透皮美容的組合制劑和試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及透皮美容的組合制劑和試劑盒，采用生物技術(shù)聯(lián)合物理療法美容，具有改善皮膚的亞健康狀態(tài)，能減輕或消除皮膚皺紋、淡化疤痕、延緩或逆轉(zhuǎn)皮膚衰老等作用，屬于醫(yī)學(xué)美容技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]皮膚是維護人體生命和健康的重要組成部分，直接與外界接觸，是機體的第一道屏障，極易受到環(huán)境的影響而導(dǎo)致?lián)p傷。除了年齡帶來的老化因素外，應(yīng)激反應(yīng)，污染，紫外線都是引起皮膚衰老的重要原因。隨著社會人口老齡化和環(huán)境的劣化，人們越來越需要長效，高效的調(diào)節(jié)性和預(yù)防性護膚品。皮膚衰老主要表現(xiàn)在兩個方面，一是膠原蛋白在各種蛋白酶的作用下降解流失，皮膚失去彈性形成皺紋；二是皮膚表面黑色素細胞活化產(chǎn)生色素沉著，逐漸產(chǎn)生黃褐斑，老年斑等各種色斑。為了解決上述問題，人們開發(fā)了無數(shù)美容產(chǎn)品和方法。
[0003]PBMC 為 peripheral blood mononuclear cells 的縮寫，中文為“外周血單個核細胞”，指血循環(huán)中的單個核細胞，包括淋巴細胞和單核細胞。CN103385890A中公開了一種提取分離健康人血中的PBMC，將分離所得的PBMC經(jīng)細胞分裂原植物血凝素(PHA)體外刺激后，體外培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化增殖，制成活細胞制劑用于女性亞健康狀態(tài)、延緩功能減退和抗衰老，從而使女性皮膚亮麗光澤、駐顏煥采。使用時，將所述制劑以注射用生理鹽水重懸，調(diào)整細胞濃度，以皮下多點注射的接種方式進行治療，每次間隔3-4周，3次為一療程，療效可維持0.5-1年左右。該細胞制劑皮下注射后，可使機體T淋巴細胞的數(shù)量、活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)水平、活化增殖能力顯著提高，促進正向免疫效應(yīng)性及負向調(diào)節(jié)性T淋巴細胞平衡、正負向協(xié)同刺激因子表達平衡、Thl/Th2細胞因子表達平衡，從而刺激機體的免疫細胞、調(diào)節(jié)整體免疫功能。然而PBMC在體外培養(yǎng)的過程中，存在需要保持其中干細胞的體外擴增數(shù)量和分化狀態(tài)，并且需要保證一定的擴增速度，在CN103385890A中是采用添加PHA來進行刺激，但是PHA很昂貴，大大提高了 PBMC制劑的成本，影響了該技術(shù)的商業(yè)化推廣，并且在制劑中所增殖的活細胞中仍然可能殘留著少許PHA，在體內(nèi)注射時，機體仍會對此產(chǎn)生不必要的免疫應(yīng)答，帶來副作用。而且其所使用的細胞不一定是自體細胞，在使用過程中如果異體給藥，仍然存在排異反應(yīng)的風險。并且PBMC即使加入細胞生長因子等誘導(dǎo)，生長和增殖仍然十分緩慢，要得到足夠的可注射細胞制劑，一般需要7-10天以上，而較長時間的培養(yǎng)和傳代，有可能導(dǎo)致細胞的退化和過度分化，以致影響美容的效果。
[0004]PRP為Platelet rich plasma的縮寫，中文為“高濃度血小板血漿”，PRP具有迅速止血、止痛、加速傷口愈合的作用。PRP美容用自身血液制作出富含高濃度血小板和自身生長因子的血漿，其中含有纖維連接蛋白和纖粘蛋白，通過重新注射到真皮組織中，可以提高皮膚內(nèi)膠原蛋白和彈力纖維的含量，能促進細胞的黏連生長。而細胞的黏連是機體結(jié)構(gòu)得以維持、細胞生長完成的必要條件。還可以利于上皮細胞的迀移和增殖來修復(fù)傷口。PRP能夠促進細胞的更替，從而從根本上解決了因細胞衰弱，老化，缺水等原因造成的皺紋和疤痕，也解決了皮膚的毛孔粗大以及肌膚組織缺失的問題。并且該方法利用自身血液提煉富含高濃度生長因子的血清進行治療，不會引起排異反應(yīng)；提取液中還富含大量白細胞，極大程度降低感染機率。樊明山(富血小板血漿在皮膚抗衰老中作用機制的研宄進展，中國美容醫(yī)學(xué)，2012年，21 (10)上，1874-1876)對該技術(shù)作了詳細的綜述。
[0005]但是上述兩種生物技術(shù)美容方法在治療過程中，為了達到較好的效果，由于需要采用面部多部位局部注射，給藥過程疼痛感較強，并且對于注射的操作者的技術(shù)要求較高，注射過程中還容易引起局部紅腫、出血、瘀血、過敏、水泡等應(yīng)激性反應(yīng)，使得術(shù)后恢復(fù)期較長，處理不好還有可能會引起纖維組織過度增生，影響美容效果。
