一種自噬靶向性核酸疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種自噬靶向性核酸疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核分枝桿菌（MTB)感染仍是引起高發(fā)病率和死亡率的主要原因，2010年全球新 發(fā)結(jié)核病例880萬，引起110萬人死亡?？ń槊纾˙CG)作為目前唯一使用的抗結(jié)核疫苗，其 免疫保護(hù)力不穩(wěn)定，在不同研究中其保護(hù)力在0-85%間不等。在過去的幾十年里根據(jù)結(jié)核 分枝桿菌抗原的免疫顯性及其在宿主細(xì)胞中的保護(hù)性免疫發(fā)明了許多類型的新疫苗。
[0003] LpqH，分子量為19kDa，是一種存在于結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁相關(guān)脂蛋白。最初 LpqH被認(rèn)為是結(jié)核分枝桿菌的主要抗原，除此之外，它還具有更為獨(dú)特的性質(zhì)，不但能在結(jié) 核分枝桿菌感染的人或動(dòng)物中激發(fā)強(qiáng)烈的適應(yīng)性免疫，還能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌大量IL-12。 此外，基于其脂蛋白的特性，LpqH是介導(dǎo)抗結(jié)核的固有免疫反應(yīng)以及主要組織相容性復(fù)合 物I(MHC-I)抗原提呈的分子之一。最近發(fā)現(xiàn)脂蛋白在人類單核細(xì)胞中具有激活自噬的功 能。
[0004] 自噬，即大自噬，是真核細(xì)胞中與分解代謝相關(guān)的途徑。最近，自噬被認(rèn)為在防御 結(jié)核分枝桿菌等胞內(nèi)病原體的固有免疫和適應(yīng)性免疫中起重要作用。通過該途徑，增加的 抗原被轉(zhuǎn)運(yùn)到自噬體或自噬泡，并被降解為抗原肽，促進(jìn)保護(hù)性免疫。通過藥物手段或免疫 學(xué)方法誘導(dǎo)自噬能夠清除巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌，為設(shè)計(jì)通過激活自噬以提高保護(hù)效 力的疫苗提供了可能。有趣的是，在小鼠模型中通過阻斷HiTOR(哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白） 誘導(dǎo)自噬能夠增強(qiáng)Ag85B DNA疫苗的效果。
[0005] LC3是自噬小體膜標(biāo)記，通常散布于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)。胞質(zhì)形式的LC3 (LC3-I)與磷脂 酰乙醇胺共軛形成LC3-II，在受到饑餓以及胞內(nèi)病原體刺激時(shí)被聚集到自噬小體膜上，參 與自噬體形成。與溶酶體融合后，含LC3-II的自噬體被降解為肽鏈，這在將胞質(zhì)抗原肽載 至MHC-II中起重要作用。因此，我們測(cè)試了 MTB抗原LpqH與LC3融合后是否能靶向至自 噬體，并增強(qiáng)候選DNA疫苗的免疫原性。
[0006] 我們發(fā)現(xiàn)，在體外通過基因工程使LpqH與LC3融合能提高LC3-II的表達(dá)水平并 定位于自噬體上。此外，LC3_LpqH自噬靶向性DNA疫苗在小鼠模型中通過Thl型免疫增強(qiáng) 抗結(jié)核的保護(hù)效力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在此處鍵入技術(shù)領(lǐng)域描述段落。本發(fā)明的目的是提供一種新型自噬靶向性核酸疫 苗，以及制備方法和應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明構(gòu)建了 LpqH DNA與編碼微管相關(guān)蛋白輕鏈-3 0X3)基因相融合的自噬靶 向性疫苗，該疫苗能夠?qū)⒖乖\(yùn)送至自噬體并增強(qiáng)抗結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)效應(yīng)。
[0009] 本發(fā)明以LC3為基礎(chǔ)構(gòu)建pCMV-LC3_LpqH質(zhì)粒，該質(zhì)粒可以在體內(nèi)外高效表達(dá) LC3_LpqH融合蛋白。與LpqH / Ag85B相比，LC3_LpqH / Ag85B免疫的感染毒株結(jié)核分枝 桿菌的小鼠在肺和脾臟中結(jié)核桿菌載量減低，同時(shí)伴隨IFN- γ、IL-2、IgG2a的升高。
[0010] 本發(fā)明提供了一種新型核酸疫苗，其特征在于能夠靶向至自噬體，并且能夠增強(qiáng) Thl型免疫和疫苗的免疫保護(hù)作用。
[0011] 本發(fā)明中LC3不僅可以構(gòu)建真核表達(dá)載體，還能用于構(gòu)建原核表達(dá)載體。
[0012] 本發(fā)明提供的自噬靶向性核酸疫苗不僅可以用于小鼠，還可以用于人類。
[0013] 本發(fā)明提供的自噬靶向性核酸疫苗涉及一種脂蛋白LpqH，除LpqH外其他結(jié)核分 枝桿菌抗原作為DNA疫苗時(shí)，也具有顯著的免疫保護(hù)作用。
[0014] 本發(fā)明還提供了該DNA疫苗的構(gòu)建方法，包括以下步驟：1.對(duì)逆轉(zhuǎn)錄獲得的 Balb / c小鼠 cDNA進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳切膠回收目的片段，獲得含LC3分 子編碼序列的DNA片段。2.亞克隆入pCMV-LpqH質(zhì)粒，篩選重組質(zhì)粒并酶切鑒定，獲得 pCMV-LC3_LpqH 質(zhì)粒。
[0015] 所采用的技術(shù)方案的具體內(nèi)容： 1.對(duì)H37Rv基因組DNA進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳切膠回收目的片段，獲得含 LpqH分子編碼序列的DNA片段。
