一種從茯苓皮中高效提取三萜類(lèi)活性成分的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥及保健食品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從茯苓皮中高效提取三萜類(lèi) 活性成分的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 茯苓為多孔菌科真菌茯苓（Poria cocos (Schw. ) Wolf)的干燥菌核，是常用的藥 食兩用中藥。茯苓性平，味甘、淡，歸心、肺、脾、腎經(jīng)，具有利水滲濕、健脾和胃、寧心安神之 功效，其主要活性成分為多糖、三萜類(lèi)化合物，具有抗腫瘤、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、保肝等多種藥 理活性。
[0003] 我國(guó)茯苓資源豐富，目前對(duì)茯苓有效成分包括三萜類(lèi)提取工藝已有一定研究。茯 苓菌核經(jīng)過(guò)發(fā)汗處理后削下的外皮為"茯苓皮"，內(nèi)部白色部分切成茯苓塊或茯苓片。目前 臨床藥用茯苓以茯苓塊或茯苓片為主。中醫(yī)認(rèn)為，茯苓塊或茯苓片歸心、肺、脾、腎經(jīng)，具有 利水滲濕，健脾，寧心的功效；而茯苓皮歸肺、脾、腎經(jīng)，僅具有利水消腫的功效。由于茯苓皮 外表面棕褐色至黑褐色，有疣狀突起，內(nèi)面淡棕色并常帶有白色或淡紅色的皮下部分；質(zhì)地 較松軟，略具彈性；氣微、味淡，嚼之粘牙；相對(duì)于茯苓塊或茯苓片，茯苓皮賣(mài)相差，且較難 提取出其中的活性成分，因此，在實(shí)際生產(chǎn)加工過(guò)程中茯苓皮多被廢棄。
[0004] 已有的茯苓皮有效物質(zhì)提取中都采用溶劑萃取法，此法提取總?cè)祁?lèi)化合物含量 較低，目前未能應(yīng)用于大批量生產(chǎn)，同時(shí)這些方法所選用的化學(xué)溶劑相對(duì)較多，其應(yīng)用受到 一定的限制。因此，開(kāi)發(fā)出一種高效環(huán)保的從茯苓皮提取三萜類(lèi)活性成份的方法具有非常 實(shí)際的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種從茯苓皮中高效提取三萜類(lèi)活性成分的方法。
[0006] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種茯苓皮總?cè)频奶崛》椒?，包括下列步驟： 1) 以茯苓皮為原料，粉碎后按照一定比例加入無(wú)水或含水醇液浸泡2~10小時(shí)，浸泡 后回流提取1~3次，每次提取2~3小時(shí)，過(guò)濾收集提取液； 2) 對(duì)提取液進(jìn)行減壓濃縮，獲取茯苓皮提取物； 3) 用醇液對(duì)茯苓皮提取物進(jìn)行加熱超聲溶解，并將所得溶解液滴加到裝有大孔樹(shù)脂的 柱床中進(jìn)行靜止吸附至少2小時(shí)，用水和不同濃度的醇液對(duì)靜止吸附樣品后的大孔樹(shù)脂柱 進(jìn)行梯度洗脫分離； 4) 收集洗脫液，濃縮獲得茯苓皮總?cè)啤?br>[0007] 進(jìn)一步的，步驟1)中所用醇液為70%v/v~100%v/v的甲醇或70%v/v~95%v/v 的乙醇。
[0008] 進(jìn)一步的，步驟1)中提取時(shí)，茯苓皮和醇液的重量比為1: (3~10)。
[0009] 進(jìn)一步的，步驟2)中減壓濃縮時(shí)，醇提取液濃縮溫度為60~80°C。
[0010] 進(jìn)一步的，步驟3)用濃度70%~100%v/v甲醇或70%~95%v/v乙醇溶液對(duì)茯苓 皮提取物進(jìn)行加熱超聲溶解。
[0011] 進(jìn)一步的，步驟3)中大孔樹(shù)脂可以是極性、中等極性、弱極性或非極性大孔樹(shù)脂。
[0012] 進(jìn)一步的，步驟3)用水和濃度分別為50%v/v、70%v/v、100%v/v的甲醇或50%v/v、 70% v/v、95%v/v的乙醇溶液對(duì)靜止吸附樣品后的大孔樹(shù)脂柱進(jìn)行梯度洗脫分離，且每一濃 度洗脫4個(gè)保留體積。
[0013] 進(jìn)一步的，步驟4)收集100%v/v的甲醇或95%v/v的乙醇洗脫液。
