCTCCAAGCTCTGCTGGAGAGAGCCTCTGCCACCCTCCAGGA CCTGGTCTTTGA TGAGTGTGGGA TCACGGA TGA TCAGCTCCTTGCCCTCCTGCCTTCCCTGAGCCACTGCTCCCAGC TTACAACCTTAAGCTTCTACGGGAA TTCCA TCTCCA TA TCTGCCTTGCAGAGTCTCCTGCAGCACCTCA TCGGGCTG AGCAA TCTGACCCACGTGCTGTA TCCTGTCCCCCTGGAGAGTTA TGAGGACA TCCA TGGTACCCTCCACCTGGAGAG GCTTGCCTA TCTGCA TGCCAGGCTCAGGGAGTTGCTGTGTGAGTTGGGGCGGCCCAGCA TGGTCTGGCTTAGTGCCA ACCCCTGTCCTCACTGTGGGGACAGAACCTTCTA TGACCCGGAGCCCA TCCTGTGCCCCTGTTTCA TGCCTAACGTC GACATGTGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCC CAGCACGCAGCCCTGGGAGCATGTGAATGCCATCCAGGAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGAGACACTGCTG CTGAGATGAATGAAACAGTAGAAGTCATCTCAGAAATGTTTGACCTCCAGGAGCCGACCTGCCTACAGACCCGCCTG GAGCTGTACAAGCAGGGCCTGCGGGGCAGCCTCACCAAGCTCAAGGGCCCCTTGACCATGATGGCCAGCCACTACAA GCAGCACTGCCCTCCAACCCCGGAAACTTCCTGTGCAACCCAGATTATCACCTTTGAAAGTTTCAAAGAGAACCTGA AGGACTTTCTGCTTGTCATCCCCTTTGACTGCTGGGAGCCAGTCCAGGAGGAATTCATGGTGATTGCCGAGCTGCCT CCCAAAGTGAGCGTCTTCGTCCCACCCCGCGACGGCTTCTTCGGCAACCCCCGCAAGTCCAAGCTCATCTGCCAGGC CACGGGTTTCAGTCCCCGGCAGATTCAGGTGTCCTGGCTGCGCGAGGGGAAGCAGGTGGGGTCTGGCGTCACCACGG ACCAGGTGCAGGCTGAGGCCAAAGAGTCTGGGCCCACGACCTACAAGGTGACCAGCACACTGACCATCAAAGAGAGC GACTGGCTCAGCCAGAGCATGTTCACCTGCCGCGTGGATCACAGGGGCCTGACCTTCCAGCAGAATGCGTCCTCCAT GTGTGTCCCCGGGATCCEGFP 其中ATG為啟始密碼子，斜體字的為Trp2基因，黑體字的為GM-CSF基因，加下劃 線的為Fc基因，之后為EGFP。
[0028] 表明已經(jīng)正確后再轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，在37°C溫度條件下培養(yǎng)擴增，然后大 規(guī)模制備質(zhì)粒，用Qiagen試劑盒篩選、純化、抽提獲得符合轉(zhuǎn)染和注射要求的不含外毒素 的高純度黑色素瘤DNA質(zhì)粒疫苗PEGFP-Trp 2-GM-CSF-Fc。
[0029] 陽離子聚合物PEI (MW 25 KDa)為免疫佐劑和給藥載體，制備得到含有陽離子聚 合物的DNA質(zhì)粒疫苗：取適量的DNA和PEI25k分別溶解在磷酸鹽緩沖液中，配制成適當濃 度，將陽離子聚合物溶液逐滴加入到等體積的DNA溶液中，漩渦混合，在室溫孵育20 min， 在制備PEI/DNA納米復合物時PEI陽離子聚合物與DNA之間的比例關(guān)系是根據(jù)氮磷比（N/ P=l〇)，其中N代表陽離子聚合物中氨基基團摩爾數(shù)，P代表DNA中磷酸基團摩爾數(shù)。