[0016] 2.克隆入pCMV-HA質(zhì)粒，獲得pCMV-LpqH，轉(zhuǎn)化篩選重組質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定獲得 pCMV-LpqH重組質(zhì)粒。
[0017] 3.對(duì)逆轉(zhuǎn)錄獲得的Balb / c小鼠 cDNA進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳切膠回 收目的片段，獲得含LC3分子編碼序列的DNA片段。
[0018] 4.亞克隆入pCMV-LpqH質(zhì)粒，篩選重組質(zhì)粒并酶切鑒定，獲得pCMV-LC3_LpqH質(zhì) 粒。
[0019] 本發(fā)明經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，具有以下屬性： (1) LpqH能誘導(dǎo)LC3-II數(shù)量增加； (2) LpqH通過LC3定位到自噬體； (3) LC3_LpqH融合蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并且表達(dá)水平與pCMV-LC3_LpqH質(zhì)粒呈緊 密的劑量依賴性； (4) pCMV-LC3_LpqH自噬靶向性核酸疫苗能增強(qiáng)Thl型免疫。
【附圖說明】
[0020] 圖1是LpqH誘導(dǎo)LC3-II數(shù)量增加圖。
[0021] 圖 2 是 HA-LC3_LpqH 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 Raw264. 7 細(xì)胞。
[0022] 圖3是LpqH通過LC3定位自噬體圖。
[0023] 圖4是特異性IgG抗體及細(xì)胞因子分析圖。
[0024] 圖5是細(xì)菌載量分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說明，本發(fā)明的實(shí)例僅用于說明本發(fā)明 而不限制于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0026] 實(shí)施例1 :pCMV_LpqH質(zhì)粒的構(gòu)建 為構(gòu)建pCMV-LpqH質(zhì)粒，利用DNAClub和Premier Primer5設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增引物（見表 I)，對(duì)H37RV基因組DNA進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳切膠回收目的片段，獲得含LpqH 分子編碼序列的DNA片段。克隆入pCMV-HA質(zhì)粒，獲得pCMV-LpqH，轉(zhuǎn)化篩選重組質(zhì)粒，經(jīng)酶 切鑒定獲得PCMV-LpqH重組質(zhì)粒。純化后重懸，并于_20°C保存。
[0027] 表1、LpqH序列及上下游引物
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種新型自噬靶向性核酸疫苗，能夠靶向至自噬體，并且能夠增強(qiáng)Thl型免疫和抗 結(jié)核分枝桿菌的免疫保護(hù)作用。
2. -種如權(quán)利要求1所述的新型自噬靶向性核酸疫苗的制備方法，其特征在于該方法 包括以下步驟： A) 設(shè)計(jì)PCR引物如下，采用H37Rv基因組DNA進(jìn)行PCR，獲得含LpqH分子編碼序列的 DNA片段，克隆入pCMV-HA質(zhì)粒，獲得pCMV-LpqH ; B) 設(shè)計(jì)PCR引物如下，采用逆轉(zhuǎn)錄獲得的Balb/c小鼠cDNA進(jìn)行PCR，得到 編碼LC3基因的DNA序列上游引物tatgaattcgggtgaagcgtggactgac,下游引物 ggtagatctggaacaggtcacctcgatttc ； C) 將LC3基因的DNA序列克隆入PCMV-LpqH質(zhì)粒，獲得pCMV-LC3-LpqH質(zhì)粒。
3. -種以LC3為基礎(chǔ)構(gòu)建pCMV-LC3_LpqH質(zhì)粒，其特征在于?？梢栽隗w內(nèi)外高效表達(dá) LC3_LpqH融合蛋白。
4. 如權(quán)利要求1所述的新型自噬靶向性核酸疫苗，不僅可以用于小鼠，還可以用于人 類。
5. 如權(quán)利要求3所述的LC3不僅可以構(gòu)建真核表達(dá)載體，還可以用于構(gòu)建原核表達(dá)載 體。
6. 如權(quán)利要求1所述的新型自噬靶向性核酸疫苗，不僅涉及脂蛋白LpqH，除LpqH外其 他結(jié)核分枝桿菌抗原作為DNA疫苗時(shí)也具有顯著的免疫保護(hù)作用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種自噬靶向性核酸疫苗及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明構(gòu)建了LpqH DNA與編碼微管相關(guān)蛋白輕鏈-3（LC3）基因相融合的自噬靶向性疫苗，該疫苗能夠?qū)⒖乖\(yùn)送至自噬體，并且能夠增強(qiáng)Th1型免疫和疫苗的免疫保護(hù)作用。本發(fā)明以LC3為基礎(chǔ)構(gòu)建pCMV-LC3-LpqH質(zhì)粒，該質(zhì)粒可以在體內(nèi)外高效表達(dá)LC3-LpqH融合蛋白。本發(fā)明中LC3不僅可以構(gòu)建真核表達(dá)載體，還能用于構(gòu)建原核表達(dá)載體。本發(fā)明提供的自噬靶向性核酸疫苗不僅可以用于小鼠，還可以用于人類。本發(fā)明提供的自噬靶向性核酸疫苗涉及一種脂蛋白LpqH，除LpqH外其他結(jié)核分枝桿菌抗原作為DNA疫苗時(shí)，也具有顯著的免疫保護(hù)作用。
【IPC分類】C12N15-66, C12N15-85, A61K39-04, A61K48-00, A61P31-06
【公開號(hào)】CN104721834
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310710775
【發(fā)明人】張榮波, 胡東, 吳靜, 杜昭弘
【申請(qǐng)人】安徽理工大學(xué)
【公開日】2015年6月24日
【申請(qǐng)日】2013年12月20日