[0014] 一種茯苓皮總?cè)频奶崛》椒ǎㄏ铝胁襟E： 1) 以茯苓皮為原料，粉碎后按照茯苓皮和醇液的重量比為1:(5~6)的比例加入100% 甲醇或95%v/v的乙醇浸泡2~5小時(shí)，浸泡后回流提取1~3次，每次提取2~3小時(shí)，過(guò) 濾收集提取液； 2) 對(duì)提取液進(jìn)行減壓濃縮，獲取茯苓皮提取物； 3) 在60~80°C的溫度范圍內(nèi)，用100%v/v的甲醇或95%v/v的乙醇對(duì)茯苓皮提取物進(jìn) 行加熱超聲溶解，并將所得溶解液以5 mL/min的速度滴加到裝有D-101或AB-8大孔樹(shù)脂的 柱床中進(jìn)行靜止吸附至少2小時(shí)，用水和50%v/v、70%v/v、100%v/v的甲醇或50%v/v、70%v/ v、95%v/v的乙醇溶液對(duì)靜止吸附樣品后的大孔樹(shù)脂柱進(jìn)行梯度洗脫分離，且每一濃度洗脫 4個(gè)保留體積； 4) 收集100%v/v的甲醇或95%v/v的乙醇洗脫液，濃縮獲得茯苓皮總?cè)啤?br>[0015] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明以茯苓皮為原料，采用無(wú)水或含水醇為提取溶劑，提取的浸膏經(jīng)大孔樹(shù)脂純化， 得到的茯苓皮總?cè)铺崛∥锏氖章士蛇_(dá)5. 6%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于以茯苓塊為原料提取出來(lái)的 茯苓總?cè)剖章?. 32%。
[0016] 從成本方面考慮，目前臨床用藥以茯苓塊或茯苓片為主，無(wú)人收購(gòu)茯苓皮，即使有 少量收購(gòu)，其價(jià)格也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于白茯苓，其成本基本可以忽略不計(jì)；而茯苓皮來(lái)源廣泛，價(jià)格 低廉，不僅可以降低成本，還能變廢為寶，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益及社會(huì)效益。以茯苓塊或茯 苓片為原料則成本較高，以獲得IKg所述茯苓總?cè)铺崛∥餅槔?，所需茯苓塊原料成本為 1077. 5元。由此可見(jiàn)，本發(fā)明方法技術(shù)從茯苓皮中高效提取三萜類(lèi)活性成分，提取成本相對(duì) 低廉，可大規(guī)模生產(chǎn)，變廢為寶。
[0017] 本發(fā)明提取效果好，沒(méi)有或很少化學(xué)溶劑殘留，提取物經(jīng)過(guò)香草醛-冰醋酸-高氯 酸顯色法測(cè)得茯苓皮總?cè)频暮看笥?0%。本發(fā)明方法提取成本相對(duì)低廉，可大規(guī)模生 產(chǎn)，變廢為寶。
[0018] 利用從本發(fā)明的產(chǎn)品中分離純化得到的三萜類(lèi)單體化合物為標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)高效液相 色譜分析，對(duì)本發(fā)明方法制備的茯苓皮總?cè)浦?4種三萜類(lèi)成分進(jìn)行了指認(rèn)和歸屬，其中 茯苓新酸A、3_氫化去氫松苓酸和去氫伊布里酸三個(gè)三萜類(lèi)成分為主要成分，產(chǎn)品總?cè)?含量高，主要活性成分明確。
[0019] 經(jīng)清除DPPH烷自由基，清除超氧陰離子自由基能力測(cè)試表明：本發(fā)明的產(chǎn)品具有 很強(qiáng)的清除DPPH自由基、超氧陰離子的能力，具有抗氧化作用；經(jīng)酒精誘導(dǎo)小鼠急性肝損 傷實(shí)驗(yàn)表明：本發(fā)明的產(chǎn)品具有很強(qiáng)的保肝活性，具有預(yù)防酒精性肝損傷作用；不僅如此， 還具有較強(qiáng)的抗炎、抗過(guò)敏、降糖、降脂作用。可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品及化妝品等領(lǐng) 域。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為本發(fā)明茯苓皮總?cè)浦蟹蛛x得到的三萜類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)； 圖2為本發(fā)明茯苓皮總?cè)频腍PLC圖譜； 其中1是去氫土莫酸、2是去氫伊布里酸乙酸酯、3是去氫伊布里酮酸、4是3-氫化去氫 松苓酮酸、5是3 β -乙酰氧基-羊毛留-7, 9 (11)，24-三烯-21-酸、6是去氫茯苓酸、7是茯 苓酸、8是3-氫化去氫松苓酸、9是去氫伊布里酸、10是茯苓新酸D、11是茯苓新酸Α、12是 茯苓新酸AM、13是3-去氫松苓酸、14是伊布里酸； 圖3為3-氫化去氫松苓酸的HPLC圖譜； 圖4為去氫伊布里酸的HPLC圖譜； 圖5為茯苓新酸A的HPLC圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不局限于此。