[0030] PEI25k/pEGFP-Trp2-GM-CSF-Fc疫苗對體外黑色素瘤細胞（B16)的作用：將I X IO5 個/孔的B16細胞接種于96孔培養(yǎng)板，37°C，0)2孵箱培養(yǎng)12 h，待細胞貼壁后，三種細胞 中分別加入不同N/P比例（N/P=l，2,5，10,20,30,40)PEI/DNA納米復合物20μl。每一梯 度做三個復孔，作用12 h后，每孔加 MTT溶液20 μ I (5 mg 繼續(xù)在37°C，培養(yǎng)4 h， 棄上清，每孔加二甲基亞砜150 μ 1，振蕩lOmin，酶聯(lián)免疫測定570 nm處各孔吸光度（A)， 以無血清培養(yǎng)基為空白對照，取平均值，并計算細胞生長抑制率％ =(對照組平均A值-實 驗組平均A值)/對照組平均A值X 100%。PEI25k/DNA組給藥后，48小時內(nèi)對B16細胞毒性 明顯大于對照組（P < 0. 05)，結(jié)果如圖6所示。
[0031] PEI25k/pEGFP-Trp2-GM-CSF-Fc納米復合物的經(jīng)皮免疫給藥：選用4-6周齡的 BALB/c小鼠60只，體重18 ± 2 g，隨機分為5組，每組12只，用I X IO6 B16黑色素瘤細胞皮 下接種小鼠下腹部，當腫瘤長到體積約40 _3,根據(jù)腫瘤大小，每組各選擇10只進行以下抗 腫瘤免疫治療實驗。分別在第〇、7、14 d用5%的水合氯醛麻醉小鼠，小鼠腹部毛發(fā)剪去2 cmX2 cm 區(qū)域，用微針處理 2 min，涂抹 PEI25k/pEGFP-Trp2-GM-CSF-Fc 100 μL/只 / 次，質(zhì) 粒濃度為〇. 6 mg · ml/1，待充分吸收。以微針給藥PBS液100 μ 1/只/次為陰性對照組。
[0032] 腫瘤免疫治療各組小鼠抑瘤效果及生存率評價：上述各組小鼠接種了 Β16黑色素 瘤細胞后，每天觀察成瘤情況，并于實體腫瘤長到體積約40 mm3的第0、7、14 d微針給藥各 組試劑，操作同上。間隔一定時間測量腫瘤長徑（a)和短徑（b)，采用公式腫瘤體積（mm3) = 短軸（mm) 2 X長軸（mm)/2，，計算腫瘤體積，并觀察小鼠的存活情況。實驗結(jié)果顯示，給藥 組荷瘤小鼠的腫瘤體積明顯小于對照組（P< 0.01)，且小鼠生存率提高，結(jié)果如圖7、8、9所 不O
[0033] 免疫治療后荷瘤小鼠組織學評價：于末次免疫7 d后，每組各荷瘤小鼠頸椎脫臼 處死后，完整分離腫瘤，立刻置于經(jīng)10 %的福爾馬林固定4 h，PBS漂洗數(shù)次，分別于60 % 乙醇浸泡3 h，70 %乙醇浸泡2 h，80 %乙醇浸泡3 h，95 %乙醇浸泡3 h，100 %乙醇浸泡 30 min，重復2次。二甲苯浸泡15 min，重復2次。58 °C浸蠟I h。進行組織包埋。切片， 為4 ym厚度，60 °C烘烤2 h。37 °C過夜，4 °C保存待用。
[0034] 根據(jù)腫瘤壞死的分級為： 一，瘤體無壞死； 十，瘤體壞死少于1/3; + +，瘤體壞死1/3~2/3; + + +，瘤體壞死超過2/3。
[0035] 瘤體內(nèi)和瘤體周圍炎性細胞（中性粒、淋巴、單核細胞）浸潤的分級為： 一，無炎性細胞浸潤； 十，少量炎性細胞浸潤； + +，中等量炎性細胞浸潤； + + +，大量炎性細胞浸潤。
[0036] HE染色后結(jié)果顯示給藥組瘤體內(nèi)的壞死程度明顯高于對照組，結(jié)果如表1所示。
[0037] 表1 PEI25k/DNA抗腫瘤免疫治療后腫瘤部位的炎癥情況
【主權(quán)項】
1. 一種抗黑色素瘤DNA質(zhì)粒疫苗，包括質(zhì)粒載體，其特征在于所述質(zhì)粒載體中含有黑 色素瘤特異腫瘤抗原（Trp 2)、細胞因子（GM-CSF)、Fc融合蛋白3種基因表達單位元件和綠 熒光蛋白報告基因的重組質(zhì)粒，用PCR擴增Trp 2、GM-CSF、Fc目的基因片段，分別通過雙切 酶連接到真核表達的質(zhì)粒載體上，構(gòu)建成PEGFP-Trp 2-GM-CSF-Fc質(zhì)粒。