[0006]通常情況下，由于皮膚角質(zhì)層的阻礙作用，蛋白質(zhì)藥物、多肽類藥物或基因藥物不易透過皮膚進入體內(nèi)?，F(xiàn)有技術(shù)中采用微針給藥技術(shù)，在皮膚的角質(zhì)層上形成微小的藥物傳輸通路，令細胞生長因子及多種營養(yǎng)元素經(jīng)細小管道直接滲入皮膚深層，吸收率大大提高，可使蛋白質(zhì)藥物、多肽類藥物或基因藥物的透皮傳輸更為容易，因此結(jié)合微針和大分子藥物組合制劑組合以提高大分子藥物組合制劑的透皮率，從而使藥物有效進入體內(nèi)而實現(xiàn)更為優(yōu)異的藥效。例如，洪霞等(微針結(jié)合表皮生長因子在面部皮膚年輕化治療中的應(yīng)用，中國美容醫(yī)學(xué)，2012年，21 (8)上，1351-1352)對面部皮膚老化患者在皮膚表面使用微針(長0.25?0.5mm)后，涂抹谷胱甘肽和氨甲環(huán)酸用于治療黃褐斑，再結(jié)合表皮生長因子(EGF)面膜敷面20?30min，24h內(nèi)面部不沾水、不涂抹護膚品，每次治療后采用EGF原液，5次為一療程，治療后90%以上患者皮膚改善顯著。
[0007]在美容實踐中，雖然有PRP結(jié)合微針使用的療法，但是由于單純靠微針的刺激和導(dǎo)入作用，PRP所能起到的修復(fù)作用有限，實際應(yīng)用中還是必須采用結(jié)合PRP面部多部位局部注射，才能達到較為理想的效果，并且為加強效果所使用微針也較長，因此患者在治療過程中仍然不能避免疼痛、出血、感染的風險。而PBMC在用于皮膚的修復(fù)和美容時，所培養(yǎng)的細胞為活細胞，直徑大約為14-20 μ M，遠小于一般微針的直徑大小，也小于納米微針的直徑大小，但是由于培養(yǎng)增殖后的單個核細胞的迀移性較差，僅依靠微針對皮膚表面造成的創(chuàng)口，PBMC直接在皮膚表面使用，活細胞透過角質(zhì)層的數(shù)量十分有限，很難起到理想的修復(fù)和美容效果。因此，如何能提高皮膚修復(fù)和美容效果的前提下，盡可能地采用讓患者在美容過程中減少痛苦，仍是有待解決的問題。
[0008]技術(shù)內(nèi)容
[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種透皮美容的組合制劑和試劑盒，及該組合制劑的制備方法和使用方法。該透皮美容的組合制劑具有改善皮膚的亞健康狀態(tài)，能減輕或消除皮膚皺紋、淡化疤痕、延緩或逆轉(zhuǎn)皮膚衰老等作用。
[0010]本發(fā)明提供的透皮美容的組合制劑，包括基質(zhì)細胞懸液和半凝膠活性生物面膜，基質(zhì)細胞懸液和半凝膠活性生物面膜中均含有從外周血中分離得到PBMC和PRP。
[0011]本發(fā)明還提供了該制劑的制備方法，包括下述步驟:
[0012]I)采集人體外周血，
[0013]2)從外周血中分離得到PBMC和PRP，
[0014]3)通過體外增殖將PBMC制備得到活細胞，加入部分PRP，制備得到基質(zhì)細胞懸液，
[0015]4)取剩余的PRR，與凝膠基質(zhì)、部分基質(zhì)細胞懸液、細胞因子混合制備得到半凝膠活性生物面膜。
[0016]其中，步驟I中的外周血可以用自體血液，步驟4中的細胞因子包括EGF、bFGF、VEGF, NGF、SCF中的一種或幾種，并且所述細胞因子可以是市售的產(chǎn)品或為自制:凝膠基質(zhì)包括瓊脂、葡聚糖、卡波姆、聚丙烯酸樹脂、聚乙烯醇、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、黃原膠中的一種或幾種。步驟3的PBMC增殖所用的培養(yǎng)液和步驟4的半凝膠活性生物面膜中加入一種中藥提取物，添加比例為培養(yǎng)液或半凝膠活性生物面膜:中藥組合物=4: I (v/v);該組合物是用重量配比為黃芪:桃仁:麥冬=5: 2: 3，第一次加入6倍量(w/w)的水煎煮，第一次加入3倍量的水煎煮，合并兩次提取液，過濾，殺菌，濃縮成2倍量(w/w)，即得。
[0017]本發(fā)明還提供了一種透皮美容的試劑盒，包括
[0018]a)本發(fā)明的基質(zhì)細胞懸液，
[0019]b)本發(fā)明的半凝膠活性生物面膜，
[0020]c)膠原面膜，
[0021]d)微針。
[0022]其中實施本發(fā)明的微針可以是滾輪微針、納米微針或MEMS微針陣列，試劑盒中的膠原面膜中含有大量膠原蛋白或水解膠原蛋白。
[0023]本發(fā)明還提