抗黑色素瘤dna質(zhì)粒疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及DNA疫苗，具體涉及一種抗黑色素瘤DNA質(zhì)粒及其制備方法。 技術(shù)背景
[0002] 惡性黑色素瘤（malignant melanoma，MM)是一類起源于神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞的惡性 腫瘤，多發(fā)于皮膚，是一種最具有侵襲性的皮膚腫瘤，具有發(fā)病年齡早，轉(zhuǎn)移率高等特征。目 前，我國MM的發(fā)病率相對較低，但隨著我國工業(yè)的發(fā)展和環(huán)境狀況的惡化，其發(fā)病率的增 長速度已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他惡性腫瘤，近四年間我國惡性黑色素瘤的發(fā)病率升高了 5倍，是腫 瘤發(fā)病率增長最快的一種。由于MM的惡性程度高，發(fā)生比較隱匿，且對目前臨床各種治療 方法極不敏感，尤其是對化療藥具有較高的耐受性。因此，應(yīng)用免疫療法治療惡性黑色素瘤 被認(rèn)為是極具前景的治療策略。
[0003] DNA疫苗是在基因治療和轉(zhuǎn)基因技術(shù)基礎(chǔ)上產(chǎn)生的第三代疫苗，是疫苗的一次革 命，在預(yù)防和治療病毒、細(xì)菌等傳染病和腫瘤等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，DNA疫苗進(jìn)入體 內(nèi)后主要依靠樹突狀細(xì)胞（DCs)的遞呈，產(chǎn)生免疫應(yīng)答。不成熟的DCs會導(dǎo)致腫瘤的特異 性耐受和免疫逃逸，而成熟的DCs可產(chǎn)生免疫反應(yīng)，也就是說處于不同成熟階段的DCs決定 了機(jī)體發(fā)生免疫反應(yīng)的類型?？梢?，改變DC的表型和功能將是機(jī)體對腫瘤抗原產(chǎn)生免疫應(yīng) 答的前提。
[0004] 作為腫瘤免疫治療的DNA疫苗是將編碼某種腫瘤特異性抗原蛋白的外源基因 (DNA或RNA)直接導(dǎo)入動物體細(xì)胞內(nèi)，并通過宿主細(xì)胞的表達(dá)、合成抗原蛋白，進(jìn)而活化能 特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的T細(xì)胞，以達(dá)到預(yù)防和治療腫瘤的目的。樹突狀細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)抗原 呈遞功能最強(qiáng)、唯一能在體內(nèi)激活初始型T細(xì)胞的抗原呈遞細(xì)胞，同時(shí)可以通過MHC I和 MHC II類分子途徑呈遞抗原，并提供充分的共刺激信號，在T細(xì)胞抗腫瘤免疫應(yīng)答的啟動、 調(diào)控過程中起著關(guān)鍵作用。而細(xì)胞因子能刺激DCs的成熟和遞呈，特別是GM-CSF (粒細(xì) 胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子）是一種強(qiáng)烈刺激巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞的增 殖、分化、活化、成熟和趨化的細(xì)胞因子。但現(xiàn)有的DNA疫苗的抗原性不強(qiáng)，并不能有效防治 黑色素瘤，為此需要尋找一種有效的DNA疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有DNA疫苗的抗原性不強(qiáng)，并提供一種制備簡單、 成本低廉且安全可靠有效防治黑色素瘤的抗黑色素瘤DNA質(zhì)粒疫苗。
[0006] 本發(fā)明還相應(yīng)地提供一種抗黑色素瘤DNA質(zhì)粒疫苗的制備方法。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種抗黑色素瘤DNA質(zhì)粒疫苗， 包括質(zhì)粒載體，其特征在于所述質(zhì)粒載體中除了黑色素瘤特異腫瘤抗原（Trp2)目的基因， 增加了強(qiáng)烈刺激巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞的增殖、分化、活化、成熟和趨化的 細(xì)胞因子（GM-CSF)以及Fc融合蛋白2種基因表達(dá)單位元件和報(bào)告基因的重組質(zhì)粒的真核 表達(dá)載體。
[0008] 所述抗黑色素瘤DNA質(zhì)粒疫苗含有TrpJi應(yīng)的全部基因序列。
[0009] 所述質(zhì)粒載體中含有GM-CSF對應(yīng)的全部基因序列。