[0022] 其中茯苓皮總?cè)苹蜍蜍呷坪繙y(cè)定均采用香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色法。
[0023] 1)溶液配制 5%香草酸-冰醋酸溶液：稱(chēng)取香草醛0. 5 g，用適量冰醋酸溶解并轉(zhuǎn)入容量瓶中，冰醋 酸定容至10 mL，搖勻，當(dāng)日使用； 烏蘇酸對(duì)照品溶液：精密稱(chēng)取烏蘇酸11. I mg，甲醇定容于100 mL容量瓶中，即得 0· 111 mg/mL的烏蘇酸對(duì)照品溶液； 樣品溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取實(shí)施例中所得總?cè)铺崛∥?0.0 mg，用甲醇定容于25 mL容量瓶 中，即得0· 40 mg/mL的樣品溶液。
[0024] 2)測(cè)定含量 使用分光光度法測(cè)定樣品中總?cè)坪浚壕芪跆K酸對(duì)照品溶液〇，〇. 2，0. 4， 0. 6,0. 8,1. 0 mL，60°C恒溫水浴加熱，除去溶劑。分別加入新鮮配制的5%香草醛-冰醋酸 溶液0. 3 mL和I mL高氯酸，搖勻，在60°C恒溫水浴下反應(yīng)20 min后，冰水冷卻，再加入5 mL冰醋酸，搖勻，以空白試劑為參比，在548 nm波長(zhǎng)下測(cè)定體系的吸光度，以烏蘇酸對(duì)照品 的質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，作圖得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，測(cè)得總?cè)频暮俊?br>[0025] 如無(wú)特殊說(shuō)明，以下實(shí)施例中所用的醇液濃度均為體積比濃度。
[0026] 實(shí)施例1 1、制備茯苓皮總?cè)?取干燥的茯苓皮I. 5Kg，粉碎后加入重量比為5倍量的95%乙醇浸泡2小時(shí)，回流提 取，2次，每次提取2小時(shí)，紗布過(guò)濾得到提取液，合并提取液，減壓濃縮得茯苓皮提取物。 將茯苓皮提取物用95%乙醇加熱超聲溶解，以5 mL/min的速度將樣品溶液滴加在已裝好 的D-101大孔樹(shù)脂上，靜止吸附2 h，依次用水、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇進(jìn)行梯度洗脫 分離，每個(gè)比例洗脫4個(gè)保留體積，收集95%乙醇洗脫液濃縮得到茯苓皮總?cè)?3. 58g，計(jì) 算總?cè)铺崛∥锏氖章?總?cè)铺崛∥锏馁|(zhì)量/茯苓皮的質(zhì)量X100% = 83.6g / 1500g X 100% = 5. 6%。
[0027] 2、含量測(cè)定 利用香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色法測(cè)得茯苓皮提取物中總?cè)频暮繛?4. 74% 土 0· 83%。
[0028] 3、抗氧化活性測(cè)試(對(duì)烷自由基DPPH影響試驗(yàn))。
[0029] 1)溶液及樣品配置 DPPH儲(chǔ)備液：稱(chēng)8. 0 mg DPPH，用甲醇溶解定容至100 mL，得200 uM的DPPH儲(chǔ)備液； 樣品：用甲醇溶解成不同濃度。
[0030] 2)實(shí)驗(yàn)過(guò)程 取100 ul DPPH儲(chǔ)備液，加入100 ul樣品溶液，混勻，室溫避光30 min后在546 nm測(cè) OD值；其中調(diào)零組以甲醇代替DPPH +藥物；空白組以甲醇代替DPPH;對(duì)照組以甲醇代替藥 物。
[0031] 3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)得IC50 = 0.72 mg/mL，表明本實(shí)施例制備的茯苓皮總?cè)凭哂休^強(qiáng)的清 除烷自由基DPPH ·的活性。
[0032] 4、結(jié)果分析 本實(shí)施例中以茯苓皮為原料提取出來(lái)的茯苓皮總?cè)铺崛∥锸章蕿?. 6%，總?cè)坪?量為64. 74% ± 0.83%，具有較強(qiáng)的清除烷自由基DPPH活性。說(shuō)