2. 如權(quán)利要求1所述的抗黑色素瘤DNA質(zhì)粒疫苗，其特征在于所述質(zhì)粒載體中含有 Trp2 (NCBI Reference Sequence: NM_006115. 3)對應(yīng)的全部基因序列。
3. 如權(quán)利要求1所述的抗黑色素瘤DNA質(zhì)粒疫苗，其特征在于所述質(zhì)粒載體中含有 GM-CSF (GenBank: M11220.1)對應(yīng)的全部基因序列。
4. 如權(quán)利要求1所述的抗黑色素瘤DNA質(zhì)粒疫苗，其特征在于所述質(zhì)粒載體中含有Fc 融合蛋白（GenBank: X67292. 1)對應(yīng)的全部基因序列。
5. 如權(quán)利要求1所述的抗黑色素瘤DNA質(zhì)粒疫苗，其特征在于所述質(zhì)粒載體為pUCM-T Vector。
6. -種權(quán)利要求1所述的抗黑色素瘤DNA質(zhì)粒疫苗的制備方法，其特征在于包括下述 步驟： 1) 分別根據(jù)GenBank的Trp2、GM-CSF、Fc的功能編碼區(qū)的序列，采用相關(guān)計算機軟件進 行引物設(shè)計，人外周白細胞或淋巴細胞總RNA提取及cDNA合成，以反轉(zhuǎn)錄出的各自第一條 cDNA為模板，用PCR擴增Trp 2、GM-CSF、Fc目的基因片段，切膠回收； 2) 目的基因片段（Trp2、GM-CSF、Fc)分別與T載體（pGEM-T Vector)連接，轉(zhuǎn)化并酶切 鑒定篩選；構(gòu)建的三種目的基因質(zhì)粒及PEGFP-N2質(zhì)粒的擴增、抽提，并分別進行雙酶切，使 得在GM-CSF兩端引入Sal I、BamH I酶切位點，在1'印2兩端引入Bgl II、Sal I酶切位點， 在Fc兩端引入EcoR I、BamH I酶切位點，在EGFP兩端引入BamH I、Bgl II酶切位點； 3) 目的片段（Trp2、GM-CSF、Fc、EGFP)與用 T4 DNA 連接酶 pUCM-T Vector 載體連接； 4) 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化學感受態(tài)細胞中，在合適溫度下的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴增；經(jīng)過篩選 和質(zhì)粒抽提試劑盒抽提獲得DNA質(zhì)粒疫苗PEGFP-Trp 2-GM-CSF-Fc。
7. 如權(quán)利要求6所述的抗黑色素DNA質(zhì)粒疫苗的制備方法，其特征在于：將所述DNA質(zhì) 粒疫苗溶于磷酸鹽緩沖液中，并以陽離子聚合物PEI為免疫佐劑和給藥載體，制備得到含 有陽離子聚合物的DNA質(zhì)粒疫苗。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種DNA抗黑色素瘤質(zhì)粒疫苗，包括質(zhì)粒載體，含黑色素瘤特異腫瘤抗原（Trp2）、細胞因子（GM-CSF）、Fc融合蛋白3種基因表達單位元件，構(gòu)成一種多元、靶向、高效的復合型DNA疫苗，本發(fā)明還公開了該DNA質(zhì)粒疫苗的制備方法，以陽離子聚合物為載體材料構(gòu)建給藥系統(tǒng)，以含有目標抗原編碼序列的DNA質(zhì)粒作為新一代治療性疫苗，該疫苗在體內(nèi)誘導產(chǎn)生特異性針對相關(guān)編碼抗原的免疫反應(yīng)，并有效抑制黑色素瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移，因此本發(fā)明是一種制備簡單、成本低廉且安全可靠、治療黑色素瘤有效的DNA質(zhì)粒疫苗。
【IPC分類】A61K48-00, A61K39-00, A61P35-00
【公開號】CN104721835
【申請?zhí)枴緾N201410687088
【發(fā)明人】胡英, 欽富華
【申請人】浙江醫(yī)藥高等?？茖W校
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2014年11月26日