[0010] 所述質(zhì)粒載體中含有Fc融合蛋白對應(yīng)的全部基因序列。
[0011] 所述質(zhì)粒載體pUCM-T，也可用其他的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3. 0、pcDNA3. 1等。
[0012] 還提供一種制備上述抗黑色素瘤DNA質(zhì)粒疫苗的制備方法，其特征在于包括下述 步驟： 1) 分別根據(jù)GenBank的Trp2、GM-CSF、Fc的功能編碼區(qū)的序列，采用相關(guān)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn) 行引物設(shè)計(jì)，人外周白細(xì)胞或淋巴細(xì)胞總RNA提取及cDNA合成，以反轉(zhuǎn)錄出的各自第一條 cDNA為模板，用PCR擴(kuò)增Trp2、GM-CSF、Fc目的基因片段，切膠回收； 2) 目的基因片段（Trp2、GM-CSF、Fc)分別與T載體（pGEM-T Vector)連接，轉(zhuǎn)化并酶切 鑒定篩選；構(gòu)建的三種目的基因質(zhì)粒及PEGFP-N2質(zhì)粒的擴(kuò)增、抽提，并分別進(jìn)行雙酶切，使 得在GM-CSF兩端引入Sal I、BamH I酶切位點(diǎn)，在1'印2兩端引入Bgl II、Sal I酶切位點(diǎn)， 在Fc兩端引入EcoR I、BamH I酶切位點(diǎn)，在EGFP兩端引入BamH I、Bgl II酶切位點(diǎn)； 3) 目的片段（!'印2、61^5?、？。36??)與用了4 0嫩連接酶？此1-1'￥6(^〇1'載體連接； 4) 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，在合適溫度下的培養(yǎng)基中培養(yǎng)擴(kuò)增；經(jīng)過篩選 和質(zhì)粒抽提試劑盒抽提獲得DNA質(zhì)粒疫苗PEGFP-Trp 2-GM-CSF-Fc。
[0013] 上述抗黑色素 DNA質(zhì)粒疫苗的制備方法，將上述DNA質(zhì)粒疫苗溶于純水中，并以陽 離子聚合物PEI (MW 25 KDa)為免疫佐劑和給藥載體，制備得到含有陽離子聚合物的DNA 質(zhì)粒疫苗。
[0014] 本發(fā)明將編碼細(xì)胞因子、靶向膜表面Fc受體、腫瘤特異性抗原蛋白的基因構(gòu)建在 同一質(zhì)粒中以增強(qiáng)疫苗的免疫誘導(dǎo)作用。本部分以構(gòu)建黑色素瘤特異腫瘤抗原（Trp 2)、細(xì) 胞因子（GM-CSF)、Fc融合蛋白3種基因表達(dá)單位元件，以構(gòu)成一種多元、祀向、高效的復(fù)合 型DNA疫苗。利用DCs膜表面的Fc受體能改變DCs的表型和功能，通過激活或抑制DC上 Fc受體，決定DC產(chǎn)生免疫反應(yīng)或免疫耐受，將表達(dá)Fc融合蛋白的基因重組于治療性DNA疫 苗中可使其進(jìn)入體內(nèi)后實(shí)現(xiàn)DCs靶向。
[0015] 本發(fā)明選擇聚乙烯亞胺（PEI)作為載體材料，通過靜電吸附制備免疫納米粒，該載 體材料存在以下2個(gè)優(yōu)點(diǎn)：① PEI分子富含氨基，在生理pH條件下僅部分氨基質(zhì)子化，富含 陽離子，有較強(qiáng)的結(jié)合DNA和粘附細(xì)胞的能力；②PEI具有較強(qiáng)壓縮DNA的作用，其轉(zhuǎn)染效 率很高，在胞內(nèi)體、溶酶體酸性囊泡中有"質(zhì)子海綿"的作用，因此能使胞內(nèi)體裂解，溶酶體 腫脹，破裂以避免對DNA的降解。
[0016] 本發(fā)明將PEI/pEGFP-Trp2-GM-CSF-Fc通過微針或局部注射對荷黑色素瘤小鼠給 藥，能大量刺激產(chǎn)生IL-12和IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌表達(dá)，延長荷瘤小鼠的生存周期，明 顯抑制腫瘤部位細(xì)胞的炎癥，結(jié)果表明對黑色素瘤有很好的治療效果。
【附圖說明】
[0017] 圖I. pEGFP-N2質(zhì)粒載體構(gòu)建圖。
[0018] 圖2. pEGFP-N2載體質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果。
[0019] 圖3. PCR擴(kuò)增后Trp2目的基因片段的瓊脂糖電泳圖。
[0020] 圖4. PCR擴(kuò)增后GM-CSF目的基因片段的瓊脂糖電泳圖。
[0021] 圖5. PCR擴(kuò)增后Fe目的基因片段的瓊脂糖電泳圖。
[0022] 圖6. EGFP-Trp2-GM-CSF-Fc重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果。
[0023] 圖7. PEI25k/DNA體外對B16細(xì)胞的毒性結(jié)果。
[0024] 圖8. PEI25k/DNA對荷瘤小鼠抗腫瘤效果。
[0025] 圖9. PEI25k/DNA對荷瘤小鼠生存率情況。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0027] 抗黑色素瘤DNA質(zhì)粒的構(gòu)建與純化：1)目的基因獲得：采用Primer Premier 6. 0和Beacon designer軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，分離人外周白細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄 合成cDNA，以上反轉(zhuǎn)錄出的各自第一條cDNA為模板，用Platinum PCR Supermix High Fidelity (Invitrogen)擴(kuò)增Trp2、GM-CSF、Fc目的基因片段，切膠回收?；厥盏玫降哪康?基因片段分別連接到pGEM-T Vector，感受態(tài)DH5 α轉(zhuǎn)化，擴(kuò)增，抽提并鑒別。三種目的基 因質(zhì)粒以及PEGFP-N2質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，使得在GM-CSF兩端引入Sal I、BamH I酶切 位點(diǎn)，并在1'印2兩端引入Bgl II、Sal I酶切位點(diǎn)，在Fc兩端引入EcoR I、BamH I酶切位 點(diǎn)，在EGFP兩端引入BamH I、Bgl II酶切位點(diǎn)。結(jié)果如圖2、3、4、5所示。2)目的基因片 段（Trp2、GM-CSF、Fc)用T4DNA連接酶分別與pCUM-T Vector連接、轉(zhuǎn)化，將連接產(chǎn)物涂布到 含卡那霉素抗性固體培養(yǎng)基平皿轉(zhuǎn)化，挑取若干單克隆菌落，接種到含卡那霉素抗性液體 培養(yǎng)基中，搖床中37°C 300 rpm振蕩培養(yǎng)過夜。將重組質(zhì)粒酶切鑒定，結(jié)果如圖5所示， 測序鑒定為： KQkTCTATGGAACGAAGGCGTTTGTGGGGTTCCA TTCAGAGCCGA TACA TCAGCA TGAGTGTGTGGACAAGCC CACGGAGACTTGTGGAGCTGGCAGGGCAGAGCCTGCTGAAGGATGAGGCCCTGGCCATTGCCGCCCTGGAGTTGCTG CCCAGGGAGCTCTTCCCGCCACTCTTCATGGCAGCCTTTGACGGGAGACACAGCCAGACCCTGAAGGCAATGGTGCA GGCCTGGCCCTTCACCTGCCTCCCTCTGGGAGTGCTGATGAAGGGACAACATCTTCACCTGGAGACCTTCAAAGCTG TGCTTGA TGGACTTGA TGTGCTCCTTGCCCAGGAGGTTCGCCCCAGGAGGTGGAAACTTCAAGTGCTGGA TTTACGG AAGAACTCTCA TCAGGACTTCTGGACTGTA TGGTCTGGAAACAGGGCCAGTCTGTACTCA TTTCCAGAGCCAGAAGC AGCTCAGCCCA TGACAAAGAAGCGAAAAGTAGA TGGTTTGAGCACAGAGGCAGAGCAGCCCTTCA TTCCAGTAGAGG TGCTCGTAGACCTGTTCCTCAAGGAAGGTGCCTGTGA TGAA TTGTTCTCCTACCTCA TTGAGAAAGTGAAGCGAAAG AAAAA TGTACTACGCCTGTGCTGTAAGAAGCTGAAGA TTTTTGCAA TGCCCA TGCAGGA TA TCAAGA TGA TCCTGAA AA TGGTGCAGCTGGACTCTA TTGAAGA TTTGGAAGTGACTTGTACCTGGAAGCTACCCACCTTGGCGAAA TTTTCTC CTTACCTGGGCCAGA TGA TTAA TCTGCGTAGACTCCTCCTCTCCCACA TCCA TGCA TCTTCCTACA TTTCCCCGGAG AAGGAAGAGCAGTA TA TCGCCCAGTTCACCTCTCAGTTCCTCAGTCTGCAGTGCCTGCAGGCTCTCTA TGTGGACTC TTTA TTTTTCCTTAGAGGCCGCCTGGA TCAGTTGCTCAGGCACGTGA TGAACCCCTTGGAAACCCTCTCAA TAACTA ACTGCCGGCTTTCGGAAGGGGA TGTGA TGCA TCTGTCCCAGAGTCCCAGCGTCAGTCAGCTAAGTGTCCTGAGTCTA AGTG